茶樹黃金芽CsHIPP26.1蛋白螯合離子的篩選與鑒定

劉富浩，范延艮，王域，孟凡月，張麗霞*

茶樹黃金芽CsHIPP26.1蛋白螯合離子的篩選與鑒定

劉富浩1,2，范延艮1,2，王域1,2，孟凡月1,2，張麗霞1,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018

重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白（HIPPs）由于其獨(dú)特的重金屬結(jié)合域和異戊二烯序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成為一類重要的金屬分子伴侶。為鑒定茶樹（）黃金芽CsHIPP26.1蛋白的螯合離子，將重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，在分別添加4?mol·L-1的單一金屬離子（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2）或5種金屬離子混合液以及1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的LB液體中培養(yǎng)，觀測(cè)大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，并用His-tag蛋白純化磁珠純化獲得融合目的蛋白，經(jīng)原子吸收分光光度計(jì)分析融合蛋白中金屬離子含量，計(jì)算蛋白螯合的離子數(shù)目。結(jié)果表明，CsHIPP26.1蛋白僅與Zn2+和Cu2+螯合，且螯合Zn2+的能力顯著強(qiáng)于Cu2+。根據(jù)其結(jié)合金屬離子與目的蛋白質(zhì)量摩爾比推測(cè)，CsHIPP26.1蛋白螯合Zn2+、Cu2+金屬離子的最大數(shù)目分別為2和1。

重金屬異戊二烯植物蛋白；CsHIPP26.1；金屬離子；茶樹

重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白（Heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPP）是植物中一種特有的金屬伴侶蛋白。本課題組前期從茶樹[(L.) Kuntze]黃金芽品種中發(fā)現(xiàn)一個(gè)響應(yīng)強(qiáng)光且高表達(dá)的CsHIPP26.1蛋白，并對(duì)該蛋白基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證[1]，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的蘋果愈傷組織對(duì)光脅迫的抗性增強(qiáng)，且CsHIPP26.1可與光敏色素互作因子CsPIF4（Phytochrome interacting factors）互作[2]。已有研究表明，HIPPs在植物體內(nèi)主要有3個(gè)方面的功能：（1）與蛋白互作對(duì)代謝起調(diào)控作用；（2）參與重金屬的解毒；（3）參與金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。而這些功能的發(fā)揮與螯合離子的種類密切相關(guān)。所以，明確CsHIPP26.1蛋白結(jié)合金屬離子的種類，可為該蛋白功能的研究提供一定的基礎(chǔ)，因而具有重要的理論意義。

有研究表明，HIPPs蛋白HMA結(jié)構(gòu)域的核心基序M/LXCXXC能螯合Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+[4-5]，但不與Co2+、Mn2+、Ca2+結(jié)合[6-7]。由于CsHIPP26.1蛋白表達(dá)響應(yīng)高光強(qiáng)下的葉色黃化，與重金屬離子（Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+）的毒害無關(guān)，而與光逆境脅迫和葉色變化相關(guān)[2]，從而可能與光保護(hù)機(jī)制[8]、植物卟啉類化合物代謝[9]和植物信號(hào)通路[10]中涉及的離子（Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+）相關(guān)。

為篩選和鑒定CsHIPP26.1蛋白所螯合的金屬離子，本研究構(gòu)建含有質(zhì)粒的大腸桿菌原核表達(dá)載體（pET-CHI），同時(shí)以空載體為對(duì)照（Control），分別在添加單一金屬離子（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2）和5種混合金屬離子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得目的蛋白CsHIPP26.1，進(jìn)一步分析并確定融合蛋白中金屬離子的種類和結(jié)合數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采摘種植于山東省泰安市茶園5年茶樹黃金芽的芽下第二葉，液氮冷凍，置于–80℃冰箱保存，用于總RNA提取。

1.2 試劑與儀器

T100TMPCR儀，美國(guó)Bio-Rad；DYY-12核酸電泳儀，北京六一儀器廠；Tanon-3500凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；YJ-VS-2超凈工作臺(tái)，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；Z216MK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle；ML204電子天平，美國(guó)METTLER TOLEDO；NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific；ExceMagTM16孔金屬磁力架，蘇州莫納生物科技有限公司；MARS6微波消儀，美國(guó)CEM；HNY-200B恒溫培養(yǎng)震蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；GI80TW滅菌器，美國(guó)Zealway；TAS-986原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取茶樹總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA質(zhì)量。提取的茶樹總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于–20℃冰箱備用。

