高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中間苯二酚含量的不確定度評(píng)定

◎ 金 夢(mèng)，王 嵐，宋 陽(yáng)，官詠儀，張美金，鐘 鈺

（廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

間苯二酚（Resorcinol）有防腐殺菌的作用，可用作防腐劑，添加于化妝品和皮膚病藥物糊劑及軟膏中。間苯二酚對(duì)人體具有中等毒性，可引起腎臟損傷或其他中毒癥狀。因?yàn)殚g苯二酚的防腐作用，被用于小麥粉中作為改良劑。2017年底，原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告，要求加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管，嚴(yán)查小麥粉濫用食品添加劑的行為，其中包括小麥粉中禁止使用間苯二酚[1]。

本文采用《小麥粉中間苯二酚的測(cè)定 高效液相色譜法》（BJS 202009）[2]中小麥粉的檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006：2019）[3]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]，對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，包括建立數(shù)學(xué)模型，量化已識(shí)別來(lái)源的不確定度分量，確定方法的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度，為小麥粉中間苯二酚檢測(cè)的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。正確地評(píng)定小麥粉中間苯二酚，以保證測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AD高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器，日本島津公司）；D-78224 Singen超聲清洗儀（德國(guó)ELMA）；3-18K高速離心機(jī)(德國(guó)SⅠGMA)。

間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer）；甲醇（色譜純，廣州同源化工科技有限公司）；亞鐵氰化鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；乙酸鋅(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；市售小麥粉。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制間苯二酚質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。配制質(zhì)量濃度分別為 0.010 0 mg·L-1、0.020 0 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確到0.001 g）試樣于25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇旋渦混勻，超聲15 min，放置至室溫后加入1 mL亞鐵氰化鉀溶液和1 mL乙酸鋅溶液，用甲醇定容至刻度，混勻1 min。于7 000 r·min-1離心3 min，取適量上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜后供液相色譜測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（梯度洗脫）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；激發(fā)波長(zhǎng)273 nm，發(fā)射波長(zhǎng)304 nm。

1.5 建立數(shù)學(xué)模型

式中：X為試樣中間苯二酚的含量，mg·kg-1；c為由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)得出的試樣中間苯二酚質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為試樣提取液定容體積，mL；m為試樣稱(chēng)樣量，g。

考慮到樣品的均勻性、前處理的損失和污染、儀器變動(dòng)等因素影響結(jié)果的重復(fù)性f，應(yīng)在公式中加入重復(fù)性修正因子，則公式轉(zhuǎn)化為以下數(shù)學(xué)模型：

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度主要來(lái)源

根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF1059.1—2012）[4]評(píng)估小麥粉中間苯二酚的不確定度。其主要來(lái)源于間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（包括稱(chēng)重天平的校準(zhǔn)和重復(fù)性影響，定容器具校準(zhǔn)和重復(fù)性的影響）、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的擬合不確定度、試樣稱(chēng)重m（包括校準(zhǔn)、重復(fù)性的影響）、試樣定容（包括溫度、量具校準(zhǔn)和重復(fù)性影響）和試樣的含量測(cè)試重復(fù)性（樣品的均勻性、樣品前處理和儀器變動(dòng)影響）等幾個(gè)方面，不確定度分量的因果關(guān)系見(jiàn)圖1[5-7]。

2.2 量化已識(shí)別的不確定度分量

2.2.1 間苯二酚標(biāo)液的相對(duì)不確定度urel(Std)

（1）間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品純度的相對(duì)不確定度urel(P)。標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)給出間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.83%，按矩形分布考慮，a=0.085%，包含因子屬B類(lèi)評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度則標(biāo)準(zhǔn)品純度的相對(duì)不確定度

（2）間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品天平稱(chēng)重的相對(duì)不確定度urel(m標(biāo))。通過(guò)稱(chēng)重天平檢定證書(shū)給出最大稱(chēng)量的示值誤差測(cè)量結(jié)果U=0.02 mg（k=2），按正態(tài)分布采用B類(lèi)評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為線(xiàn)性不確定度分量應(yīng)重復(fù)計(jì)算2次，一次皮重，一次總重，產(chǎn)生的天平校準(zhǔn)引入的不確定度為標(biāo) 準(zhǔn) 品 稱(chēng) 量0.010 00 g，則標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)重時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為稱(chēng)量使用的電子天平期間核查記錄，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.31×10-6g，天平稱(chēng)重的重復(fù)性引入因此間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)重時(shí)引入urel(m標(biāo))=

（3）由配制間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的玻璃量具引入的相對(duì)不確定度urel(V)。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)程中使用了10 mL容量瓶（單標(biāo)線(xiàn)）、1 mL流出式分度吸量管和100 mL容量瓶（單標(biāo)線(xiàn)）[8]。依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[9]，A類(lèi)10 mL容量瓶允差為±0.02 mL，按三角形分布采用B類(lèi)評(píng)定，包含因子則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為8.17×10-3，則量具校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為量具重復(fù)性引入不確定度屬A類(lèi)評(píng)定，通過(guò)對(duì)典型的10 mL容量瓶充滿(mǎn)10次并稱(chēng)量統(tǒng)計(jì)得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 23 mL，充滿(mǎn)液體至容量瓶刻度的重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 為則10 mL容量瓶對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(dil1)=

