尿液HPV檢測(cè)在宮頸癌篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值

宋金維，王建東

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦瘤科，北京 100026； 2.北京市西城區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，北京 100054)

根據(jù)2018年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界每年有超過(guò)32萬(wàn)的女性死于宮頸癌，其中85%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染已被流行病學(xué)和生物學(xué)證明是引起宮頸癌及癌前病變的必要因素[2]，但一定比例的女性由于主觀或客觀原因錯(cuò)過(guò)早期診斷機(jī)會(huì)，因此選擇一個(gè)舒適性更強(qiáng)、更簡(jiǎn)便的、可以由患者自行采樣的檢查方式可以提高宮頸癌前病變的診斷率，避免患者的不良預(yù)后[3]。感染HPV的子宮頸上皮細(xì)胞脫落后隨著宮頸分泌物進(jìn)入陰道內(nèi)，這些分泌物積聚在陰道口和小陰唇附近，當(dāng)患者排尿時(shí)，尿液會(huì)將這些上皮細(xì)胞沖走，因此尿液中可以檢測(cè)出HPV DNA[4]。多項(xiàng)研究顯示，尿液標(biāo)本與宮頸標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果有相當(dāng)?shù)囊恢滦訹5-6]，且具有非侵入性、無(wú)創(chuàng)傷性、方便易行等優(yōu)點(diǎn)，在不方便進(jìn)行宮頸侵入性篩查方面顯現(xiàn)出絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)[7-9]。本研究旨在通過(guò)對(duì)符合條件的患者留取初段晨尿標(biāo)本，在陰道鏡檢查前取宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，分別進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，探討尿液HPV檢測(cè)在宮頸癌篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值，為宮頸癌的篩查提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月1日至2018年3月31日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診的498例患者的尿液標(biāo)本及宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～60歲；②具有完整子宮；③異?；虿淮_定的宮頸癌篩查結(jié)果[宮頸細(xì)胞學(xué)異常和(或)宮頸HPV高危型陽(yáng)性]或癥狀、體征提示宮頸癌可疑或不明原因的陰道異常出血、排液等需要進(jìn)一步陰道鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有臨床妊娠的可疑癥狀；②有泌尿系統(tǒng)腫瘤；③子宮切除史；④宮頸外科手術(shù)史；⑤盆腔放療史；⑥相關(guān)數(shù)據(jù)缺乏；⑦拒絕參與或拒絕簽署留取相關(guān)標(biāo)本知情同意書。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：2017-KY-042-01)，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1尿液標(biāo)本HPV DNA提取 ①尿液的留取：在72 h內(nèi)無(wú)性生活、無(wú)陰道出血、無(wú)陰道沖洗和陰道上藥前提下，于陰道鏡檢查當(dāng)日患者自取初段晨尿約10 ml置于尿液自取裝置的管中(管內(nèi)有固定液)送檢。②尿液的保存：尿液+緩沖液，混勻，過(guò)濾，20 min離心濃縮，同一患者尿液分為3份，分別室溫、4 ℃和-20 ℃保存。隨機(jī)抽取3例患者，共9份標(biāo)本先采用離心柱法提取尿液中的HPV DNA，然后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示3例患者9份尿液標(biāo)本的合格率為100%，均成功完成檢測(cè)，室溫、4 ℃和-20 ℃保存的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)采用4 ℃保存，長(zhǎng)期保存則放入-20 ℃。③尿液HPV DNA提?。耗蛞簶?biāo)本離心，去上清，加入蛋白酶K，混勻；加入細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，15～20 min，期間顛倒混勻數(shù)次，溫浴后加入異丙醇充分混勻，轉(zhuǎn)入帶硅膠柱的離心管中，9 500×g離心1 min，棄液；重復(fù)離心；更換離心管，放入吸附柱，靜置1～2 min，吸附柱中加入洗脫緩沖液洗脫，靜置2～5 min，11 500×g離心2 min，棄柱得HPV DNA。

1.2.2宮頸標(biāo)本HPV DNA提取 ①宮頸標(biāo)本采集及保存：陰道鏡醫(yī)師使用一次性宮頸脫落細(xì)胞采集器置于宮頸口，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈，將宮頸脫落細(xì)胞固定于標(biāo)本管內(nèi)，做好標(biāo)識(shí)并送檢。如不能立刻送檢標(biāo)本，則4 ℃保存，并于2周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。剩余標(biāo)本于-20 ℃保存液中保存?zhèn)洳?，保存期?個(gè)月。凍融次數(shù)不超過(guò)7次，標(biāo)本運(yùn)送采用低溫保存運(yùn)輸。②宮頸HPV DNA提取：宮頸標(biāo)本離心，棄上清液，加入細(xì)胞保存液重懸細(xì)胞，16 100×g離心1 min，棄上清液；加入細(xì)胞裂解液，充分振蕩重懸細(xì)胞，煮沸10 min，16 100×g離心10 min,保留上清液備用(上清液中為釋放的HPV DNA)。