1.3.2 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

目的基因克?。焊鶕?jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中基因的編碼序列MK654903，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物（5'-3'）為ATGGGTGCTCTGGATCATCTC，下游引物（5'-3'）為CATGACAACACAAGCAGCAG。以黃金芽cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)，回收目的片段連接到平末端克隆載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，挑取氨芐西林（Amp）抗性陽性單克隆測(cè)序。

重組載體的構(gòu)建：用Steady Pure Plasmid DNA Extraction Kit試劑盒提取測(cè)序正確菌液中的質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒與載體同時(shí)進(jìn)行SalI與BamHI雙酶切，所獲得的陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，確定其堿基序列的完整性。

設(shè)計(jì)新穎、技術(shù)前沿、風(fēng)格獨(dú)特、性能卓越，無論從美學(xué)上還是機(jī)械設(shè)計(jì)上，Defy系列無疑都是未來革新的風(fēng)向標(biāo)，代表著真力時(shí)的先鋒巨制。尤其是2017年問世的Defy El Primero 21以及DefyLab表款則以其劃時(shí)代的變革意義象征著品牌再攀制表巔峰，更為全球制表界指明未來的方

融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒（）及對(duì)照質(zhì)粒（）分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。挑取重組菌株以及對(duì)照菌株單克隆，培養(yǎng)于LB+Amp培養(yǎng)基中。加入終濃度為1?mmol·L-1的IPTG，誘導(dǎo)His-tag融合蛋白的表達(dá)。分別于0、60、120?min和240?min收集菌液，提取菌液粗蛋白，利用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)變性凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 不同金屬離子溶液處理下大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別在OD600=0.1的重組菌和對(duì)照菌株LB培養(yǎng)液中加入終濃度為1?mmol·L-1的IPTG和4?mol·L-15種金屬離子單一溶液或其混合溶液（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2），同時(shí)以未添加金屬離子培養(yǎng)的菌株為對(duì)照，在37℃、180?r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2?h測(cè)定OD600值，試驗(yàn)重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 目的蛋白純化

以O(shè)D600=0.6的重組菌（pET-CHI）及對(duì)照菌（Control）液為材料，經(jīng)高速離心機(jī)按照5?000?r·min-1離心15?min，收集菌體，稱重。將1?g濕質(zhì)量的大腸桿菌加入10?mL Binding buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，20?mmol·L-1咪唑，pH7.4）重懸，依據(jù)一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒說明書，加入10?mL的裂解液，4℃下，混勻30?min。超聲裂解后將液體轉(zhuǎn)移至離心管，在高速冷凍離心機(jī)中4℃條件下以1?200?r·min-1轉(zhuǎn)速離心20?min，收集上清液；然后加入His-tag蛋白純化磁珠顛倒混勻，室溫孵育15?min。將離心管置于磁力架上分離，待溶液澄清，移出上清液。向離心管中加入10?mL Wash buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，100?mmol·L-1咪唑，pH7.4），反復(fù)吹打5～10次進(jìn)行洗滌，磁分離，吸出上清液。最后向離心管中加入10?mL Elution buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，500?mmol·L-1咪唑，pH7.4）進(jìn)行洗脫，磁分離，待溶液澄清，收集上清液即為目的蛋白組分CsHIPP26.1。

1.3.5 目的蛋白中離子種類及配體數(shù)量確定

蛋白含量測(cè)定：取1?mL分離純化后的目的蛋白，按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定目的蛋白的濃度，試驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[11]，測(cè)得目的蛋白濃度（mmol·L-1）。

金屬離子含量測(cè)定：取10?mL分離純化液置于四氟乙烯微波消解罐的內(nèi)罐中，加入10?mL HNO3-HClO4（5∶1）混合液，輕微振蕩后靜置20?min，放入微波消解儀中消解，消解完畢后冷卻至室溫，取出內(nèi)罐，將消解液轉(zhuǎn)移至100?mL容量瓶中并定容，最后將溶液通過原子吸收分光光度計(jì)，測(cè)得目的蛋白中各金屬離子的濃度（mmol·L-1）。

