活血散結(jié)方對PDGF干預(yù)下兔RPE細胞凋亡及caspase-3、P53表達的影響?

劉曉清， 李建超， 譚涵宇， 彭 俊， 彭清華△， 吳權(quán)龍△

(1.湖南中醫(yī)藥大學， 長沙 410208；2.中醫(yī)藥防治眼病與視功能保護湖南省工程研究中心， 長沙 410208；3.西安市中醫(yī)醫(yī)院，西安 714000；4.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 長沙 410007)

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是以細胞異常高增殖與低凋亡為病理特征的難治性致盲眼疾。正常情況下，兔視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞的增殖與凋亡始終保持動態(tài)平衡，而在視網(wǎng)膜裂孔形成、外傷和眼內(nèi)炎癥等病理情況下，這種平衡會遭到破壞。血視網(wǎng)膜屏障遭受損傷后RPE細胞暴露于外，在多種細胞因子激活下通過細胞信號級聯(lián)反應(yīng)及基因調(diào)節(jié)進入細胞周期開始過度增生，并伴有RPE細胞表型變化及膠質(zhì)細胞等的增生，從而進一步導(dǎo)致視網(wǎng)膜下、視網(wǎng)膜前及玻璃體中形成增殖膜。最終，因增殖膜的收縮而發(fā)生牽拉性視網(wǎng)膜脫離，造成視力的喪失[1]。

課題組前期研究成功建立血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF,10 μg·L-1)干預(yù)下RPE細胞增殖模型，發(fā)現(xiàn)10%和20%活血散結(jié)方含藥血漿能抑制兔RPE細胞的增殖與遷移[2，3]。為繼續(xù)深入研究活血散結(jié)方抑制PVR的藥理作用機制，本實驗采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對該方君藥三七、丹參相應(yīng)主要成分三七皂苷R1、丹參酮進行含量測定，為該方的藥效研究提供了相關(guān)質(zhì)量標準[4]。并觀察活血散結(jié)方含藥血漿對PDGF干預(yù)下兔RPE細胞的凋亡、caspase-3及P53蛋白表達的影響，從細胞生物學角度探討活血散結(jié)方治療PVR與細胞凋亡相關(guān)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年青紫藍兔8只，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由上海市松江區(qū)車墩實驗動物良種場提供，實驗動物許可證號SXCK(滬)2012-0008，用于取原代細胞。成年健康家兔10只，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SCXK(湘)2015-0004，用于制備活血散結(jié)方含藥血漿。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學兔豚鼠實驗中心，飼養(yǎng)條件為室溫18～26 ℃，濕度55%。

1.2 藥物

活血散結(jié)方組成：三七(批號2001060152)、丹參(批號HY20081202)、海藻(批號2002202)、昆布(批號2008104)、鱉甲(批號HH20081905)、地龍(2020062403)，均購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，所購藥材為同一批次，采用水煎法，分煎2次后混合藥液濃縮至1.025 g/mL生藥濃度，4 ℃下保存。

1.3 試劑與儀器

DMEM/F12(貨號：SH30023,美國Hyclone公司)；胎牛血清(貨號：11011-8611，杭州四季青)；PDGF-BB(貨號：07-1437，美國sigma公司)；PDGF抑制劑AG1296(貨號：S8024，美國Selleck公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號：APOAF-20TST，美國sigma公司)；caspase-3小鼠單克隆抗體(貨號：ab44976，1∶1000，Abcam公司)；p53小鼠單克隆抗體(貨號：ab244024，1∶1000，Abcam公司)；GAPDH小鼠單克隆抗體(貨號：10494-1-AP，1∶1000，Proteintech)；HRP羊抗鼠二抗(貨號：SA00001-1，1∶3000，Proteintech)；三七皂苷R1對照品、丹參酮對照品(貨號：A0273、YM140B，中國藥品生物制品檢定所)等。

CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，型號HERACELL)；生物安全柜(Thermo公司，型號Scientific 1300)；倒置顯微鏡(Motic公司，型號AE31)；低速離心機(Thermo公司，型號Fresco 17)；流式細胞儀(Beckman Coulter公司，型號BV510)等。

1.4 活血散結(jié)方含藥血漿制備與收集

成年健康家兔10只按隨機數(shù)字表法分為藥物組與正常組各5只。根據(jù)人與家兔體表面積換算方法計算(人以60 kg體質(zhì)量為標準，家兔以1.6 kg體質(zhì)量為標準)活血散結(jié)方家兔臨床等效劑量為每日5.064 g/kg。取4倍家兔臨床等效劑量即每日20.5 g·kg-1，水煎制成含1.025 g·mL-1生藥的藥液，給予藥物組家兔以20 mL·kg-1灌胃給藥，每日2次，共給藥5 d?？瞻讓φ战M用蒸餾水進行灌胃。第5天灌胃結(jié)束2 h后，麻醉下腹主動脈取血取上清，0.22 μm過濾器過濾后分裝，-70 ℃保存。

