陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿克隆在兒童重型再生障礙性貧血免疫抑制治療中的意義

李俊 宗蘇玉 尹梓溪 高洋洋 劉立鵬 萬揚(yáng) 蘭洋 鞏曉文 竺曉凡

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種以外周血細(xì)胞減少和骨髓造血細(xì)胞增生低下為特征的骨髓衰竭性疾病，異常免疫反應(yīng)在AA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［1］。治療上，受限于造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）供者及費(fèi)用等問題，以抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）或抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白（antilymphocyte globulin，ALG）聯(lián)合環(huán)孢素（cyclosporine A，CSA）為代表的聯(lián)合免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）仍占據(jù)重要地位。研究表明，接受IST的AA患兒有效率為30%～70%［2］。陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）克隆是一群表面缺少糖基磷脂酰肌醇的血細(xì)胞，由造血干細(xì)胞中PIGA基因突變導(dǎo)致的。國外研究報(bào)道約40%的AA患兒在初診時(shí)伴有PNH克?。?］。AA患者中出現(xiàn)PNH克隆的機(jī)制尚未完全闡明，有研究認(rèn)為在AA背景下，缺乏糖基磷脂酰肌醇的造血干細(xì)胞可逃避免疫細(xì)胞的殺傷，導(dǎo)致克隆擴(kuò)增，因此PNH克隆也被認(rèn)為是可預(yù)測(cè)IST療效的潛在指標(biāo)［4］。目前，多項(xiàng)研究結(jié)果均提示伴PNH克隆的成人AA患者對(duì)IST反應(yīng)較好［5-6］。但在兒童中，尚未獲得一致結(jié)果。此外，AA患者有進(jìn)展為再生障礙性貧血-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（aplastic anemia-paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，AAPNH）綜合征的風(fēng)險(xiǎn)［7］，PNH使治療更加困難，嚴(yán)重的溶血常危及生命。Narita等［8］報(bào)道AA患兒中AA-PNH綜合征的10年累積發(fā)病率為10.2%，初診時(shí)伴PNH克隆是進(jìn)展為AA-PNH綜合征的危險(xiǎn)因素，但國內(nèi)尚無研究探索兒童AA的PNH克隆演變及進(jìn)展為PNH的情況。本研究回顧性分析我院151例重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）患兒的臨床資料，并通過傾向性評(píng)分匹配的方法控制混雜因素，探究PNH克隆在預(yù)測(cè)IST療效中的作用，并初步探索IST后PNH克隆的演變規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2012年1月至2020年4月我院收治的SAA患兒臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18歲。（2）符合2014年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組《兒童獲得性再生障礙性貧血診療建議》中SAA或極重型再生障礙性貧血（very severe aplastic anemia，VSAA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：SAA指①骨髓有核細(xì)胞增生程度25%～50%，殘余造血細(xì)胞少于30%或有核細(xì)胞增生程度低于25%。②外周血象至少符合以下3項(xiàng)中的2項(xiàng)：中性粒細(xì)胞絕對(duì)值＜0.5×109/L；血小板計(jì)數(shù)＜20×109/L；網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值＜20×109/L，或校正后的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率＜1%。VSAA指除滿足SAA條件外，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值＜0.2×109/L。（3）接受ATG或ALG聯(lián)合CSA治療。（4）IST前均檢測(cè)PNH克隆。根據(jù)IST前PNH克隆狀態(tài)將患兒分為PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組。本研究已通過我院倫理委員會(huì)審查（IIT2021009-EC-1）。

1.2 PNH克隆檢測(cè)

分別采用流式細(xì)胞術(shù)和嗜水氣單胞菌溶素變異體（fluorescent aerolysin，F(xiàn)LAER）檢測(cè)外周血紅細(xì)胞和粒細(xì)胞PNH克隆，CD235a+CD59-細(xì)胞百分率為紅細(xì)胞PNH克隆大小，F(xiàn)LAER-CD24-細(xì)胞百分率為粒細(xì)胞PNH克隆大小。紅細(xì)胞或粒細(xì)胞PNH克隆大于1%即為PNH克隆陽性。PNH克隆擴(kuò)增定義為任意1系PNH克隆較初診最高的1系增大1倍或以上。PNH克隆減小定義為任意1系PNH克隆較初診最高的1系減小1倍或以上。PNH克隆穩(wěn)定定義為PNH克隆變化未達(dá)到擴(kuò)增及減小［10］。同時(shí)滿足以下4條診斷為AA-PNH綜合征：（1）2系PNH克隆≥10%；（2）酸溶血試驗(yàn)陽性；（3）血漿結(jié)合珠蛋白降低伴或不伴血漿游離血紅蛋白增高；（4）血清乳酸脫氫酶活性增高［11］。

