真菌毒素測(cè)試儀應(yīng)用及校準(zhǔn)方法的研究

周華文 王光躍 王曉紅

摘要：真菌毒素是指絲狀真菌在糧食和飼料中生長(zhǎng)產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，極易污染各類農(nóng)產(chǎn)品，對(duì)人體和動(dòng)物危害極大;真菌毒素測(cè)試儀是一種快檢儀器，可以對(duì)糧食存放產(chǎn)生的真菌毒素含量進(jìn)行快速有效的測(cè)量，對(duì)食品、飼料安全檢測(cè)初篩發(fā)揮著重要的作用;真菌毒素測(cè)試儀的量值準(zhǔn)確性直接關(guān)系到糧食初篩的科學(xué)與否。論文簡(jiǎn)單分析了真菌毒素測(cè)量的重要性和現(xiàn)階段真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)狀況;通過(guò)分析真菌毒素測(cè)試儀的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)，找出關(guān)鍵量值的評(píng)價(jià)方法，確定了真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)方法。

關(guān)鍵詞：真菌毒素 校準(zhǔn)方法 糧食安全

Mycotoxin Tester Application and Research on Calibration Method

Zhou Huawen1 ， Wang Guangyue1，Wang Xiaohong2

（1. Binzhou Inspection and Testing Center; 2. Shandong Yuntang Intelligent Technology Co.， LTD）

Abstract： Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi growing in grain and feed. It is very easy to pollute all kinds of agricultural products，great harm to human body and animals. Mycotoxin tester is a fast detection instrument， which can quickly and effectively measure the content of mycotoxin produced by grain storage，and plays an important role in the preliminary screening of food and feed safety detection. The accuracy of mycotoxin tester is directly related to the qualification of primary screening of food and feed.This paper briefly analyzes the importance of mycotoxin measurement and the calibration of mycotoxin tester at present. By analyzing the technical indexes of mycotoxin tester， the evaluation method of key quantity value is found out，and the calibration method of mycotoxin tester is determined.

Key words： mycotoxins， calibration method， food safety

0 引言

當(dāng)前國(guó)家糧食供給處在緊平衡狀態(tài)，疫情下糧食出口國(guó)停止出口，當(dāng)下倉(cāng)儲(chǔ)糧的安全事關(guān)糧食安全的關(guān)鍵。目前真菌毒素已知種類有400余種，我國(guó)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》、GB 13078—2017 《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》都對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉素B1、黃曲霉素M1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、展青毒素做出了限量要求;真菌毒素測(cè)試儀是一種快檢儀器，由于真菌毒素快速檢測(cè)儀器的檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，在市場(chǎng)、家庭、食堂餐廳等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，提升了食品安全檢測(cè)的效率，擴(kuò)大了食品檢測(cè)的范圍，對(duì)于更科學(xué)有效的管理食品安全市場(chǎng)發(fā)揮重要的作用;真菌毒素測(cè)試儀的正確使用及該設(shè)備的量值準(zhǔn)確可靠是控制糧食不受感染的重要保障。

1 真菌毒素測(cè)試儀在糧食安全中的重要性

真菌毒素測(cè)試儀應(yīng)用于糧食收儲(chǔ)企業(yè)、食品制造業(yè)、牲畜飼料生產(chǎn)業(yè)，特別是糧食收儲(chǔ)企業(yè)，因糧食飼料在收獲時(shí)未被充分干燥或貯運(yùn)過(guò)程中溫度或濕度過(guò)高，都可能使糧食飼料上的真菌迅速生長(zhǎng)，真菌毒素就是真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。幾乎所有在糧食倉(cāng)庫(kù)中生長(zhǎng)的真菌（倉(cāng)貯真菌）都侵染種胚造成谷物萌發(fā)率下降，同時(shí)產(chǎn)生毒素。這都需要使用真菌毒素測(cè)試儀進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和控制。因此，真菌毒素測(cè)試儀的使用和校準(zhǔn)必須準(zhǔn)確可靠。

2 常見的兩種真菌毒素測(cè)試儀

2.1 熒光定量免疫層析技術(shù)檢測(cè)法真菌毒素測(cè)試儀

定義：免疫層析技術(shù)又名側(cè)向流免疫層析，是一種色譜分析技術(shù)。該技術(shù)是將已知的抗原或抗體預(yù)先偶聯(lián)到載體上作為捕獲線，待檢測(cè)樣本在載體的毛細(xì)作用帶動(dòng)下流經(jīng)捕獲線，若樣本中存在相應(yīng)的抗體或者抗原，就能和載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)而吸附到載體上，并通過(guò)標(biāo)記物顯色或者發(fā)光以確定是否含待測(cè)物或者待測(cè)物的含量。

