青磚茶渥堆發(fā)酵中嗜熱細(xì)菌篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究

朱雯，吳雙，王文鳳，許文璨，陳文君，黃友誼

青磚茶渥堆發(fā)酵中嗜熱細(xì)菌篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究

朱雯，吳雙，王文鳳，許文璨，陳文君，黃友誼*

農(nóng)業(yè)部華中都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070

渥堆發(fā)酵是青磚茶獨特品質(zhì)形成的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。對來自青磚茶渥堆發(fā)酵樣品中的細(xì)菌進(jìn)行高溫篩選和鑒定。結(jié)果表明，通過篩選得到20株能在高溫條件下良好生長的細(xì)菌，其中15株菌株能夠在含茶湯的培養(yǎng)基中生長。3株菌株的最適生長溫度為55℃，為嗜熱細(xì)菌。結(jié)合嗜熱菌株的形態(tài)特征和16?S rDNA基因序列分析，確定1株為枯草芽孢桿菌（），2株為地衣芽孢桿菌（）。經(jīng)嗜熱細(xì)菌發(fā)酵曬青毛茶的產(chǎn)酶試驗可知，嗜熱菌株在發(fā)酵茶葉時能夠產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶和單寧酶，其酶活力分別可達(dá)215.69、259.28、4.85?U。

青磚茶；嗜熱細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；地衣芽孢桿菌；產(chǎn)酶特性

青磚茶是湖北特色黑茶，為后發(fā)酵茶，主產(chǎn)于鄂南、湘北等地區(qū)[1]，是西北高寒高脂飲食地區(qū)人們的生活必需品，具有減肥、降脂、抗氧化等多種保健作用[2-4]。青磚茶以曬青毛茶為原料，經(jīng)過渥堆發(fā)酵、干燥、蒸壓成型、陳化等工序而制成[5-6]。國內(nèi)外研究表明，渥堆發(fā)酵是青磚茶獨特品質(zhì)形成的關(guān)鍵[7-9]。渥堆發(fā)酵是一種以微生物活動為中心的高溫高濕發(fā)酵過程[10]，在濕熱作用條件下，微生物大量繁殖并分泌多種胞外酶，從而引發(fā)茶葉內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生氧化、降解、甲基化、糖基化、聚合等一系列生化反應(yīng)[11]，進(jìn)而形成青磚茶特有的湯色、香氣和滋味品質(zhì)。

近年來，關(guān)于青磚茶渥堆發(fā)酵中微生物的研究已有所報道。張丹丹等[12]對青磚茶渥堆發(fā)酵不同堆層的微生物種類及變化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量最多，放線菌、霉菌其次，酵母最少。Hu等[13]研究青磚茶渥堆發(fā)酵中真菌群落結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化，其中曲霉屬是整個過程中的優(yōu)勢屬，而青霉屬、德巴利酵母屬、嗜熱子囊菌屬和嗜熱絲孢菌屬等在發(fā)酵的不同階段產(chǎn)生。鄭鵬程等[1]采用純培養(yǎng)技術(shù)從青磚茶渥堆發(fā)酵樣品中分離出青霉菌屬、黑曲霉、塔賓曲霉、粉紅黏帚霉、籃狀菌屬5株真菌。

青磚茶在渥堆發(fā)酵過程中，堆溫保持在55～65℃，被認(rèn)為有利于青磚茶品質(zhì)的形成。因此，青磚茶的渥堆發(fā)酵是一種高溫固態(tài)發(fā)酵過程。在此過程中，必然會存在著高溫嗜熱微生物，這些高溫嗜熱微生物對茶葉特有風(fēng)味特征的形成具有重要意義[14]。Xu等[10]在青磚茶渥堆發(fā)酵樣品中分離出、、sp.和等4種主要耐熱微生物。目前，仍缺乏對青磚茶耐熱菌特性的研究，也未見關(guān)于青磚茶渥堆發(fā)酵過程中嗜熱微生物的報道，本研究擬對青磚茶渥堆發(fā)酵中的嗜熱細(xì)菌進(jìn)行高溫篩選和鑒定，并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究，以探明青磚茶渥堆發(fā)酵中嗜熱細(xì)菌的種類與作用，為了解青磚茶渥堆發(fā)酵品質(zhì)的形成提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