1.3 治療方案

兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白（美國Genzyme公司）2.5～3.5 mg/(kg·d)×5 d或豬抗人淋巴細(xì)胞球蛋白（武漢生物制品研究所）20 mg/(kg·d)×5 d。予甲潑尼龍預(yù)防血清病，劑量為1 mg/(kg·d)×5 d，并在15～21 d內(nèi)逐漸減停。CSA初始劑量為3～5 mg/(kg·d)，根據(jù)血藥濃度調(diào)整劑量，維持血藥濃度在100～200 ng/mL，連續(xù)使用至少2年［12］。成分輸血維持血紅蛋白≥60 g/L，血小板計(jì)數(shù)≥10×109/L。

1.4 療效評(píng)價(jià)

完全緩解（complete response，CR）定義為同時(shí)滿足血紅蛋白≥120 g/L，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，并維持3個(gè)月以上。部分緩解（partial response，PR）定義為脫離紅細(xì)胞及血小板輸注3個(gè)月以上，且血常規(guī)好轉(zhuǎn)不再滿足SAA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但未達(dá)CR。未緩解（no response，NR）定義為未達(dá)到以上CR及PR標(biāo)準(zhǔn)、IST后6個(gè)月仍NR行HSCT或死亡。分別在IST后的3、6、12、24個(gè)月評(píng)價(jià)療效，總有效率（overall response rate，ORR）為各組中達(dá)到CR和PR者所占的比例。疾病復(fù)發(fā)定義為達(dá)PR或CR患兒出現(xiàn)血紅蛋白、中性粒細(xì)胞、血小板水平下降，表現(xiàn)為輸血依賴或再次符合SAA診斷標(biāo)準(zhǔn)［13］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件4.0.2進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。使用R語言函數(shù)包“Matching”進(jìn)行傾向性評(píng)分匹配，匹配因素為基線資料中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，采用1∶2臨近匹配法進(jìn)行匹配，卡鉗值設(shè)為0.2。采用logrank法檢驗(yàn)組間累積緩解率及AA-PNH綜合征累積發(fā)病率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

共納入151例患兒，男性72例（47.7%），女性79例（52.3%），中位年齡為5.0（3.5，9.0）歲。16例（10.6%）患兒PNH克隆陽性，男、女各8例，中位年齡為10（7，11）歲，2例患兒粒細(xì)胞和紅細(xì)胞均檢測(cè)到PNH克隆，其余14例僅檢測(cè)到粒細(xì)胞PNH克隆，中位粒細(xì)胞克隆大小為1.8%（1.3%，3.5%）。PNH克隆陽性組患兒的初診年齡和網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值高于PNH克隆陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。傾向性評(píng)分匹配后，PNH克隆陰性組28例，PNH克隆陽性組14例，中位粒細(xì)胞克隆大小為1.8%（1.2%，2.2%）。兩組在性別、初診年齡、疾病嚴(yán)重程度、發(fā)病至IST時(shí)間，以及初診時(shí)血紅蛋白水平、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、血小板計(jì)數(shù)間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組傾向性評(píng)分匹配前后的臨床特征 ［M（P25，P75）］或［例（%）］

2.2 IST療效對(duì)比

兩組患兒中位隨訪時(shí)間為44（25，68）個(gè)月。IST后3、6、12、24個(gè)月的ORR分別為31%（13/42）、60%（25/42）、71%（29/41）、73%（27/37）。IST后3個(gè)月，兩組ORR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；IST后6、12、24個(gè)月PNH克隆陰性組的ORR均高于PNH克隆陽性組（P＜0.05）（表2）。在隨訪期間，14例PNH克隆陽性組中，共6例（43%）達(dá)PR或CR，4例（29%）行HSCT。28例PNH克隆陰性組中，共23例（82%）達(dá)PR或CR，3例（11%）行HSCT。以達(dá)到PR或CR為終點(diǎn)事件，PNH克隆陽性組和PNH克隆陰性組患兒的12個(gè)月累積緩解率分別為50.0%（95%CI：15.6%～70.4%）和82.1%（95%CI：60.5%～91.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