熒光免疫層析技術(shù)，是將免疫熒光技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展創(chuàng)新的一種定量新型檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)是用熒光微球與抗體結(jié)合形成熒光標(biāo)記抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)不但保留膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、便攜性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)外，還通過(guò)熒光示蹤增強(qiáng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的精確定量。

熒光定量免疫層析技術(shù)是在熒光免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)熒光定量檢測(cè)儀對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量檢測(cè)。免疫微球標(biāo)記的熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光的照射下會(huì)發(fā)出熒光，儀器會(huì)根據(jù)熒光的發(fā)光強(qiáng)度，通過(guò)儀器預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測(cè)物質(zhì)做到定量檢測(cè)。

2.2 膠體金定量檢測(cè)法真菌毒素測(cè)試儀

糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 6111—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食中黃曲霉毒素B1測(cè)定 膠體金快速定量法》、LS/T 6112—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食中玉米赤霉烯酮測(cè)定 膠體金快速定量法》、LS/T 6113—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定 膠體金快速定量法》、LS/T 6114—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食中赭曲霉素毒素A測(cè)定 膠體金快速定量法》要求的膠體金快速定量技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique）是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4 ）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下， 聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金層析抗原抗體反應(yīng)在纖維素膜上，從而使標(biāo)記膠體金的抗體在檢測(cè)線、質(zhì)控線上聚集， 從而形成可以被肉眼觀察到的紅色條帶。

膠體金定量免疫層析技術(shù)是在膠體金免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)膠體金定量檢測(cè)儀對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。膠體金定量檢測(cè)儀通過(guò)對(duì)膠體金檢測(cè)卡的檢測(cè)線和質(zhì)控線進(jìn)行光密度掃描，依據(jù)檢測(cè)線和質(zhì)控線顏色的深淺，通過(guò)儀器預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。

3 膠體金定量檢測(cè)法與熒光定量免疫層析技術(shù)檢測(cè)法本質(zhì)區(qū)別

3.1 標(biāo)記技術(shù)不同

熒光定量免疫層析產(chǎn)品以功能化納米微球?yàn)檩d體技術(shù)，結(jié)合熒光標(biāo)記物探針，儀器直接檢測(cè)激發(fā)熒光信號(hào)而非傳統(tǒng)金標(biāo)定量所采用的CCD表層光密度掃描技術(shù)。檢測(cè)信號(hào)具有較高的信噪比、更高的信號(hào)檢測(cè)量和檢測(cè)靈敏度。

3.2 載體結(jié)合方式不同

膠體金免疫層析技術(shù)采用物理吸附的方法結(jié)合，抗原/抗體容易從金顆粒表面脫離，標(biāo)記物不穩(wěn)定。由于膠體金技術(shù)的原理缺陷和無(wú)法攻克的技術(shù)難點(diǎn)，故膠體金免疫層析技術(shù)，通常適用于定性或者半定量現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，無(wú)法給出精準(zhǔn)定量的檢測(cè)結(jié)果。熒光免疫層析技術(shù)采取的是化學(xué)偶聯(lián)的吸附方法，抗原/抗體結(jié)合能力強(qiáng)，不易脫落，檢測(cè)結(jié)果較為精準(zhǔn)。兩種檢測(cè)方法對(duì)比情況見表1。

4 真菌毒素測(cè)試儀的正確使用

毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)卡具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品檢測(cè)。本試劑將毒素包被抗原在硝酸纖維素膜上劃線包被，作為檢測(cè)線，用羊抗兔多抗在硝酸纖維素膜上劃線包被制成質(zhì)控線。將鼠抗毒素單克隆抗體標(biāo)記上乳膠熒光微球與兔IgG標(biāo)記的乳膠熒光微球混勻后噴涂在玻璃纖維素膜上制備成標(biāo)記物墊。硝酸纖維素膜靠近質(zhì)控線的一端覆蓋上吸水墊，靠近檢測(cè)線的另一端覆蓋標(biāo)記物墊。往標(biāo)記物墊上加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣本提取液，抗原就會(huì)與標(biāo)記物混合反應(yīng)并沿著硝酸纖維素膜層析，分別與檢測(cè)線和質(zhì)控線反應(yīng)。當(dāng)測(cè)試結(jié)果有效時(shí)，質(zhì)控線顯示一定光強(qiáng)度。這時(shí)檢測(cè)線上的光信號(hào)強(qiáng)度與質(zhì)控線上的光信號(hào)強(qiáng)度的比值（T/C）與樣本濃度呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可得出待測(cè)樣品濃度。