1.2.3宮頸及尿液HPV分型檢測(cè) 將提取到的HPV DNA采用廣東凱普生物有限公司提供的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)(聚合酶鏈反應(yīng)混合液+DNA聚合酶+DNA)完成所有標(biāo)本的23種HPV分型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、53、73、82、6、11、42、43、44、81)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，以宮頸HPV為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算尿液HPV檢測(cè)的靈敏度、特異度及其95%CI，尿液和宮頸HPV檢測(cè)采用Kappa分析[10]行一致性檢驗(yàn)，Kappa<0，代表一致性極差，Kappa 0～0.20，代表一致性微弱；Kappa 0.21～0.40，代表一致性弱；Kappa 0.41～0.60，代表一致性中等；Kappa 0.61～0.80，代表一致性強(qiáng)；Kappa 0.81～1.00，代表一致性極強(qiáng)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同型別HPV在尿液和宮頸標(biāo)本中的陽(yáng)性分布 配對(duì)收集合格的498例尿液和宮頸標(biāo)本用于分析，宮頸標(biāo)本中HPV陽(yáng)性率為83.73%(417/498)，尿液標(biāo)本中HPV的陽(yáng)性率為79.12%(394/498)。在23種HPV分型檢測(cè)(16、18 、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、53、73、82、6、11、42、43、 44、81)中，宮頸和尿液標(biāo)本中檢測(cè)到的前3位常見(jiàn)類型分別是HPV16、HPV58、HPV52；高致病性HPV18型在宮頸和尿液標(biāo)本中的陽(yáng)性率分別為8.43%(42/498)和8.03%(40/498)。不同型別HPV在尿液和宮頸標(biāo)本中的陽(yáng)性分布見(jiàn)表1。

表1 不同型別HPV在498例尿液和宮頸標(biāo)本中的陽(yáng)性分布 [例(%)]

續(xù)表1

2.2尿液與宮頸HPV(9個(gè)型別)檢測(cè)的一致性比較 以宮頸HPV分型為標(biāo)準(zhǔn)，選擇與HPV九價(jià)疫苗相對(duì)應(yīng)的9個(gè)型別(6、11、16、18、31、33、45、52、58)分析尿液與宮頸標(biāo)本的一致性及尿液HPV的靈敏度和特異度。498例陰道鏡患者尿液標(biāo)本的合格率為100%。在9個(gè)HPV型別中，尿液HPV檢測(cè)的靈敏度為68.75%～100.00%，特異度為96.13%～99.80%，一致性Kappa值為0.666～0.858，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。HPV6、11、31、33、45、52型的Kappa值為0.666～0.770，一致性強(qiáng)；HPV16、18、58型的Kappa值為0.838～0.858，一致性極強(qiáng)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。見(jiàn)表2。

3 討 論

宮頸癌病因?qū)W的肯定使HPV檢測(cè)在全世界得到了廣泛推廣應(yīng)用。目前高危型HPV的檢測(cè)方法基本均為侵入性，該方法存在以下問(wèn)題：許多女性認(rèn)為侵入性婦科檢查不舒服甚至疼痛、令人難堪，故依從性差；交通不便、工作繁忙、醫(yī)院檢測(cè)程序煩瑣也使得部分女性未參與檢測(cè)；對(duì)宮頸癌篩查的意識(shí)不足、缺乏健康教育和普查知識(shí)也使得大部分人群不參加檢測(cè)[11]。這些嚴(yán)重降低了女性HPV篩查的

表2 尿液與宮頸HPV(9個(gè)型別)檢測(cè)的一致性比較

依從性，尤其是接種疫苗后的青少年、妊娠婦女、受宗教文化和信仰影響的女性。因此，研究一種取樣方便、依從性好、靈敏度高、特異度佳的HPV檢測(cè)方法成為子宮頸癌防治研究中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

國(guó)外一項(xiàng)薈萃分析顯示，與宮頸HPV檢測(cè)相比，尿液HPV檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為87%和94%[12]。本研究中尿液HPV檢測(cè)的靈敏度為68.75%～100%，特異度為96.13%～99.80%，其中尿液HPV11、16、45、58型的靈敏度與上述研究相當(dāng)，HPV18、31、33、52、6型的靈敏度均略低于上述研究。本研究對(duì)于高致病性的HPV16型和18型，尿液的靈敏度分別為88.18%和83.33%，特異度分別為96.13%和98.90%，Kappa值分別為0.838和0.841(P<0.001)，提示尿液HPV有較好的靈敏度和特異度。使用初段晨尿標(biāo)本而不是隨機(jī)或中段尿標(biāo)本，以及在標(biāo)本采集和HPV DNA檢測(cè)中采取一些預(yù)防措施可大大提高靈敏度[13]。