1.5 HPLC檢測活血散結(jié)方含藥血漿濃度

血漿樣本：兔正常組血漿分為a、b 2組，兔藥物組含藥血漿分為A、B、C、D、E 5組。采用HPLC法檢測活血散結(jié)方君藥三七、丹參相應(yīng)主要成分三七皂苷R1、丹參酮[4]含量。條件為乙腈-0.4%磷酸混合液(13:87)，0.45um濾膜抽濾，等梯度洗脫C18柱(Diamonsil，5μm，250×4.6 mm)，流速1.0 mL·min-1,柱溫25 ℃,檢測波長327 nm。

1.6 兔RPE細胞的培養(yǎng)

8只成年健康無眼疾青紫藍兔，空氣栓塞法處死，無菌條件下獲取眼球分離視網(wǎng)膜，胰酶消化法獲取RPE細胞，將其調(diào)整為(4～5)×104個·mL-1密度，接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在含5%CO2、濕度為90%的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進行傳代培養(yǎng)。

1.7 RPE細胞凋亡檢測

實驗分空白對照組(DMEM)、正常血漿組、PDGF(10 μg·L-1)組、PDGF(10 μg·L-1)+AG1296(10 μmol·L-1，PDGF抑制劑)組、PDGF(10 μg·L-1)+10%含藥血漿組、PDGF(10 μg·L-1)+20%含藥血漿組。采用雙標法流式細胞儀檢測，胰酶消化后收集對數(shù)生長期的RPE細胞，將細胞懸液密度調(diào)至5×105個·mL-1，取96孔板，根據(jù)分組每個孔板加入相應(yīng)細胞懸液1 mL，每孔再添加2 mL完全培養(yǎng)基，混勻后置于5% CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔內(nèi)細胞融合率達70%～80%后按分組加入相應(yīng)的干預(yù)試劑及藥物，48 h后收樣進行流式檢測。

1.8 Western blot檢測 caspase-3及P53表達

分組同上，上述同操作48 h后收樣進行western blot檢測。將樣本加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，4 ℃下充分裂解，刮入1.5 mLEP管，95 ℃加熱10 min，離心后取上清，蛋白定量后貯存于-80 ℃。取等量蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。膜封閉后加入一抗、二抗。ECL化學發(fā)光法檢測，IPP6.0軟件對圖像進行灰度值分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系及含量

分別精密吸取對照品溶液三七皂苷R1(0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mL)和丹參酮(0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL)，流動相定容至10 mL，得到系列濃度的對照品混合溶液，分別進樣3針，每次進樣20μL，記錄色譜圖(見圖1、2)。以對照品濃度為橫坐標(X)，對照品與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標(Y)進行線性回歸(見表1)。HPLC測定結(jié)果顯示，含藥血漿各組的三七皂苷R1含量及丹參酮含量均在線性范圍之內(nèi)，含藥濃度較理想。各組兔(不同兔含藥血漿標本)的三七皂苷R1含量及丹參酮含量穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表1 活血散結(jié)方中君藥主要成分線性考察結(jié)果

圖1 三七皂苷R1對照品HPLC-UV色譜圖

圖2 丹參酮對照品HPLC-UV色譜圖

表2 HPLC測定血漿樣本中三七皂苷R1及丹參酮含量結(jié)果

2.2 活血散結(jié)方含藥血漿對PDGF干預(yù)下RPE細胞凋亡的影響

各組加入相應(yīng)的干預(yù)因素后，流式細胞儀進行檢測。PDGF具有抑制RPE細胞凋亡的作用，PDGF組與正常血漿組比較，凋亡率明顯降低(P<0.01)；AG1296為PDGF的抑制劑，有促進RPE細胞凋亡的作用，PDGF+AG1296組RPE細胞凋亡率高于PDGF組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；10%和20%的含藥血漿均有提高RPE細胞凋亡率的作用，PDGF+10%含藥血漿組、PDGF+20%含藥血漿組的RPE細胞凋亡率均高于PDGF組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明2種濃度活血散結(jié)中藥復(fù)方含藥血漿均能促進RPE細胞凋亡。AG1296、10%和20%濃度的含藥血漿促進RPE細胞凋亡作用，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3圖3)。

表3 活血散結(jié)含藥血漿對PDGF干預(yù)下RPE細胞凋亡的影響

圖3 各組細胞凋亡圖譜

2.3 P53、Caspase-3蛋白表達

PDGF組中RPE細胞P53、Caspase-3蛋白相對表達量均低于正常血漿組(P<0.01)，表明PDGF有抑制RPE細胞P53、Caspase-3蛋白表達作用；PDGF+AG1296組中RPE細胞P53、Caspase-3蛋白相對表達量均高于PDGF組(P<0.01)，表明PDGF抑制劑AG1296有促進RPE細胞P53、Caspase-3蛋白表達的作用；PDGF+10%含藥血漿組和PDGF+20%含藥血漿組RPE細胞P53、Caspase-3蛋白相對表達量均高于PDGF組(P<0.01)，表明10%與20%濃度的含藥血漿均有促進RPE細胞P53、Caspase-3蛋白表達的作用，且AG1296、10%和20%濃度的含藥血漿3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4圖4)。