赤壁青磚茶菌庫中的菌株，分離自湖北洞莊茶業(yè)有限公司赤壁青磚茶規(guī)模化渥堆發(fā)酵中的在制品中[12]，共分離得到細(xì)菌50株（菌株編號為：F1、F2-4、F4-1、F13、N1、N1-12、N4、N7-2、N9、N92-1、F1-1、F2-5、F5、F14、N1-1、N2、N5-1、N721、N9-1、N922、F2、F3-1、F6、F16、N1-2、N2-1、N6-1、N73、N911、N92-2A、F2-1、F3-2、F11、F17、N1-3、N3、N7、N731、N912、N9-3、F2-2、F3-3、F12、F18、N1-4、N3-1、N7-1、N74、N917、N9-5），保存于本課題組實驗室，菌株保存在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每兩周活化1次。發(fā)酵茶葉原料為曬青毛茶，購自湖北洞莊茶業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

瓊脂購自賽國生物科技有限公司；DNS顯色劑購自廈門海標(biāo)科技有限公司；蛋白胨和牛肉浸膏購自海博生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉、沒食子酸丙酯、檸檬酸、檸檬酸三鈉、冰乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、羅丹寧、氫氧化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、福林酚、磷酸二氫鉀、茚三酮、濃硫酸、蒽酮等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈和甲醇均為色譜純，購自賽默飛世爾科技公司；兒茶素各組分標(biāo)樣、沒食子酸、咖啡堿（純度>99%）均為標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0?g、蛋白胨10.0?g、NaCl 5.0?g、瓊脂20.0?g，用蒸餾水定容至1?000?mL，pH 7.0。液體培養(yǎng)基不含瓊脂。

復(fù)篩培養(yǎng)基（含茶湯）：曬青毛茶與沸騰蒸餾水按1∶50（∶）的比例配比，100℃水浴浸30?min，過濾后得濾液，加入牛肉膏5.0?g、蛋白胨10.0?g、NaCl 5.0?g、瓊脂20.0?g，用蒸餾水定容至1?000?mL。

培養(yǎng)基均在121℃高壓蒸汽滅菌20?min。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；TS型恒溫?fù)u床，上海天呈實驗儀器制造有限公司；SPL-250型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-IFD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PTX-FA110型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；YX-280A型手提式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；HYC-310型醫(yī)用冷藏箱，青島海爾特種電器有限公司；生物顯微鏡，重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司；GFL-125型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

菌株初篩：在無菌條件下，挑取兩環(huán)菌落，平板劃線到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，分別在45℃和50℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察各菌株的生長情況，初步篩選出能在高溫條件下生長的菌株。

菌株復(fù)篩：在無菌條件下，將初篩得到的菌株，挑取兩環(huán)菌落，平板劃線到復(fù)篩培養(yǎng)基中，分別在45℃和50℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察各菌株的生長情況，篩選出在高溫條件下生長能力強的菌株。

菌株最適生長溫度測定：在無菌條件下，將復(fù)篩后得到的菌株，挑取少量菌落，接種于100?mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37℃、150?r·min-1條件下，恒溫培養(yǎng)12～18?h，測OD600。待OD值約為0.8時，制得菌株的種子液。吸取1?mL種子液，接種于100?mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別在28、37、45、50、55、60℃的搖床（150?r·min-1）中培養(yǎng)相同時間，以空白培養(yǎng)基為對照，測OD600，繪制各菌株的溫度曲線。

1.3.2 菌種鑒定

嗜熱菌株的形態(tài)觀察、革蘭氏染色及生理生化實驗參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]。嗜熱菌株的分子生物學(xué)鑒定在提取嗜熱菌株基因組后，采用16?S rDNA基因的通用引物27F、785F和1492R進(jìn)行PCR擴增、測序，結(jié)果提交至GenBank進(jìn)行序列比對，利用生物學(xué)軟件MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]。