同理計(jì)算A類(lèi)1 mL流出式分度吸量管允差為±0.008 mL，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差0.003 01 mL，則1 mL分度吸量管相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(dil2)=4.44×10-3；A類(lèi)100 mL單標(biāo)線(xiàn)容量瓶允差為±0.10 mL，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差0.019 7 mL，則100 mL容量瓶相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(dil3)=4.56×10-4。則配制標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的玻璃量具引入相對(duì)不確定度為：

綜合（1）、（2）及（3）中的不確定度分量，可以得到配制間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度為：

2.2.2 最小二乘法擬合曲線(xiàn)校準(zhǔn)得出樣液質(zhì)量濃度的不確定度urel(c0)

測(cè)定間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)液，其質(zhì)量濃度分別為 0.0100 mg·L-1、0.0200 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1， 各 1 次， 得 到 質(zhì) 量 濃度的峰面積響應(yīng)值分別為 44 528 Au·s、71 785 Au·s、348 101 Au·s、697 693 Au·s和 1 669 251 Au·s。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合得到線(xiàn)性回歸方程A=B1c+B0=3.323 81×106c+14 519.8。式中n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)量次數(shù)，本例為5。對(duì)樣品測(cè)試液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定次數(shù)為p，本例為2，得到二次測(cè)定峰面積響應(yīng)值結(jié)果為341 253 mV和339 381 mV，由直線(xiàn)方程求得平均質(zhì)量濃度c0=0.098 0 mg·L-1，本例標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度cj為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，則c0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則c0的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.3 小麥粉試樣稱(chēng)重m的不確定度urel(m樣)

根據(jù)電子天平檢定證書(shū)給出最大稱(chēng)量的示值誤差測(cè)量結(jié)果U=3 mg（k=2），標(biāo)準(zhǔn)不確定度為線(xiàn)性不確定度分量應(yīng)重復(fù)計(jì)算2次，一次是皮重，一次是總重，則引入的不確定度為試樣稱(chēng)重質(zhì)量m為5.000 g，則試樣稱(chēng)重m引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 小麥粉試樣前處理定容的不確定度urel(dil4)

試樣前處理定容采用容量瓶（單標(biāo)線(xiàn)25 mL），其不確定度包括校準(zhǔn)、溫度和重復(fù)性3個(gè)分量，其中重復(fù)性引入分量可合并入樣品測(cè)定重復(fù)性中。定容的不確定度分量表見(jiàn)表1。本例提取溶液為甲醇，操作溫度為（20±5）℃，20℃下甲醇的體積膨脹（α甲醇=1.18×10-3·℃-1）遠(yuǎn)比玻璃膨脹系數(shù)（α玻璃=2.5×10-5·℃-1）大，則溫度對(duì)定容體積影響為Vtemp=V甲醇-V定容=α甲醇×V×ΔT=1.18×10-3×25×5=0.148 mL，按矩形分布采用B類(lèi)評(píng)定，包含因子則溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 試樣前處理定容的不確定度分量表

因此，試樣前處理定容引入的不確定度為：

2.2.5 小麥粉試樣含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)不確定度

由于試樣均勻性、前處理?yè)p失和儀器影響等因素都會(huì)引入不確定度，可將這些考慮包含在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)內(nèi)，通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)估重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度。在同等條件下對(duì)試樣進(jìn)行6次加標(biāo)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，測(cè)試含量分別為 0.500 mg·kg-1、0.492 mg·kg-1、0.512 mg·kg-1、0.502 mg·kg-1、0.509 mg·kg-1和0.504 mg·kg-1，平均值為 0.503 mg·kg-1。按 A 類(lèi)評(píng)定計(jì)算。試樣標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.007 05，算術(shù)平均值標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度試 樣含量測(cè)定重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.6 不確定度的合成及擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

小麥粉中間苯二酚含量測(cè)定不確定度的來(lái)源及測(cè)量值結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)所得小麥粉中間苯二酚的含量x為0.503 mg·kg-1，則測(cè)量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 測(cè)量不確定度分量表

按95%置信概率，取包含因子k=2，測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度為U=2u(x)≈0.035 mg·kg-1，測(cè)量間苯二酚含量可表示為（0.503±0.035）mg·kg-1（k=2）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中間苯二酚的含量不確定度的評(píng)定方法建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)整個(gè)測(cè)量過(guò)程不確定度來(lái)源進(jìn)行量化分析，可以判斷出不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合和試樣含量測(cè)試的重復(fù)性試驗(yàn)所產(chǎn)生的不確定度，其次為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制產(chǎn)生的不確定度，其他因素影響相對(duì)較小。最終得出小麥粉中間苯二酚的含量為（0.503±0.035）mg·kg-1，擴(kuò)展不確定度為 0.035 mg·kg-1（k=2）。為獲得較小的不確定度測(cè)定結(jié)果，應(yīng)控制好關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要包括盡量選用質(zhì)量好、校準(zhǔn)合格的量具，分析人員熟練方法，規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，注意樣品的均勻性，對(duì)分析天平和液相色譜儀定期校準(zhǔn)維護(hù)保養(yǎng)，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)和試樣含量的測(cè)量次數(shù)，以減少標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和試樣重復(fù)性的不確定度，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。