蛋白中離子配體數(shù)計(jì)算：蛋白結(jié)合的離子配體數(shù)=金屬離子濃度（mmol·L-1）/蛋白濃度（mmol·L-1）

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（=0.05），利用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，在460?bp左右的位置獲得了目的條帶（圖1），與基因預(yù)測(cè)的CDS區(qū)域序列大小完全一致[1]。

圖1 CsHIPP26.1基因RT-PCR擴(kuò)增

2.2 pET-32a-CsHIPP26.1重組載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增獲得的基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆的重組質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在460?bp附近出現(xiàn)了目的基因條帶，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 pET-32a-CsHIPP26.1重組載體的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21中，利用1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)茶樹CsHIPP26.1融合蛋白。從圖3可知，與空白載體相比，重組載體表達(dá)的蛋白譜帶在37kDa處有新的條帶，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加。由此表明，通過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中重組的基因能被正確地表達(dá)。

2.4 重組菌生長(zhǎng)情況分析

將重組菌和對(duì)照菌在單一或混合金屬離子溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，分析不同離子溶液培養(yǎng)條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4所示。除添加Zn2+對(duì)對(duì)照菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用外，其余處理對(duì)重組菌和對(duì)照菌的生長(zhǎng)情況沒有顯著影響。由此表明，CsHIPP26.1與Zn2+存在一定的關(guān)聯(lián)。

圖2 pET-32a-CsHIPP26.1重組質(zhì)粒的BamHI和SalI酶切鑒定

圖3 重組載體pET-32a-CsHIPP26.1原核表達(dá)

圖4 不同金屬離子下大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

2.5 CsHIPP26.1蛋白螯合金屬離子種類和含量的分析

將重組菌和對(duì)照菌在單一或混合金屬離子溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，從菌液中提取純化目的蛋白CsHIPP26.1，并對(duì)其螯合的離子含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5和圖6所示。結(jié)果表明，經(jīng)單一金屬離子溶液培養(yǎng)處理的重組菌目的蛋白中檢測(cè)到的Zn2+、Cu2+含量顯著高于對(duì)照（<0.000?1），分別為對(duì)照的34.9倍和13.7倍；而重組菌目的蛋白和對(duì)照蛋白中Fe3+、Ca2+、Mg2+含量相近，無顯著差異。經(jīng)混合金屬離子溶液培養(yǎng)處理，獲得的重組菌目的蛋白中也可檢測(cè)到Zn2+、Cu2+含量顯著高于對(duì)照（<0.000?1），分別為對(duì)照的42.9倍和6.7倍。與單一金屬離子溶液處理相比，混合離子溶液處理獲得的重組菌目的蛋白中Zn2+比例增加，而Cu2+比例下降，由此表明，CsHIPP26.1蛋白對(duì)Zn2+的結(jié)合能力顯著強(qiáng)于Cu2+。

2.6 CsHIPP26.1蛋白螯合金屬離子數(shù)分析

將重組菌分別在添加濃度為0、0.5、5?mol·L-1的ZnCl2、CuCl2溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，提取純化目的蛋白CsHIPP26.1，測(cè)定和分析蛋白的表達(dá)量及螯合金屬離子含量，結(jié)果如表1所示。從表1可知，不同離子濃度培養(yǎng)條件下目的蛋白CsHIPP26.1的表達(dá)量無顯著差異，但目的蛋白中Zn2+和Cu2+濃度隨添加離子濃度的增加呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。當(dāng)添加Zn2+和Cu2+的濃度從0.5?mol·L-1上升到5?mol·L-1時(shí)，Zn2+含量與CsHIPP26.1蛋白含量的比值從0.639?9上升到1.975?5，Cu2+含量與CsHIPP26.1蛋白含量的比值從0.406?3上升到0.952?1。根據(jù)CsHIPP26.1蛋白所結(jié)合的金屬離子與目的蛋白質(zhì)量摩爾比推測(cè)，每分子蛋白螯合的Zn2+、Cu2+數(shù)目分別為2和1。

3 討論

本研究結(jié)果表明，CsHIPP26.1對(duì)Zn2+、Cu2+具有螯合能力，且對(duì)Zn2+的結(jié)合能力顯著大于Cu2+，但對(duì)Ca2+、Fe3+、Mg2+無螯合能力。已有研究表明，HIPPs蛋白HMA結(jié)構(gòu)域主要結(jié)合的金屬離子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+[4-5]，但不與Co2+、Mn2+、Ca2+離子結(jié)合[6-7]。另外，Dykema等[4]發(fā)現(xiàn)擬南芥中ATFP3（farnesylated protein 3）蛋白也含有HMA結(jié)構(gòu)域，并且證明該類蛋白具有螯合Zn2+、Cu2+的特性，這與本研究CsHIPP26.1蛋白對(duì)Zn2+、Cu2+具有螯合能力但不結(jié)合Ca2+的結(jié)果相吻合。