1.3.3 嗜熱菌株發(fā)酵茶葉時產(chǎn)酶特性研究

嗜熱菌株發(fā)酵樣品制備：將曬青毛茶進(jìn)行裝罐處理，每罐20.0?g，加入10?mL無菌水后121℃滅菌20?min，冷卻備用。在無菌條件下，將嗜熱菌株各挑取兩環(huán)接種于100?mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在55℃、150?r·min-1條件下，恒溫培養(yǎng)12～24?h，測OD600備用（OD600約為0.8）。將已制備的菌液在3?500?r·min-1條件下離心10?min，收集菌體，用無菌蒸餾水反復(fù)多次洗滌后再次離心，將收集的菌體重新混勻在100?mL無菌水中備用。吸取3?mL上述菌液，接種于每罐茶葉中，在55℃條件下恒溫培養(yǎng)，在0、5、10?d時取樣，每個菌株6次重復(fù)，測定各項酶活力。

粗酶液的提取：稱取5.0?g發(fā)酵茶樣品于150?mL容量瓶中，加入50?mL超純水，置于25℃搖床中，180?r·min-1浸提2?h。隨后用8層紗布過濾粗顆粒，濾液在4℃條件下8?000?r·min-1離心10?min，取上清液，即為粗酶液。

酶活力測定方法：纖維素酶、淀粉酶和單寧酶活力測定方法參照吳志超[17]的方法。纖維素酶活定義為在37℃條件下，每小時每克發(fā)酵茶催化羧甲基纖維素鈉生成1?mg葡萄糖所需纖維素酶為一個酶活力單位（U）。淀粉酶活力定義為在50℃條件下，每小時每克發(fā)酵茶催化可溶性淀粉生成1?mg葡萄糖所需淀粉酶為一個酶活力單位（U）。單寧酶活力定義為40℃條件下，每分鐘每克發(fā)酵茶生成1?μmol沒食子酸所需單寧酶為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 嗜熱細(xì)菌發(fā)酵茶葉內(nèi)含成分變化研究

嗜熱細(xì)菌N3發(fā)酵樣品制備：將曬青毛茶進(jìn)行裝罐處理，每罐20.0?g，加入10?mL無菌水后121℃滅菌20?min，冷卻備用。在無菌條件下，將N3菌株挑取兩環(huán)接種于100?mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在55℃、150?r·min-1條件下，恒溫培養(yǎng)12～24?h，測OD600備用（OD600約為0.8）。以3?500?r·min-1將已制備的菌液離心10?min，收集菌體，用無菌蒸餾水反復(fù)多次洗滌后再次離心，將收集菌體混勻重懸在100?mL無菌水中備用。吸取3?mL上述菌液，接種于每罐茶葉中，在55℃條件下恒溫培養(yǎng)，在10?d時取樣，以0?d為對照，試驗重復(fù)3次。

理化成分測定：水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013[18]；茶多酚含量測定參照GB/T8313—2018[19]；游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314—2013[20]；可溶性糖含量測定參照蒽酮硫酸法[21]；兒茶素組分、沒食子酸和咖啡堿含量測定參照HPLC法[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗均3次重復(fù)，數(shù)據(jù)均采用Excel 2021和SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和顯著性比較，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌株的初篩與復(fù)篩

嗜熱微生物一般是指能夠在高溫環(huán)境中生長的微生物[23]。通過初篩結(jié)果可知，共有20個菌株可在45℃或50℃條件下正常生長，具有耐高溫活性（表1）。而復(fù)篩的結(jié)果表明，共有15個菌株，可在45℃或50℃條件下的含茶湯培養(yǎng)基中正常生長（表2）。因此，推測這15個菌株中存在著適合在茶葉中生長的嗜熱細(xì)菌。

2.2 菌株的最適生長溫度

將復(fù)篩后得到的15個菌株，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在不同溫度條件下，搖床培養(yǎng)相同時間后，測定其OD600值（圖1）。

