不同酵母發(fā)酵蘋果冰酒香氣成分分析

◎ 白啟正，趙志聰，連 琛，安貴陽

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 咸陽 712100）

蘋果冰酒是借鑒傳統(tǒng)冰酒釀造工藝的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合水果和果酒的特點(diǎn)，創(chuàng)新出的一種全新的果酒品種。加拿大對蘋果冰酒的定義是通過發(fā)酵高糖度（白利糖度＞30%）的濃縮蘋果汁，使其殘余糖度≥130 g·L-1，酒精度在7%～13%的果酒。其生產(chǎn)過程不添加糖、酒精、人工色素或香料。冰蘋果酒具有清香可口、甘甜醇厚、冷藏后甘甜爽口的特點(diǎn)[1-3]。酵母是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，不同的酵母菌株種類酶活性存在差異，對所處發(fā)酵條件環(huán)境的適應(yīng)力不同，導(dǎo)致每個(gè)酵母菌種的特性不同，由其發(fā)酵產(chǎn)物代謝的糖、酸、甘油和香氣成分也會(huì)有所不同[4-5]。在蘋果冰酒生產(chǎn)過程中，需要選擇具有優(yōu)良性狀的酵母，能產(chǎn)生足夠的香氣成分。在果酒的發(fā)酵過程中，酵母在利用糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)酒精的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，如甘油、高級醇類等[6-7]。這些代謝物包括有機(jī)酸、醇類、酯類、酮類、烷烴和胺類物質(zhì)[8]。酵母菌株對蘋果酒的香氣物質(zhì)有著重要的影響，酵母的選擇是優(yōu)化釀造工藝的重要組成部分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果，品種為延長紅，產(chǎn)于陜西省洛川縣西北農(nóng)林科技大學(xué)蘋果試驗(yàn)站。7種市售酵母如下所示。歐法朗斯低溫發(fā)酵冰葡萄酒酵母（La Fruitee，以下簡稱La-Fu），法國Sofralab公司；歐法郎斯芳香型葡萄酒酵母（L’Eclatante，以下簡稱L-Ec），法國Sofralab公司；葡萄酒釀酒酵母F33（Actiflore F33，以下簡稱F33），法國LAFFORT公司；安琪葡萄酒果酒專用酵母RW（以下簡稱RW），安琪酵母股份有限公司；安琪葡萄酒果酒專用酵母SY（以下簡稱SY），安琪酵母股份有限公司；白葡萄酒酵母X5（Zymaflore X5，以下簡稱X5），法國LAFFORT公司；干白葡萄酒酵母X16（Zymaflore X16，以下簡稱X16），法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；RDN-1000D-4型人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；Uni Bloc電子天平，日本Shmadzu公司；HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱，美國Agilent公司；SPME手柄、57329-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

冰蘋果汁中分別接種7種酵母，綜合比較蘋果冰酒的理化和感官指標(biāo)，篩選出適合洛川地區(qū)蘋果冰酒發(fā)酵的酵母菌種。

1.3.2 蘋果冰酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

蘋果酒發(fā)酵工藝為冰蘋果帶冰采摘→分選→破碎、榨汁→護(hù)色、殺菌→調(diào)糖、調(diào)酸→酵母活化、接種酵母→密封發(fā)酵→過濾、澄清→蘋果冰酒。

（1）原料的采摘與分選。原料選自西北農(nóng)林科技大學(xué)洛川蘋果試驗(yàn)站延長紅品種，在自然條件下結(jié)冰完成蘋果糖分的富集（環(huán)境溫度低于-10 ℃）。帶冰采摘，去除霉?fàn)€果。

（2）冰蘋果發(fā)酵汁的制備。冰蘋果分選后，用旋轉(zhuǎn)式去核機(jī)將冰蘋果去核并切分為塊狀，再利用破壁機(jī)將原料在低溫條件下榨汁，不加水（環(huán)境溫度低于-4 ℃）。榨取后的冰蘋果汁靜置4 h，之后用12層紗布過濾2次，對得到的汁液進(jìn)行糖度測定，此時(shí)Brix值為為23，通過調(diào)糖將Brix值調(diào)整為30；加入檸檬酸將發(fā)酵汁的pH調(diào)到3.5。

（3）果汁處理。向果汁中加入偏重亞硫酸鉀（120 mg·g-1），偏重亞硫酸鉀是一種食品抗氧化、抑菌劑，可為果汁中提供SO2，達(dá)到護(hù)色、抑菌的效果。

（4）酵母活化。將購得的7種酵母干粉按照酵母∶水=1∶10的比例加入35～40 ℃的純凈水，再加入3%的糖加速活化過程，輕輕攪拌后靜置15 min，之后再次攪拌，待30 min泡沫豐富后酵母活化完成，加入果酒中。

（5）發(fā)酵過程。發(fā)酵溫度20 ℃，酵母添加量為0.45 g·L-1，在密閉發(fā)酵瓶中進(jìn)行發(fā)酵。

（6）終止發(fā)酵。以Brix值降到15為發(fā)酵終點(diǎn)，向果酒中加入120 mL/100 L偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵。從第8 d開始每天測定Brix值，記錄不同酵母發(fā)酵果酒發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 香氣成分測定