圖6 多金屬離子培養(yǎng)條件下目的蛋白中金屬離子含量

表1 不同金屬離子濃度培養(yǎng)條件下目的蛋白和其螯合的金屬離子含量及比值

通過對(duì)CsHIPP26.1蛋白及螯合的金屬離子含量分析，確定了每分子CsHIPP26.1螯合Zn2+、Cu2+數(shù)目分別為2和1。已有研究表明，HIPPs蛋白是通過HMA結(jié)構(gòu)域核心基序CXXC中2個(gè)半胱氨酸的巰基與Zn2+、Cu2+結(jié)合[4]。在CsHIPP26.1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N端的第37—40位氨基酸具有CXXC核心基序[1]，為Zn2+或Cu2+的結(jié)合位點(diǎn)。而本研究發(fā)現(xiàn)，CsHIPP26.1蛋白可以結(jié)合2分子的Zn2+，所以CsHIPP26.1蛋白中還存在其他Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)金屬離子螯合理論，除半胱氨酸（C）外，組氨酸（H）的咪唑基、谷氨酸（E）和天冬氨酸（D）的羧基也可與Zn2+螯合。前期研究結(jié)果顯示，在CsHIPP26.1蛋白中還含有3個(gè)組氨酸、11個(gè)谷氨酸、8個(gè)天冬氨酸、2個(gè)半胱氨酸[1]，可以為Zn2+提供結(jié)合位點(diǎn)，但具體位點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

茶樹黃金芽CsHIPP26.1蛋白在強(qiáng)光下高表達(dá)，且與葉色黃化程度正相關(guān)。在響應(yīng)強(qiáng)光時(shí)，CsHIPP26.1蛋白是與Zn2+和Cu2+等量結(jié)合還是選擇性地與Zn2+或Cu2+結(jié)合？其功能主要是提高黃金芽在強(qiáng)光逆境的抗性？還是直接調(diào)控光信號(hào)傳導(dǎo)途徑或葉綠素代謝途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子？以上問題還有待深入研究。

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Screening and Identification of Chaperone CsHIPP26.1 Chelating Ionsin Tea Cultivar‘Huangjinya’

LIU Fuhao1,2, FAN Yangen1,2, WANG Yu1,2, MENG Fanyue1,2, ZHANG Lixia1,2*

1.College of Horticulture Science and Engineering, Tai'an 271018, China; 2.State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China

Heavy metal-associated isoprenylated plant proteins(HIPPs) is an important metallochaperones due to its unique heavy metal binding domains(HMA) and the structural characteristics of isoprenylation motif.In order to identify the chelating ions of CsHIPP26.1 protein in(L.) cv.‘Huangjinya’, therecombinant plasmids and empty carriers were respectively transferred intoBL21, and then were cultured in LB liquid culture medium with 4?mol·L-1single metal ions (CuCl2, ZnCl2, MgCl2, FeCl3, CaCl2) or multiple metal ions and 1?mmol·L-1IPTG.The growth ofin different ion media was observed, meanwhile the fusion target protein was obtained by His-tag protein purification magnetic bead.The contents of metal ions in fusion protein were analyzed by atomic absorption spectrophotometer, and the number of ions chelated by the protein was calculated.The results show that CsHIPP26.1 protein was only chelated with Zn2+and Cu2+, and the chelating ability to Zn2+was significantly higher than Cu2+.Based on the molar ratio of its bound metal ionsto the target protein, the maximum number of Zn2+, Cu2+chelated by CsHIPP26.1 protein was 2 and 1, respectively.

heavy metal-associated isoprenylated plant protein, CsHIPP26.1, metal ions,

S571.1

A

1000-369X(2022)02-179-08

2021-12-06

2022-02-18

山東省“雙一流”獎(jiǎng)補(bǔ)資金項(xiàng)目（SYL2017YY03）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-19-05）、魯渝科技協(xié)作計(jì)劃項(xiàng)目（2020LYXZ005）

劉富浩，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通信作者：lxzhang@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯：黃晨）