孕早期外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1 ∶1對(duì)子癇前期的預(yù)測(cè)價(jià)值

陳丹,楊星宇,程蔚蔚

子癇前期是妊娠期常見而復(fù)雜的并發(fā)癥，以妊娠20周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣?，發(fā)病率約2%～8%[1]。子癇前期發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前仍缺少有效治療措施，及時(shí)終止妊娠是唯一的治療方法。有研究指出，在妊娠16周之前對(duì)高危子癇前期孕婦進(jìn)行早期干預(yù)有助于改善母嬰結(jié)局[2]。因而早期生物標(biāo)志物的探尋對(duì)子癇前期的診斷和防治改善母嬰結(jié)局具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，既往被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[3]，然而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了lncRNA在各項(xiàng)病理生理過程中的研究，包括子癇前期的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究指出，lncRNA在子癇前期患者胎盤組織或血清中異常表達(dá)，并可通過不同作用方式及信號(hào)通路，調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究通過前瞻式病例對(duì)照研究，檢測(cè)孕婦孕早期(11～13周)外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達(dá)水平，探討其在子癇前期早期診斷中的預(yù)測(cè)價(jià)值，并分析其與收縮壓和舒張壓的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻式病例對(duì)照研究，研究對(duì)象選自2018年9月至2019年9月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院就診分娩的孕婦，根據(jù)妊娠結(jié)局是否發(fā)展為子癇前期分組。其中正常孕婦29例為對(duì)照組，子癇前期孕婦20例為子癇前期組。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁ト焉?無慢性病史;于本院規(guī)律產(chǎn)檢和分娩。子癇前期納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACOG)指南[5]：(1)血壓：孕前血壓正常，妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg，兩次測(cè)量至少間隔4 h；收縮壓≥160 mmHg或舒張壓≥110 mmHg(重度高血壓可間隔數(shù)分鐘測(cè)定并診斷，以便及時(shí)進(jìn)行降壓治療)。(2)蛋白尿：24 h蛋白尿≥300 mg；蛋白質(zhì)/肌酐≥0.3 mg/dL；尿常規(guī)蛋白≥++(僅在其他檢測(cè)方法不可用時(shí)使用)。(3)蛋白尿陰性但符合以下新發(fā)表現(xiàn)：① 血小板減少癥：血小板計(jì)數(shù)<100×109/L；② 腎功能不全：排除其他腎臟疾病，血清肌酐濃度>1.1 mg/dL或高于正常上限2倍；③ 肝功能受損：轉(zhuǎn)氨酶高于正常上限2倍；④ 肺水腫；⑤ 新發(fā)頭痛，普通藥物治療無緩解，排除其他原因或視物模糊。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠合并內(nèi)科或外科疾病(妊娠合并慢性高血壓、慢性高血壓并發(fā)子癇前期、糖尿病合并妊娠、妊娠期糖尿病、甲狀腺功能異常、既往或妊娠合并急慢性腎炎綜合征、腎病綜合征等)；(2)多胎妊娠或胎兒發(fā)育畸形；(3)行人工授精或試管嬰兒的孕婦；(4)孕早期無血液樣本凍存或產(chǎn)檢過程中失訪的孕婦。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，研究對(duì)象簽署知情同意書后參加。

1.2 研究方法

1.2.1 基線資料收集 收集患者年齡，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，診斷時(shí)收縮壓與舒張壓及24 h蛋白尿等臨床資料。

1.2.2 外周血留取 在妊娠11～13周時(shí)收集孕婦外周血3～5 mL，凍存于-80℃冰箱留用。待分娩完成，根據(jù)妊娠結(jié)局，分為子癇前期組和對(duì)照組樣本。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)孕早期孕婦外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達(dá)水平。

1.2.3 外周血lnc-C17orf64-1∶1檢測(cè) 采用Trizol法提取外周血中總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)(A260/A280)測(cè)量濃度和純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA置于-80℃的冰箱中保存。采用qRT-PCR法檢測(cè)外周血lnc-C17orf64-1∶1的表達(dá)量，以18S rRNA為內(nèi)參。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取其均值。采用18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)化后ΔCT值計(jì)算外周血lnc-C17orf64-1∶1的相對(duì)表達(dá)量，ΔCT值越大，外周血lnc-C17orf64-1∶1含量越低。重復(fù)3次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。lnc-C17orf64-1∶1正向引物：5′-ATGGTAAAGCACCCACGAAG-3′，反向引物：5′-AGATGCTGGAAGGGAGGTTT-3′；18S rRNA正向引物：5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，反向引物：5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦臨床特征比較

按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入49例孕婦，其中對(duì)照組29例，子癇前期組20例。兩組對(duì)象年齡與BMI的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，子癇前期組分娩孕周較小，收縮壓、舒張壓和24 h蛋白尿水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

2.2 兩組孕婦外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達(dá)水平

子癇前期組外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的ΔCT值小于對(duì)照組(P<0.05)，即lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者外周血中呈高表達(dá)(見圖1A)。

2.3 外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的ΔCT值與收縮壓及舒張壓呈負(fù)相關(guān)(均P< 0.05)(見圖1B)。

2.4 孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1含量預(yù)測(cè)子癇前期效能評(píng)價(jià)

孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)病的ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.9172(95%置信區(qū)間：0.8445-0.9899)，靈敏度為80.00%，特異度為86.21%，最大約登指數(shù)為0.6621，根據(jù)約登指數(shù)得出最佳截?cái)帱c(diǎn)為13.71(ΔCT值)，陽性預(yù)測(cè)值為80.00%，陰性預(yù)測(cè)值為86.21%(見圖2)。

3 討論

子癇前期控制不良會(huì)導(dǎo)致孕產(chǎn)婦高血壓、蛋白尿、肝腎功能不全、凝血功能改變等，造成胎兒宮內(nèi)缺氧和生長(zhǎng)受限，且會(huì)顯著增加患者產(chǎn)后及后代成年后罹患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前子癇前期仍缺乏有效治療方法，妊娠早期識(shí)別高危子癇前期并及時(shí)進(jìn)行小劑量阿司匹林治療可顯著降低子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，質(zhì)子泵抑制劑、鈣劑、他汀類藥物(普伐他汀等)、微生物制劑和二甲雙胍等臨床干預(yù)可有效幫助改善母嬰結(jié)局[1,6]。傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素評(píng)估預(yù)測(cè)價(jià)值有限，因此，近年來子癇前期預(yù)測(cè)指標(biāo)相關(guān)研究大量開展，主要聚焦于孕婦臨床資料評(píng)估、平均動(dòng)脈壓(mean artery pressure，MAP)、血清學(xué)指標(biāo)[如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、可溶性類酪氨酸激酶1、可溶性內(nèi)皮素、胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)、妊娠相關(guān)血漿蛋白等]和孕期超聲指標(biāo)[子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(uterine artery pulsatility index，UtA-PI)和子宮動(dòng)脈收縮期最大血流速度與舒張期末期血流速度比值等][7]。目前認(rèn)為，妊娠早期聯(lián)合篩查MAP、血清PLGF、UtA-PI及孕婦高危因素評(píng)估可幫助識(shí)別子癇前期高風(fēng)險(xiǎn)孕婦[8]。

圖1A 兩組外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值比較

圖1B 外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值與收縮壓、舒張壓相關(guān)性

圖2 外周血lnc-C17orf64-1∶1診斷子癇前期的ROC曲線

表1 兩組孕婦臨床特征比較

隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，lncRNA在子癇前期中的研究逐漸興起。通過微陣列技術(shù)和RNA測(cè)序，研究者鑒定出大量在子癇前期胎盤組織中差異表達(dá)的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)它們對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要作用[9]。胎盤中表達(dá)上調(diào)的lncRNA INHBA-AS1通過抑制轉(zhuǎn)錄因子CENPB與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1(TRAF1)的啟動(dòng)子結(jié)合而抑制了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移[10]；胎盤中表達(dá)下調(diào)的lncRNA HOXA11-AS可通過調(diào)節(jié)RND3和HOXA7表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移[11]，lncRNA TUG1通過募集EZH2，抑制RND3的表達(dá)，進(jìn)而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

除了lncRNA在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的研究，研究者們還探討了其在循環(huán)血中作為子癇前期生物標(biāo)志物的可能性。胎盤微陣列檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA(NR_026824.1、AK055151.1、NR_027457、NR_024178和BC030099)在子癇前期患者胎盤組織中表達(dá)上調(diào)，而Sun等[13]通過對(duì)正常孕婦及子癇前期孕婦全血樣本中上述lncRNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅lncRNA BC030099在外周血中表達(dá)上調(diào)，AUC為0.713(95%置信區(qū)間：0.587-0.839)。此外，有研究檢測(cè)了16周前子癇前期患者血漿中肝癌微血管侵襲相關(guān)的lncRNA MVIH的表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)其在子癇前期組血漿中表達(dá)降低，單獨(dú)用于預(yù)測(cè)子癇前期時(shí)，AUC為0.763，靈敏度為65.2%，特異度為75.0%，聯(lián)合尿酸、白細(xì)胞、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和尿蛋白預(yù)測(cè)可提高預(yù)測(cè)靈敏度(86.4%)和特異度(83.1%)[14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者與正常孕婦臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤組織中差異表達(dá)，表明其可能參與子癇前期發(fā)生發(fā)展[15]。目前我國(guó)孕婦建檔時(shí)間在妊娠12周左右，而研究也指出在妊娠11～13周時(shí)對(duì)孕婦進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，可作為妊娠并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的首選方法[16]。因此，本研究首次檢測(cè)了lnc-C17orf64-1∶1在孕婦孕早期(妊娠11～13周)外周血中表達(dá)情況，并分析其與血壓之間的相關(guān)性，探討其作為子癇前期早期診斷生物標(biāo)志物的可能性。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，lnc-C17orf64-1∶1具有較高的靈敏度和特異度，可作為預(yù)測(cè)子癇前期生物標(biāo)志物。本研究也存在一定局限性，由于納入檢測(cè)的樣本量較小，且未根據(jù)子癇前期嚴(yán)重程度分組，后續(xù)需進(jìn)一步行基礎(chǔ)研究及多中心大樣本臨床驗(yàn)證明確lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期發(fā)生發(fā)展中的作用及其在子癇前期發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值。綜上所述，lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者外周血中表達(dá)升高，且與血壓嚴(yán)重程度相關(guān)，對(duì)子癇前期發(fā)病有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。