表2 IST療效比較 ［例（%）］

2.3 PNH克隆演變

共120例患兒有至少2次PNH克隆檢測(cè)結(jié)果。15例PNH克隆陽性患兒，6例（40%）患兒在IST后PNH克隆轉(zhuǎn)陰，其中5例在6個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)陰；1例（7%）患兒PNH克隆減?。?例（40%）患兒出現(xiàn)PNH克隆擴(kuò)增；2例（13%）患兒PNH克隆保持穩(wěn)定，見圖2。105例PNH克隆陰性患兒，4例（3.8%）患兒PNH克隆轉(zhuǎn)陽，其中3例在IST后3個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)陽；1例于IST后20個(gè)月轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽后粒細(xì)胞、紅細(xì)胞的中位克隆大小分別為1.93%（1.73%，2.19%）和0%（0%，0.25%）。

2.4 AA-PNH綜合征進(jìn)展情況

共3例患兒進(jìn)展為AA-PNH綜合征，均為IST前已存在PNH克隆者，進(jìn)展分別發(fā)生于IST后的3、13、33個(gè)月，進(jìn)展時(shí)粒細(xì)胞克隆大小分別為22.2%、18.7%和75.0%，紅細(xì)胞克隆大小分別為18.9%、38.8%和31.6%。PNH克隆陽性組AA-PNH綜合征的3年累積發(fā)病率增加［32.1%（95%CI：0.0%～58.6%）vs 0.0%，P=0.01］（圖3）?；純哼M(jìn)展之初均無PNH相關(guān)臨床表現(xiàn)，在行溶血相關(guān)檢測(cè)時(shí)診斷，僅1例患兒在IST后25個(gè)月進(jìn)展為經(jīng)典型PNH，表現(xiàn)為乏力、間斷醬油色尿、血紅蛋白下降。

3 討論

本研究中，10.6%的SAA患兒初診時(shí)伴PNH克隆，大多數(shù)患兒僅粒細(xì)胞克隆陽性，只有2例患兒同時(shí)檢測(cè)到粒細(xì)胞和紅細(xì)胞克隆，可能與SAA患兒頻繁輸血有關(guān)。目前紅細(xì)胞PNH克隆的測(cè)定主要通過檢測(cè)紅細(xì)胞表面CD59的表達(dá)，當(dāng)患兒頻繁輸血或有溶血發(fā)作時(shí)，可導(dǎo)致紅細(xì)胞克隆檢測(cè)偏小或假陰性，因此有條件時(shí)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)粒細(xì)胞PNH克隆。粒細(xì)胞PNH克隆檢測(cè)目前多采用FLAER，且不受輸血和溶血的影響，能夠更準(zhǔn)確地反映PNH克隆的真實(shí)大?。?4］。值得注意的是，任何方法都對(duì)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)有一定要求，對(duì)于SAA患兒，嚴(yán)重血細(xì)胞減少也可能導(dǎo)致結(jié)果假陰性，因此對(duì)于初診時(shí)不伴PNH克隆者也應(yīng)定期復(fù)查。

本研究顯示，伴PNH克隆的AA患兒初診年齡偏大，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值更高。通過傾向性評(píng)分匹配平衡組間的混雜因素后，伴PNH克隆是影響IST療效的不利因素。此外，本研究初步揭示了IST后PNH克隆演變的規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)伴有PNH克隆易進(jìn)展為AA-PNH綜合征。

