外周血RNF180基因甲基化檢測在胃癌臨床診斷中的研究進展

趙路瑤，李慕然，劉艷迪

(1.南開大學醫(yī)學院，天津 300071； 2.天津市人民醫(yī)院消化科，天津 300121)

胃癌具有高發(fā)病率、高病死率的特點，2018年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告指出，胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第3位[1]。近年來，我國胃癌的發(fā)病率有所下降，但人口增長和老齡化導致的新發(fā)病例數(shù)量大幅上升。胃癌是我國第三大惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤的第2位[2]。我國胃腸道惡性腫瘤的相關(guān)死亡率明顯高于西方國家，其主要原因為確診較晚，約80%的胃癌患者確診時已為中晚期，即使接受以手術(shù)為主的綜合治療，5年生存率僅為30%～40%[3]。而早期胃癌患者的5年生存率超過90%[4]。因此，在臨床前或癥狀前階段發(fā)現(xiàn)并確診是成功治療和改善胃癌患者預后的關(guān)鍵。

目前，胃癌的確診仍依靠胃鏡下病變組織的病理組織檢查，而胃癌分期分級依賴影像學檢查。內(nèi)鏡與影像學檢查均受診斷醫(yī)師經(jīng)驗、水平等因素的影響，缺乏量化標準。臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原、糖類抗原(carbohydrate antigen，CA)19-9和CA72-4等雖然可以量化，但其胃癌檢出率僅約20%[5-6]。因此，迫切需要尋找簡便易行、敏感高效的胃癌檢測手段。環(huán)指蛋白(ring finger protein，RNF)180基因是一種抑癌基因，其甲基化與多種惡性腫瘤的惡性生物學行為相關(guān)[7-11]。外周血RNF180基因甲基化水平診斷胃癌的靈敏度和特異度較高，可能成為胃癌特異性生物標志物[7]。現(xiàn)對外周血RNF180基因甲基化檢測在胃癌臨床診斷中的研究進展予以綜述，以期為RNF180基因甲基化檢測在胃癌診斷中的價值提供新的理論基礎和研究方向。

1 RNF180概述

RNF180基因在人類基因組中定位于5q12.3，是一種受DNA甲基化調(diào)控的抑癌基因[12]。由RNF180基因編碼的RNF180蛋白與其他RNF家族成員均具有E3泛素連接酶活性，且屬于環(huán)指型E3s，其結(jié)構(gòu)含有1個環(huán)指結(jié)構(gòu)域、1個堿基卷曲結(jié)構(gòu)域(兩者可與蛋白質(zhì)結(jié)合)、1個保守結(jié)構(gòu)域(DSPRC)和1個被預測為跨膜區(qū)的C端疏水區(qū)[13]。見圖1。

注：DSPRC為新保守結(jié)構(gòu)域，basic coiled-coil domain為基本螺旋結(jié)構(gòu)域，RING finger domain為環(huán)指結(jié)構(gòu)域，TM為C端疏水區(qū)

在泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)中，經(jīng)過E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶等參與的具有高度特異性的級聯(lián)酶促反應作用后，泛素化蛋白質(zhì)最終被26S蛋白酶體降解，以保持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的動態(tài)平衡[14]。RNF180是E3泛素連接酶的成員，在UPS的功能中起著關(guān)鍵作用，決定了UPS泛素化的靶向特異性和時序性以及隨后蛋白質(zhì)的降解過程[13,15]。同時，RNF180通過對自身泛素化進行自我調(diào)節(jié)，避免細胞內(nèi)E3泛素連接酶濃度過高。RNF180參與了多種生理和病理過程，通過介導蛋白降解在細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄及修復中發(fā)揮不可替代的作用，如腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄活化因子、細胞周期調(diào)節(jié)因子以及突變產(chǎn)生的癌蛋白或受損蛋白質(zhì)是UPS泛素化降解的靶蛋白[16]。當RNF180基因甲基化時，RNA聚合酶不能有效地與RNF180啟動子結(jié)合，從而導致轉(zhuǎn)錄抑制、翻譯受損[17]，RNF180表達減少，引起E3泛素連接酶功能障礙和UPS失調(diào)，失調(diào)的UPS可終止蛋白質(zhì)降解過程，引起細胞代謝紊亂，機體蛋白質(zhì)降解受限達到一定水平時，可能導致腫瘤的發(fā)生。此外，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，甲基化累積持續(xù)進行，最終導致多種惡性生物學行為產(chǎn)生[18]。