表4 活血散結(jié)含藥血漿對PDGF干預(yù)下RPE細胞P53、Caspase-3蛋白表達的影響

注：A.空白對照組；B.正常血漿組；C. PDGF組；D.PDGF+AG1296組；E.PDGF+10%含藥血漿組；F.PDGF+20%含藥血漿組圖4 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達比較

3 討論

國內(nèi)外研究證明，PVR發(fā)病機制是以細胞介導(dǎo)為主的損傷過度修復(fù)病理過程[5]，RPE細胞是PVR增殖膜中主要成分之一[6]，其遷移、增殖、凋亡等是促進PVR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，同時受細胞因子激活的蛋白質(zhì)細胞信號通路及相關(guān)基因表達的調(diào)控。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PVR患者的玻璃體以及增殖膜上PDGF大量表達[7]，Lei[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，PDGF受體α在PVR發(fā)生發(fā)展中的作用比PDGF受體β更為顯著，并證實PDGF的表達決定著細胞移行，繼之伴隨受體活化可促進PVR的發(fā)展。Ando等[9]在實驗中發(fā)現(xiàn)，G0、G1期的RPE細胞在PDGF的作用下容易進入分裂增生周期。在眼部，PDGF可促進RPE細胞表型變化和人RPE細胞α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達，而a-SMA的表達與PVR的病變程度密切相關(guān)[10，11]。特別是RPE細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細胞表達a-SMA后，增殖膜的收縮促成了PVR的最終轉(zhuǎn)歸—牽拉性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生，因此PDGF是PVR發(fā)展過程的關(guān)鍵因子。

在細胞凋亡中，p53與Caspase是凋亡信號傳導(dǎo)通路中的重要成員。Caspase-3是細胞凋亡途徑最后的共同通道[12]，也是細胞凋亡的執(zhí)行者。郭麗莉等[1]研究表明，整合素連接激酶在RPE細胞中被敲減后，隨著caspase-3的表達升高，RPE細胞凋亡也隨之增加。而正常野生型p53基因編碼后翻譯合成的p53蛋白，在細胞周期DNA合成前期即S期能發(fā)揮分子警察的重要功能，一旦發(fā)現(xiàn)DNA受損，隨即阻礙細胞周期運行并修復(fù)，如DNA修復(fù)失敗，p53則啟動細胞凋亡程序促進細胞死亡。Esser等[13]通過臨床與實驗研究發(fā)現(xiàn)，在PVR增殖膜中，RPE細胞不僅存在細胞增殖，還明顯存在凋亡的現(xiàn)象。管紅兵等[14]在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)，PVR病理過程中出現(xiàn)包含RPE細胞等多種細胞的凋亡，認為細胞凋亡也是PVR發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控機制。

PVR屬于中醫(yī)“暴盲” 病范疇，活血散結(jié)方由彭清華教授根據(jù)眼科活血利水法創(chuàng)立，轉(zhuǎn)為治療PVR而設(shè)，具有活血化瘀、軟堅散結(jié)之功[15-17]。組方中藥物多具有抗凝、抗纖維化、抑制細胞異常增殖及促進腫瘤細胞凋亡的作用。相關(guān)藥理學研究表明，三七中含有多種化學成分，其中三七素能降低毛細血管的通透性而增進凝血功能；三七人參三醇型皂苷能抑制血小板聚集，降低血液黏度；三七中最主要的化學成分三七皂苷能對肝纖維化起到預(yù)防和阻斷作用[[18,19]。丹參具有改善多臟器的缺血再灌注損傷、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制膠原纖維產(chǎn)生和促進纖維蛋白降解、抑制細胞增殖等多方面作用[20]。本實驗采用HPLC法測定制備的多組含藥血漿標本，結(jié)果表明各含藥血漿組三七皂苷R1及丹參酮含量均在線性范圍內(nèi)，含藥濃度較理想，故認為本次制備的含藥血漿成功。

從本次實驗結(jié)果得出PDGF能抑制兔RPE細胞凋亡，亦能抑制與凋亡相關(guān)的p53與Caspases-3蛋白的表達；推測PDGF可以通過抑制細胞凋亡，從而對RPE細胞過度增生分裂有促進作用，進而推動PVR的發(fā)展。結(jié)果還顯示，10%和20%濃度的含藥血漿均能提高PDGF干預(yù)下兔RPE細胞與凋亡相關(guān)的p53與Caspases-3蛋白表達，且存在一定的量效關(guān)系，與AG1296作用相當。表明活血散結(jié)方能通過提高caspase-3及P53蛋白的表達促進RPE細胞凋亡。

綜上，活血散結(jié)方含藥血漿作用于PDGF干預(yù)下RPE細胞增殖模型，可促進RPE細胞caspase-3及P53蛋白表達，從而增加細胞凋亡，進而達到阻止PVR進展的作用。前期研究亦證明，其能抑制RPE細胞增殖[2]，因此活血散結(jié)中藥復(fù)方可能通過雙重調(diào)節(jié)機制阻止PVR發(fā)生發(fā)展，有望成為臨床治療PVR的新藥。