如圖1所示，N4、N1-2、F3-3、N2為常溫細(xì)菌（Normal temperature microorganism），最適生長溫度為37℃（圖1-A）；N2-1、F1-1、F3-2、N1-4、N1為中溫微生物（Mesophilic microorganisms），最適生長溫度為45℃（圖1-B）；F1、N92-2A、N1-12為耐熱微生物（Thermoduric microorganism），最適生長溫度為50℃（圖1-C）；N1-3、N3、N3-1為嗜熱微生物（Thermophilic microorganisms），最適生長溫度為55℃（圖1-D）。表明N1-3、N3、N3-1菌株為青磚茶渥堆發(fā)酵中的嗜熱細(xì)菌。

2.3 菌種鑒定

由圖2可知，菌株N1-3在牛肉膏蛋白胨平板上30℃培養(yǎng)48?h后，菌落呈白色不透明，邊緣光滑，不易挑取。

菌株N3和N3-1在牛肉膏蛋白胨平板上30℃培養(yǎng)48?h后，菌落呈白色不透明，邊緣呈鋸齒狀，易挑取。3種嗜熱菌株革蘭氏染色均為陽性，菌體成桿狀，室溫放置3?d以上可觀察到游離芽孢。3種嗜熱菌株的生理生化結(jié)果為：V-P試驗呈陽性；硝酸鹽還原試驗呈陽性；觸酶試驗呈陽性；脲酶、吲哚試驗均為陰性；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇等碳源，但不產(chǎn)氣；雙水解酶試驗呈陰性；反硝化作用呈陰性。由形態(tài)觀察及生理生化特征結(jié)果可以初步確定這3種嗜熱菌株為芽孢桿菌屬（spp.）。對3種嗜熱菌株的16?S rDNA序列進(jìn)行測序，將拼接好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（Blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)N1-3與枯草芽孢桿菌屬（）的16?S rDNA基因序列自然聚類，相似度為100%；N3和N3-1與地衣芽孢桿菌屬（）的16?S rDNA基因序列自然聚類，相似度為100%。與10條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，N1-3與菌株聚為一群，表明N1-3與的菌株親緣關(guān)系最近；N3和N3-1與菌株聚為一群，表明N3和N3-1與的菌株親緣關(guān)系最近。

表1 初篩中在45℃或50℃能正常生長的菌株

注：+，生長；-，不生長

Note: +, grow.-, not grow

表2 菌株在含茶葉的培養(yǎng)基生長情況

注：+，生長；-，不生長

Note: +, grow; -, not grow

注：不同的小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。A：常溫細(xì)菌，B：中溫微生物，C：耐熱微生物，D：嗜熱微生物

2.4 嗜熱菌株發(fā)酵茶葉時產(chǎn)酶特性

本研究對在嗜熱細(xì)菌發(fā)酵樣品可能產(chǎn)生的各種酶類進(jìn)行了研究，包括多酚氧化酶、過氧化物酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶、淀粉酶。試驗結(jié)果表明，3種嗜熱細(xì)菌在發(fā)酵茶葉時可產(chǎn)生纖維素酶、單寧酶和淀粉酶。在55℃條件下，N1-3菌株在發(fā)酵10?d時所產(chǎn)纖維素酶的活力最高，為215.69?U；N3和N3-1菌株所產(chǎn)纖維素酶的活力不存在顯著性差異（圖4-A）。在55℃條件下，N3菌株在發(fā)酵10?d時所產(chǎn)單寧酶活力最高，為4.85?U，且與N3-1菌株所產(chǎn)酶的活力不存在顯著性差異（圖4-B）。在55℃條件下，N3菌株在發(fā)酵10?d時所產(chǎn)淀粉酶的活力最高，為259.28?U。N1-3菌株在發(fā)酵5?d時不產(chǎn)淀粉酶，在發(fā)酵10?d時產(chǎn)酶能力與N3-1不存在顯著性差異（圖4-C）。因此，在55℃的高溫條件下，N3菌株產(chǎn)酶能力較強，且發(fā)酵10?d有利于多種酶的產(chǎn)生。