2 RNF180相關(guān)的癌癥作用機制

從病因?qū)W角度看，幽門螺桿菌是一種參與胃癌發(fā)生的Ⅰ類致癌物[19-20]。Han等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的疾病條件下，幽門螺桿菌感染可能改變RNF180基因啟動子的甲基化方式，在正?；驕\表性胃炎中，幽門螺桿菌傾向于影響總體甲基化狀態(tài)，而不會使某些CpG位點甲基化；但在萎縮性胃炎中，幽門螺桿菌影響某些CpG位點的可能性更大。進一步的研究證實，有5個CpG位點與萎縮性胃炎進展相關(guān)，其中兩個位點的甲基化與胃癌進展相關(guān)，這些位點均位于RNF180基因的核心啟動子區(qū)域(-202/+372)，該區(qū)域也是RNF180基因轉(zhuǎn)錄起始位點[16,22]。故認為，幽門螺桿菌通過促進RNF180基因甲基化參與慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生到腸型胃癌的演變。

RNF180與胃癌的關(guān)系一直是研究熱點，但對其致癌機制的研究很少。Cheung等[22]的研究顯示，受檢的胃癌細胞系中均未發(fā)現(xiàn)RNF180基因的缺失或突變，認為啟動子高甲基化是降低RNF180表達的主要機制；RNF180可通過上調(diào)組織金屬蛋白酶抑制物3和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A激活細胞凋亡，并通過上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子1和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A抑制細胞增殖。Deng等[23]利用基因芯片技術(shù)的研究顯示，RNF180在HGC-27-GFP-RNF180細胞(轉(zhuǎn)染RNF180表達載體的HGC-27胃癌細胞)中重新表達，可顯著抑制涉及增殖(肝細胞生長因子)、侵襲(基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶14)、淋巴管生成(血管內(nèi)皮生長因子C和血管內(nèi)皮生長因子D)、胃癌細胞趨化性細胞因子(CC趨化因子受體7)基因的表達，表明RNF180可能成為胃癌的治療靶點。由此可見，RNF180基因甲基化可通過影響多種細胞因子、癌蛋白調(diào)控癌細胞生物學行為。

涉及RNF180致癌機制的4條信號通路分別為RNF180/RhoC/磷酸化的信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)、RNF180/Wnt1誘導信號通路蛋白1(Wnt1-inducible signaling pathway protein 1，WISP1)、RNF180/Polo樣激酶2和RNF180/DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)/含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶 9(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9，ADAMTS9)。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，RNF180可結(jié)合RhoC并通過泛素化作用降解RhoC。RhoC通過磷酸化活化STAT3生成磷酸化的STAT3，后者發(fā)生二聚化后擴散到細胞核中，與Nanog的啟動子區(qū)結(jié)合，開啟基因表達。而肝細胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶14、血管內(nèi)皮生長因子C、血管內(nèi)皮生長因子D相關(guān)基因是STAT3的靶基因。因此，磷酸化的STAT3水平下降可有效抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，進而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Wei等[8]對RNF180與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，WISP1是介導RNF180腫瘤抑制作用的關(guān)鍵下游分子。在機制上，RNF180中位點Lys50、Lys190、Lys268的泛素化可使WISP1泛素化，導致WISP1下調(diào)，進而減弱WISP1誘導的細胞增殖，最終抑制人源性腫瘤組織異種移植小鼠模型結(jié)直腸癌腫瘤的生長。