近期，2項(xiàng)薈萃分析的結(jié)果均表明伴PNH克隆的成人AA患者對(duì)IST反應(yīng)較好，但在兒童患者亞組分析中，2組緩解率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［15-16］。Yoshida等［17］前瞻性研究中，PNH克隆陽性并不影響SAA患兒IST的反應(yīng)率。Timeus等［18］研究發(fā)現(xiàn)存在PNH克隆陽性者療效較差。而Narita等［3］相關(guān)研究結(jié)果則相反，該現(xiàn)象可能與相關(guān)研究中存在較多混雜因素相關(guān)。本研究使用傾向性評(píng)分匹配對(duì)混雜因素進(jìn)行控制，很大程度上增強(qiáng)了2組的可比性。另外，不同研究PNH克隆檢測(cè)閾值也存在差異，如Narita等［3］研究中，PNH克隆檢測(cè)閾值低至0.001%，可在42%的初診AA患兒中檢測(cè)到PNH克隆，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞中位克隆大小分別為0.001%和0%，該研究中伴PNH克隆患兒比例顯著高于本研究，克隆明顯偏小。但微小PNH克隆（＜1%）的臨床意義目前尚不明確，盡管有研究表明PNH克隆的擴(kuò)增是源于其對(duì)異常免疫殺傷的逃逸［4］，但克隆擴(kuò)增定義的具體比例目前仍無定論。有研究提出“中性隨機(jī)漂移理論”，從另一個(gè)角度詮釋PNH的發(fā)病機(jī)制［19-20］。因此，PNH克隆的檢測(cè)仍需規(guī)范，其病理生理學(xué)機(jī)制還有待研究，臨床意義需要大規(guī)模臨床與基礎(chǔ)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

Scheinberg等［21］報(bào)道在接受IST后，成人和兒童患者PNH克隆均明顯減小，PNH克隆轉(zhuǎn)陽及進(jìn)展為AA-PNH綜合征并不常見。Bat等［22］認(rèn)為IST對(duì)抑制PNH克隆擴(kuò)增有效果。但本研究中PNH克隆擴(kuò)增及轉(zhuǎn)陰的患兒數(shù)量相當(dāng)，且50%PNH克隆擴(kuò)增患兒進(jìn)展為AA-PNH綜合征，可見IST并不一定總是抑制PNH克隆擴(kuò)增，因此若PNH克隆在IST后有擴(kuò)增趨勢(shì)應(yīng)提高警惕。75%PNH克隆轉(zhuǎn)陽和83%克隆轉(zhuǎn)陰發(fā)生在IST后6個(gè)月內(nèi)，提示IST后6個(gè)月內(nèi)對(duì)PNH克隆的監(jiān)測(cè)可能有重要意義。

國際PNH臨床隊(duì)列研究顯示，乏力是PNH最常見癥狀。相較于PNH，AA-PNH綜合征較少出現(xiàn)腹痛、吞咽障礙及血紅蛋白尿等癥狀，血栓事件也較少發(fā)生，但預(yù)后卻更差，10年總生存率為74%［23-24］。本研究中，兒童AA-PNH綜合征起病隱匿，典型臨床表現(xiàn)少見，血紅蛋白水平波動(dòng)輕微，非特異性癥狀往往容易被忽視。因此對(duì)存在PNH克隆的患兒，監(jiān)測(cè)酸溶血試驗(yàn)、血清乳酸脫氫酶、血漿結(jié)合珠蛋白和游離血紅蛋白可早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。研究顯示依庫珠單抗可有效減少AA-PNH綜合征患者溶血和血栓事件的發(fā)生［25］，但PNH克隆可能持續(xù)擴(kuò)增，停藥有發(fā)生突破性溶血風(fēng)險(xiǎn)，且兒童用藥經(jīng)驗(yàn)不足。目前HSCT是唯一可能治愈PNH的手段，隨著HSCT技術(shù)的進(jìn)展，以及考慮到兒童長期的生存，對(duì)于反復(fù)溶血的AA-PNH綜合征患兒，HSCT或許是更好的選擇。

綜上，SAA患兒應(yīng)同時(shí)檢測(cè)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞PNH克隆，并定期復(fù)查，尤其是IST后6個(gè)月內(nèi)。伴PNH克隆的SAA患兒對(duì)IST反應(yīng)欠佳，進(jìn)展為AA-PNH綜合征的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，需謹(jǐn)慎選擇治療方案；除PNH克隆變化外，還應(yīng)當(dāng)監(jiān)測(cè)酸溶血試驗(yàn)、血漿結(jié)合珠蛋白和游離血紅蛋白以便及早發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展，尤其是當(dāng)血紅蛋白出現(xiàn)明顯下降時(shí)。目前對(duì)兒童AA-PNH綜合征治療及預(yù)后的相關(guān)報(bào)道仍非常有限，關(guān)于干預(yù)時(shí)機(jī)、治療方案選擇等問題，還有賴于大樣本、長時(shí)間的隨訪觀察，以及基礎(chǔ)與臨床的相互協(xié)作挖掘其潛在的發(fā)病機(jī)制。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。