注：a1：N1-3菌落形態(tài)；a2：N1-3革蘭氏染色（100×）；b1：N3菌落形態(tài)；b2：N3革蘭氏染色（100×）；c1：N3-1菌落形態(tài)；c2：N3-1革蘭氏染色（100×）

圖3 嗜熱菌株基于16?S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

注：不同的小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

2.5 嗜熱細(xì)菌發(fā)酵茶葉時內(nèi)含成分變化

對嗜熱細(xì)菌N3發(fā)酵茶樣品進(jìn)行理化成分和兒茶素組分等含量測定，結(jié)果見表3和表4。由表3可知，與對照相比，發(fā)酵樣品的水浸出物、茶多酚、游離氨基酸含量均降低，而可溶性糖含量增加，為50.68±2.17?g·kg-1?？赡苁鞘葻峒?xì)菌能夠分泌纖維素酶和淀粉酶，有利于可溶性糖含量的積累。表4結(jié)果表明，兒茶素組分中，EGCG和EGC含量明顯降低，GC含量明顯增加；GA含量略有增加，CAFF含量略有下降。由于本研究中并未檢測到多酚氧化酶含量，推測茶多酚含量的降低和兒茶素組分的變化可能是高溫條件作用的結(jié)果。

表3 嗜熱細(xì)菌N3發(fā)酵樣品中理化成分含量

表4 嗜熱細(xì)菌N3發(fā)酵樣品中兒茶素組分、沒食子酸、咖啡堿含量

注：C 兒茶素；GC 沒食子兒茶素；EC 表兒茶素；EGC 表沒食子兒茶素；EGCG 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；GCG 沒食子兒茶素沒食子酸酯；ECG 表兒茶素沒食子酸酯；GA 沒食子酸；CAFF 咖啡堿

Note: C, catechin.GC, gallocatechin.EC, epicatechin.EGC, epigallocatechin.EGCG, epigallocatechin gallate.GCG, gallocatechin gallate.ECG, epicatechin gallate.GA gallic acid.CAFF Caffeine

3 討論

3.1 青磚茶渥堆發(fā)酵中存在嗜熱細(xì)菌

近年來，黑茶因其獨特的陳香風(fēng)味和保健作用，在全球范圍內(nèi)越來越受歡迎[24]。而渥堆發(fā)酵，是形成黑茶獨特品質(zhì)的關(guān)鍵工藝。以往研究[25-26]表明，渥堆發(fā)酵是在高溫條件下進(jìn)行的。因此，在黑茶渥堆發(fā)酵中存在大量耐高溫或嗜熱微生物。對普洱茶渥堆發(fā)酵中嗜熱微生物的研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱微生物主要來自芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬、鏈霉菌屬和脲桿菌屬[27]；而青磚茶渥堆發(fā)酵中的主要耐高溫微生物有稻殼芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和煙曲霉[28]。且芽孢桿菌屬是黑茶渥堆發(fā)酵的優(yōu)勢微生物屬[5]。本研究采用純培養(yǎng)方法，對來自青磚茶渥堆發(fā)酵中細(xì)菌的最適生長溫度進(jìn)行分析，結(jié)果表明青磚茶渥堆發(fā)酵中除了常溫和中溫微生物外，還存在耐熱微生物和嗜熱微生物。并通過菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢測和分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定出青磚茶渥堆發(fā)酵中的嗜熱微生物為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