此外，5-氟尿嘧啶和RNF180在誘導細胞凋亡和抑制腫瘤生長方面有協(xié)同作用。RNF180不能完全消除WISP1的影響，這意味著WISP1信號轉(zhuǎn)導中可能存在替代介質(zhì)或途徑。Cao等[11]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，RNF180可與Polo樣激酶2結(jié)合并促進Polo樣激酶2泛素化降解，抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，促進凋亡。DNMT3A是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，與ADAMTS9基因啟動子的高甲基化密切相關(guān)。Sun等[25]發(fā)現(xiàn)，ADAMTS9可抑制胃癌細胞存活、遷移和侵襲，進一步的共免疫沉淀實驗顯示，RNF180可與DNMT3A結(jié)合，泛素化分析結(jié)果顯示，RNF180過表達時，DNMT3A泛素化增強，證實DNMT3A是RNF180的直接底物，RNF180通過促進DNMT3A蛋白的泛素化降解，恢復胃癌細胞中ADAMTS9的表達，從而抑制胃癌細胞的存活。上述信號通路均涉及RNF180的泛素化作用，且許多參與重要細胞生物學過程的因子、關(guān)鍵酶均是RNF180下游分子，其中多種基因及信號通路相互影響，形成復雜的分子網(wǎng)絡系統(tǒng)，因此還需進一步探索RNF180抑制胃癌惡性生物學行為的其他通路。進一步研究RNF180上下游分子信號將為尋找胃癌治療新靶點、延長胃癌患者生存期提供理論基礎。

3 胃癌中外周血RNF180甲基化的臨床檢測

胃癌組織中RNF180信使RNA及蛋白質(zhì)表達水平的檢測是既往研究的熱點，結(jié)果顯示，胃癌組織中RNF180信使RNA及蛋白質(zhì)表達水平與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，且病變組織水平顯著低于相應癌旁組織[7,23,26]。外周血取材方便，故外周血RNF180甲基化水平檢測被認為是胃癌診斷的新方法。Cheung等[22]在研究胃癌細胞株及胃癌組織的同時，利用定量聚合酶鏈反應技術(shù)檢測胃癌患者血漿標本發(fā)現(xiàn)，56%(18/32)的患者血漿標本存在RNF180基因甲基化，而健康人群血漿中未檢測到RNF180基因甲基化，受試者工作特征曲線下面積為0.685，靈敏度為91%，特異度為63%；Logistic回歸分析證實，RNF180基因甲基化與胃癌高風險相關(guān)(OR=16.1，95%CI5.3～48.6)?？梢?，外周血可顯示RNF180基因甲基化信息，且更易獲取，故外周血DNA甲基化水平的檢測為無創(chuàng)胃癌檢測提供了新途徑。研究顯示，與健康對照者相比，胃癌患者的血漿RNF180基因甲基化率明顯升高，且甲基化程度與腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[27-28]。但張學松等[28]利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測RNF180基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，胃癌患者血漿RNF180蛋白表達水平明顯降低，但蛋白質(zhì)表達水平與上述臨床病理學特征并無統(tǒng)計學聯(lián)系，其原因可能是RNF180可通過基因甲基化之外的方式調(diào)控基因表達，如基因突變、組蛋白修飾去乙?；?。在基因表達水平上，蛋白質(zhì)與病理特征無關(guān)，但以上結(jié)果仍提示外周血RNF180基因甲基化檢測是一種簡便且具有應用價值的胃癌診斷方法。宋毓飛等[29]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應進行研究顯示，53.7%(36/67)的胃癌患者RNF180基因甲基化呈陽性表達，而僅23.5%(12/51)的正常健康體檢者RNF180基因甲基化呈陽性表達，甲基化與腫瘤分化程度、TNM分期顯著相關(guān)，但不同性別、年齡胃癌患者RNF180基因甲基化水平比較差異無統(tǒng)計學意義；Logistic回歸分析顯示，RNF180基因甲基化水平與胃癌高風險相關(guān)(OR=3.0，95%CI1.3～7.0)。曹長琦等[30]對74例早期胃癌患者的研究顯示，早期胃癌組患者的RNF180基因甲基化陽性率顯著高于胃良性疾病組和健康對照組(32.4%比13.1%、5.3%)(P<0.01)，其受試者工作特征曲線下面積為0.636，但未發(fā)現(xiàn)RNF180基因甲基化與性別、年齡、Lauren分型、病理分化程度、解剖位置、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，以上研究結(jié)果的差異可能與不同試驗檢測方法、試劑盒對研究結(jié)果的影響不同有關(guān)。