吸取樣品酒樣8 mL于15 mL的微萃取專用萃取瓶中，加入2 g NaCl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（稀釋500倍的50 mg·L-1的三辛醇溶液），40 ℃條件下平衡15 min，插入已老化的萃取頭頂空吸附30 min。萃取完成后，取出萃取頭迅速插入氣相色譜儀進(jìn)樣口在260 ℃條件下解吸3min。

1.3.4 儀器條件

（1）氣相色譜條件。色譜柱為HP-ⅠNNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為He氣（純度99. 999%）；柱流量1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度260 ℃。色譜柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持3 min，然后以3.5 ℃·min-1升至120 ℃，保持3 min；再以13 ℃·min-1升至260 ℃，保持3 min。采用不分流方式進(jìn)樣。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式EⅠ，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～500 amu；離子源溫度240 ℃；接口溫度240 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)保留指數(shù)法進(jìn)行定性分析。利用自動(dòng)質(zhì)譜圖解卷積和鑒定系統(tǒng)（Automatic Mass Spectral Deconvolution and Ⅰdentification System，AMDⅠS） 建立保留指數(shù)校正庫，利用保留指數(shù)及NⅠST11質(zhì)譜庫，比對在同樣極性色譜柱條件下測得的香氣成分保留指數(shù)結(jié)果，從而進(jìn)行定性。將定性結(jié)果依據(jù)可信度強(qiáng)弱進(jìn)行分類并詳細(xì)記錄，確定各化學(xué)成分。采用峰面積歸一法求得各香氣組分在果實(shí)總體香氣物質(zhì)中的相對百分含量。試驗(yàn)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）提取7種酵母發(fā)酵蘋果酒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，結(jié)果如表1、表2所示。從7個(gè)酵母品種發(fā)酵酒中共鑒定出44種化合物，包括酯類19種，有機(jī)酸類5種，醇類13種，其他類7種，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、異戊酸己酯、辛酸乙酯、順式-4-辛烯酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸脂、十三烷酸乙酯、癸酸異戊酯、肉豆蔻酸乙酯、2-甲基丁酸、辛酸、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇、蘑菇醇、正辛醇、順式5-辛烯-1-醇、芐醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、癸醛、草蒿腦及八甲基硅油這28種是7種酵母所發(fā)酵蘋果酒共有的揮發(fā)性成分，但在不同品種酵母的發(fā)酵酒中含量有所差異。

表1 7種酵母發(fā)酵酒中香氣成分測定結(jié)果表

續(xù)表1

表2 7種酵母發(fā)酵酒揮發(fā)性香氣成分種類及相對含量表（單位：%）

2.2 不同酵母發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的種類和相對含量分析

在不同酵母品種發(fā)酵蘋果酒中主要揮發(fā)性香氣成分的種類和含量也有較大的差別。在7種酵母品種中，La-Fu所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類最多，達(dá)到了39種，總相對含量達(dá)到93.94%，是7種酵母發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對含量最高的酵母品種；L-Ec酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有37種，相對含量達(dá)到了91.10%；F33酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有34種，相對含量達(dá)到了83.08%，是7種酵母發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對含量最低的酵母品種；RW酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有36種，相對含量達(dá)到了88.99%；SY酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有34種，相對含量達(dá)到了90.56%；X5酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有32種，相對含量達(dá)到了90.98%；X16酵母所發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)有35種，相對含量達(dá)到了86.31%。

2.3 不同酵母發(fā)酵蘋果酒中揮發(fā)性香氣成分的分析

2.3.1 醇類物質(zhì)

醇類化合物是在酒精發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞分解氨基酸或糖類物質(zhì)產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，對果酒的香型起著重要作用[9]。在7組酵母發(fā)酵果酒中共檢測到13種醇類化合物，La-Fu酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)為13種，醇類物質(zhì)種類最多，香氣最為豐富。L-Ec酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)為11種。F33酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)有11種，醇類物質(zhì)含量占比是7種酵母發(fā)酵酒中最高的，占香氣物質(zhì)的46.70%。RW酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)有10種。SY酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)有9種。X5酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)有10種。X16酵母發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)有9種。高級醇不僅使蒸餾酒呈現(xiàn)香氣還是醇甜和助香的主要物質(zhì)來源。四氫薰衣草醇是La-Fu和L-Ec酵母發(fā)酵酒中特有的醇類香氣物質(zhì)，其具有薰衣草樣花香香氣，帶有青草的辛香氣息，豐富了這兩種酵母發(fā)酵酒中香氣組成。順-4-癸烯-1-醇是La-Fu、L-Ec、RW 3種酵母發(fā)酵蘋果酒中特有的醇類香氣物質(zhì)。在所有檢測到醇類物質(zhì)中含量占比最多的是異戊醇，異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。我國GB 2760—2014規(guī)定其為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果和香蕉型香精。La-Fu、F33和RW這3種酵母發(fā)酵酒中異戊醇含量較高，分別為34.20%、35.90%和35.27%，具有濃重的蘋果香氣。香茅醇和D-香茅醇具有甜玫瑰香，在La-Fu和F33兩種酵母發(fā)酵酒中檢測到了香茅醇和D-香茅醇，X5酵母發(fā)酵酒中含有D-香茅醇。