巴西的一項(xiàng)橫斷面研究中，通過(guò)從妊娠的婦女中自行收集尿液和陰道標(biāo)本，對(duì)高危型HPV(16、18、31、33、39、45、59)進(jìn)行檢測(cè)，尿液和陰道標(biāo)本的HPV DNA檢測(cè)結(jié)果基本一致(P<0.000 1)[14]，表明尿液可能是孕婦HPV檢測(cè)的可靠標(biāo)本。本研究中HPV6、11、31、33、45、52型的Kappa值為0.666～0.770(P<0.001)，與上述研究相當(dāng)；其余3個(gè)分型(16、18、58)的Kappa值均大于0.810，最高為0.858(P<0.001)，其一致性高于上述研究。尿液HPV檢測(cè)具有非侵入性、取樣方便等特點(diǎn)，使得妊娠期婦女有更高的HPV篩查依從性。一項(xiàng)研究表明，人類免疫缺陷病毒感染的女性由于免疫抑制等導(dǎo)致HPV感染率增加，從而導(dǎo)致發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。Ferenczy等[16]報(bào)道，人類免疫缺陷病毒陽(yáng)性的女性留取尿液行HPV檢測(cè)，并與宮頸標(biāo)本配對(duì)比較，發(fā)現(xiàn)HPV感染的一致性為73.6%。Munoz等[17]對(duì)人類免疫缺陷病毒感染的婦女使用自我采集的尿液標(biāo)本與宮頸標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HPV的靈敏度為68.8%，特異度為50.0%。由此可見(jiàn)，在宮頸癌控制和預(yù)防項(xiàng)目中，如何提高覆蓋率、采樣率、依從性和隨訪率，特別是那些呈現(xiàn)某種免疫抑制類型的婦女起著決定性的作用。自我采樣方法(如尿液采樣)因診斷性能良好且女性的接受度高，可作為預(yù)防病理學(xué)的有效方式。

Vorsters等[18]對(duì)注射HPV疫苗后女性的尿液標(biāo)本和血清標(biāo)本中HPV抗體滴度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示尿液中IgA和IgG含量約是血清中的0.15%和0.35%，與未注射疫苗的女性相比，注射疫苗的女性HPV16、6、11、18型的抗體含量顯著增加，提示疫苗可增加尿液中的抗體，可以考慮使用尿液進(jìn)行HPV疫苗效果評(píng)價(jià)。本研究中，尿液標(biāo)本中HPV16、58、53、81、51、59、39、43、6、45、35、11型的陽(yáng)性率均高于宮頸標(biāo)本，HPV44型的尿液和宮頸標(biāo)本陽(yáng)性率相等，均為4.42%。從長(zhǎng)期來(lái)看，高敏感性的尿液HPV檢測(cè)可能會(huì)促進(jìn)高覆蓋率的HPV疫苗接種計(jì)劃[19]。我國(guó)人群的HPV感染統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)基本都是源于醫(yī)院就診和體檢，缺少基于社區(qū)人群的有代表性的全國(guó)性數(shù)據(jù)。HPV感染除可導(dǎo)致宮頸癌外，還可引起外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、喉癌、口腔癌和口咽癌等，目前國(guó)內(nèi)流行病學(xué)方面此類研究較少。因此，我國(guó)人群HPV感染的全國(guó)性數(shù)據(jù)、疾病負(fù)擔(dān)、流行病學(xué)等研究需進(jìn)一步規(guī)范化、系統(tǒng)化開(kāi)展[20]。一項(xiàng)研究分析顯示，以預(yù)防宮頸癌為價(jià)值標(biāo)準(zhǔn)，液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合HPV高危分型篩查效果最好[21]，HPV高危分型篩查成本效果最優(yōu)。篩查人群的接受度和依從性變化影響篩查方案的成本效果，且初篩接受率和陰道鏡轉(zhuǎn)診率的變化將影響結(jié)果排序。因此，提高人群的依從性和接受度，有利于完善我國(guó)宮頸癌防控體系，從而有效提高宮頸癌的防治效果。

有文獻(xiàn)研究顯示，自收集尿液進(jìn)行HPV檢測(cè)是監(jiān)測(cè)HPV流行狀況和女性HPV疫苗接種效果的宮頸取樣的一種潛在替代方法。尿液HPV檢測(cè)可能彌補(bǔ)宮頸HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查的不足[22]。但是尿液采樣、儲(chǔ)存條件、DNA提取和DNA擴(kuò)增檢測(cè)均可能對(duì)HPV DNA檢測(cè)和檢測(cè)到的病毒DNA形式產(chǎn)生重要影響，從而導(dǎo)致在各研究中尿液HPV檢測(cè)的靈敏度和特異度有較大差異。

綜上所述，尿液HPV與宮頸HPV檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查有較好的一致性，適用于不具備侵入性宮頸HPV檢測(cè)的宮頸癌早期篩查及HPV疫苗接種后的效果評(píng)價(jià)，可有效地預(yù)防和減少女性宮頸癌的發(fā)生，從而保證廣大婦女的身體健康。