雖然檢測胃癌患者外周血RNF180基因甲基化水平存在一定的假陽性率，但其診斷價值仍高于傳統(tǒng)腫瘤標志物。將RNF180與其他具有診斷效能的基因聯(lián)合進行甲基化檢測是提高胃癌診斷靈敏度和特異度的方法。Zhang等[27]比較外周血RNF180、死亡相關(guān)蛋白激酶1以及分泌型卷曲相關(guān)蛋白2單一基因檢測和多基因聯(lián)合檢測診斷胃癌的效能，結(jié)果顯示，外周血RNF180與分泌型卷曲相關(guān)蛋白2聯(lián)合檢測診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為85.96%和47.62%，可顯著提高胃癌臨床診斷率，適用于胃癌的診斷。宋毓飛等[29]認為，外周血RNF180和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2聯(lián)合檢測胃癌的靈敏度和特異度分別為42.7%和88.2%，優(yōu)于單一檢測。曹長琦等[30]發(fā)現(xiàn)，血漿Septin 9、RNF180聯(lián)合甲基化檢測診斷早期胃癌的靈敏度為40.5%，特異度為85.3%，較任一基因單獨檢測的靈敏度明顯升高；且不同檢測手段診斷胃癌的陽性率依次為Septin 9聯(lián)合RNF180、RNF180、Septin 9、CA724、CA125、癌胚抗原、CA19-9。由此可見，早期檢測Septin 9與RNF180基因甲基化可作為一種臨床可行的簡便檢測方法，用于胃部病變良惡性的輔助鑒別。臨床試驗顯示，該試劑盒檢測胃癌的靈敏度為61.76%(420/680)、特異度為85.07%(456/536)[31]。2020年4月國家藥品監(jiān)督管理局批準胃癌篩查RNF180/Septin 9基因甲基化檢測試劑盒上市[32]。在臨床實踐中，兩種及兩種以上基因甲基化檢測似乎更加具有可行性。因此，尋找其他具有更高靈敏度的基因?qū)W標志物是未來腫瘤診斷學的研究方向。

4 小 結(jié)

RNF180基因表達水平隨甲基化水平改變，并促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。外周血RNF180基因甲基化檢測有助于發(fā)現(xiàn)早期胃癌，且其檢測胃癌的靈敏度高于傳統(tǒng)腫瘤標志物[30]。外周血RNF180基因甲基化檢測在胃癌診斷、預測惡性生物學行為中具有重要價值，但其通過甲基化發(fā)揮促癌作用的具體機制仍不明確。目前與胃癌相關(guān)的分子標志物主要包括癌基因、抑癌基因、DNA甲基化、微RNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA、循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體等[33]。未來，基于腫瘤分子或免疫組織化學特征的檢測方法可通過優(yōu)化外周血RNF180基因甲基化檢測技術(shù)發(fā)掘其他具有高特異度和靈敏度的標志物并進行聯(lián)合檢測，以進一步探索定量、定性基因甲基化水平與胃癌的關(guān)系，拓展其在胃癌早期診斷中的應用。