3.2 微生物分泌多種酶類有利于黑茶內(nèi)含成分的轉(zhuǎn)化

黑茶的獨特品質(zhì)是以兒茶素為主體的多酚類、生物堿、氨基酸及其氧化產(chǎn)物等多種物質(zhì)的綜合體現(xiàn)[8]。在渥堆發(fā)酵過程中，茶葉中多酚、生物堿、萜烯類等物質(zhì)在微生物分泌的多種胞外酶作用下，進(jìn)行酶促反應(yīng)，從而發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化。對茯磚茶不同發(fā)酵過程微生物菌群和化學(xué)成分變化研究發(fā)現(xiàn)，酵母屬微生物可以分泌降解苯酚的酶類，產(chǎn)生甜味的木糖醇類物質(zhì)[29]。對普洱茶不同發(fā)酵過程微生物和酶的變化研究表明，發(fā)酵過程中主要的優(yōu)勢菌屬是變形桿菌和曲霉屬，茶多酚、游離氨基酸、兒茶素類和茶紅素含量均呈下降趨勢，而茶褐素和沒食子酸含量上升，可能是微生物分泌的過氧化氫酶參與兒茶素的氧化分解導(dǎo)致[30]。本研究通過嗜熱細(xì)菌發(fā)酵曬青毛茶產(chǎn)酶試驗分析發(fā)現(xiàn)，在高溫發(fā)酵過程中，嗜熱菌株可以產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶和單寧酶；同時嗜熱細(xì)菌發(fā)酵茶葉試驗結(jié)果表明，可溶性糖含量增加，酯型兒茶素含量降低。纖維素酶可以降解纖維素生成葡萄糖，淀粉酶能將淀粉水解成低聚糖，進(jìn)而提高茶葉中可溶性糖含量；單寧酶能水解單寧酸類物質(zhì)，使茶葉的苦澀味降低。

4 結(jié)論

本研究對來自青磚茶渥堆發(fā)酵樣品中細(xì)菌進(jìn)行高溫初篩和復(fù)篩，得到20株能夠在高溫條件下良好生長的耐高溫細(xì)菌，且其中有15個菌株能在含茶培養(yǎng)基中良好生長。通過菌株最適生長溫度分析，得到3株能夠在55℃高溫條件下良好生長的嗜熱細(xì)菌。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16?S rDNA序列比對分析，確定N1-3菌株為枯草芽孢桿菌，N3和N3-1菌株為地衣芽孢桿菌。經(jīng)嗜熱細(xì)菌發(fā)酵曬青毛茶的產(chǎn)酶試驗可知，嗜熱菌株在發(fā)酵茶葉時能夠產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶和單寧酶。同時，嗜熱細(xì)菌發(fā)酵茶葉試驗結(jié)果表明，可溶性糖含量增加，酯型兒茶素含量降低。綜上所述，在青磚茶渥堆發(fā)酵中，存在著多種嗜熱微生物，且能夠產(chǎn)生各種胞外酶，影響茶葉內(nèi)含成分的轉(zhuǎn)化，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。本研究可為青磚茶渥堆發(fā)酵高溫作用的機理研究奠定基礎(chǔ)。

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The Screening, Identification and Enzyme Production of Thermophilic Bacteria in Pile-fermentation of Qingzhuan Tea

ZHU Wen, WU Shuang, WANG Wenfeng, XU Wencan, CHEN Wenjun, HUANG Youyi*

Key Laboratory of Urban Agriculture in Central China, Ministry of Agriculture, College of Horticulture and Forestry Science Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Pile-fermentation (PF) is a key step for the formation of the unique quality of Qingzhuan tea.In this study, high-temperature screening and identification of bacteria from PF samples of Qingzhuan tea were carried out.The results show that 20 strains of bacteria that could grow under high temperature conditions were obtained through screening, of which 15 strains could grow on a tea-containing medium.The optimum temperature of 3 thermophilic bacteria strains was 55℃.Combined with the morphological characteristics and the 16?S rDNA gene sequence analysis, it was found that one strain wasand the other two were.The enzyme production test on raw tea by thermophilic bacteria shows that three thermophilic bacteria could produce cellulase, amylase and tannin during tea fermentation, and the enzyme activities reached 215.69?U, 259.28?U, and 4.85?U, respectively.

Qingzhuan tea, thermophilic bacteria,,, enzyme production characteristics

S571.1

A

1000-369X(2022)02-211-11

2021-12-16

2022-01-13

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（2662020YLPY012）

朱雯，女，博士研究生，研究方向為茶葉生物技術(shù)與加工，516166123@qq.com。*通信作者：youyi@mail.hzau.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）