除嚴(yán)格按儀器說(shuō)明操作外，不同批號(hào)的試劑和檢測(cè)卡不能混用，檢測(cè)卡干燥保存;加樣操作應(yīng)快速準(zhǔn)確手法一致，溶液不能沾到壁上，盡量縮短整個(gè)加樣時(shí)間 ，加樣完畢后將檢測(cè)卡水平靜置于恒溫器中等待層析反應(yīng)，嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間， 檢測(cè)卡開封后立即使用，一次性使用的檢測(cè)卡不得重復(fù)使用，檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染。樣品、洗棄液和各種廢棄物處理都應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理辦法并盡快處理。

5 真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)

5.1 現(xiàn)狀

真菌毒素測(cè)試儀的生產(chǎn)沒有相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，沒有統(tǒng)一的儀器校準(zhǔn)規(guī)范，不能對(duì)不同廠家研發(fā)生產(chǎn)的同類型儀器的計(jì)量性能進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，不能保證儀器量值準(zhǔn)確性，從而影響到對(duì)谷物中真菌毒素的含量控制，進(jìn)而影響食品安全;食品安全不僅關(guān)系到廣大人民群眾的身體健康和生命安全，而且與經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展和社會(huì)的和諧穩(wěn)定密切相關(guān)。目前沒有發(fā)現(xiàn)有機(jī)構(gòu)開展真菌毒素測(cè)試儀相關(guān)的檢測(cè)校準(zhǔn)，也沒有相關(guān)的真菌毒素測(cè)試儀校準(zhǔn)的文獻(xiàn)。

5.2 制定校準(zhǔn)方法的意義

校準(zhǔn)規(guī)范的制定一是可解決儀器無(wú)統(tǒng)一校準(zhǔn)規(guī)范的問(wèn)題，保證各計(jì)量機(jī)構(gòu)采用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量器具，按統(tǒng)一的校準(zhǔn)方法進(jìn)行校準(zhǔn)，為儀器量值準(zhǔn)確可靠提供技術(shù)保障;二是通過(guò)規(guī)范制定后開展定期的校準(zhǔn)活動(dòng)，使儀器得到正常維護(hù)，保證檢測(cè)儀器的計(jì)量特性指標(biāo)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基本參數(shù)要求;三是通過(guò)制定規(guī)范，為相關(guān)儀器的生產(chǎn)、驗(yàn)貨交易、糾紛仲裁等提供可供參考的技術(shù)依據(jù)。

5.3 真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)步驟

5.3.1 以乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋液為平行樣，以真菌毒素測(cè)試儀測(cè)試其熒光值，按照公式（1）得到擬合曲線，然后根據(jù)其測(cè)量值，按照式（2）計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

式中：

x——稀釋液濃度值;

y——熒光值;

b——擬合曲線斜率;

a——擬合曲線截距;

r——相關(guān)系數(shù);

xi——第i個(gè)濃度點(diǎn)稀釋液濃度值;

yi——第i個(gè)濃度點(diǎn)熒光值;

x ——稀釋液濃度值的平均值;

y ——熒光值的平均值。

5.3.2 計(jì)算測(cè)量重復(fù)性：重復(fù)測(cè)量中濃度的乙腈中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋液的熒光值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s。

5.3.3 計(jì)算最小檢出值：重復(fù)測(cè)量空白樣品的熒光值，取熒光值的平均值為y，取y-3s作為最小檢出值。

6 結(jié)束語(yǔ)

本文分析了真菌毒素測(cè)量的重要性和真菌毒素測(cè)試儀工作原理以及現(xiàn)階段真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)狀況;通過(guò)分析真菌毒素測(cè)試儀的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)真菌毒素測(cè)試儀的校準(zhǔn)工作，解決了真菌毒素測(cè)試儀不能校準(zhǔn)的難題;該方法主要使用的是國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，能夠滿足擴(kuò)展不確定度小于被校準(zhǔn)設(shè)備最大允許誤差的1/3的要求，對(duì)真菌毒素測(cè)試儀要求合理、切實(shí)可行，可操作性強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)

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