2.3.2 酯類物質(zhì)

酯類物質(zhì)是發(fā)酵酒中主要的呈味和呈香化合物，各種酯類具有不同的花香和水果香，如乙酸乙酯具有菠蘿甜果味；丙酸乙酯有水果香；己酸乙酯有甜香、水果香、窖香；辛酸乙酯具有水果香氣，并有菠蘿、蘋果樣的香韻和白蘭地的酒香味；壬酸乙酯有玫瑰香、果香、酒香；癸酸乙酯具有葡萄果香、脂肪香、酒香；肉豆蔻酸乙酯具有鳶尾油香、油脂味[10]。

酯類物質(zhì)在7種發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測出19種，其中La-Fu有15種，相對含量占43.79%；L-Ec有16種，相對含量占49.13%；F33有15種，相對含量占30.46%；RW有18種，相對含量占41.42%；SY有18種，相對含量占56.93%，酯類物質(zhì)相對含量在七種酵母發(fā)酵物中最多；X5有16種，相對含量占50.42%；X16有18種，相對含量占45.52%。酯類物質(zhì)中含量較高的為正己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙基9-癸烯酸脂，相對含量見圖1。酯類物質(zhì)中含量最高的是辛酸乙酯，帶來濃重的果香味與白蘭地酒香味，7種酵母發(fā)酵酒中辛酸乙酯相對含量分別為18.52%、20.70%、12.96%、17.25%、24.31%、22.64%和18.82%。

2.3.3 有機(jī)酸類

有機(jī)酸類對蘋果酒香氣也有一定的影響，在7種酵母發(fā)酵酒中共檢測到有機(jī)酸類物質(zhì)5種。其中，La-Fu酵母發(fā)酵酒中5種物質(zhì)都含有，總含量占2.665%；L-Ec酵母發(fā)酵酒中含有4種有機(jī)酸類物質(zhì)，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸，總含量占1.84%；F33酵母發(fā)酵酒中有4種有機(jī)酸類物質(zhì)，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸，總含量占2.56%；RW酵母發(fā)酵酒中檢測出3種有機(jī)酸類物質(zhì)，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.89%；SY酵母發(fā)酵酒中檢測到3種有機(jī)酸類物質(zhì)，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.61%；X5酵母發(fā)酵酒中只檢測到2種有機(jī)酸類物質(zhì)，2,4-二甲氧基肉桂酸、異己酸和乙酸都未檢測到，總含量占1.08%；X16酵母發(fā)酵酒中檢測到3種有機(jī)酸類物質(zhì)，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.50%。有機(jī)酸類物質(zhì)中含量最高的是辛酸，辛酸天然存在于蘋果中，呈水果香氣，可用于香料、殺菌劑的合成。

2.3.4 其他類物質(zhì)

檢測到的其他類物質(zhì)包括烯烴類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、酮醛類物質(zhì)、醚類物質(zhì)及烷類物質(zhì)。在7種酵母發(fā)酵酒中共檢測到7種其他類物質(zhì)，其中，La-Fu酵母發(fā)酵酒中檢測出6種，占1.96%，沒有檢測到壬醛；L-Ec酵母發(fā)酵酒中檢測出6種，占2.21%，沒有檢測到3,5-二叔丁基苯酚，壬醛是該酵母發(fā)酵酒中特有的其他類物質(zhì)；F33酵母發(fā)酵酒中檢測出4種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚，其余總量占3.27%；RW酵母發(fā)酵酒中檢測出5種，沒有檢測到3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占1.37%；SY酵母發(fā)酵酒中檢測出4種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占0.71%；X5酵母發(fā)酵酒中檢測出4種，種類和SY酵母發(fā)酵酒一樣，總量占0.93%；X16酵母發(fā)酵酒中檢測出5種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占0.73%。

3 結(jié)論

大量的研究表明，不同的酵母因?qū)τ诓煌后w環(huán)境適應(yīng)力與特性不同，在發(fā)酵時(shí)，可以使發(fā)酵酒體表現(xiàn)出不同的香氣與口感，為酒體帶來不同的復(fù)雜度與豐富度，給予酒體獨(dú)特性。本研究表明，在不同酵母品種發(fā)酵蘋果酒中主要揮發(fā)性香氣成分的種類和含量也有較大的差別，La-Fu酵母所發(fā)酵酒中香氣成分物質(zhì)種類最多，相對含量占比最大，酯類、醇類物質(zhì)相對含量較高，風(fēng)味豐富，是釀造蘋果冰酒的優(yōu)秀酵母種類。