雞骨香乙醇提取物舒張小鼠氣道平滑肌的作用機(jī)理研究

姚鳳杰， 曾曉月， 沈金花

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430074)

哮喘，是一種常見的氣道異質(zhì)性的慢性炎癥疾病，通常會(huì)導(dǎo)致可變的氣道阻塞[1]. 氣道平滑肌是調(diào)節(jié)氣道阻力的關(guān)鍵組織，其反應(yīng)過度并產(chǎn)生收縮是哮喘的主要特征[2]. 氣道平滑肌的收縮反應(yīng)與Ca2+濃度相關(guān)，其收縮依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高[3]. 而收縮性激動(dòng)劑可以激活氣道平滑肌細(xì)胞膜表面受體和氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+相關(guān)通道進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起氣道平滑肌收縮[4]. 因此，可根據(jù)哮喘的發(fā)病機(jī)理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，研究藥物的抗收縮性，從而進(jìn)一步研究藥物對(duì)哮喘的作用.

近年來，由于環(huán)境的因素，全球范圍內(nèi)哮喘的發(fā)病率正持續(xù)上升. 然而，目前常用的支氣管擴(kuò)張藥物的治療效果有限，且副作用較多， 因此亟待開發(fā)更有效、副作用更小的哮喘治療藥物. 越來越多的證據(jù)表明，抗炎中藥對(duì)哮喘患者具有良好的治療效果，且中藥具有作用溫和、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)具有抗炎特性的中藥用于治療哮喘，可能成為抗哮喘藥物創(chuàng)新的有效途徑[5]. 本課題組通過已有文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出雞骨香(CrotoncrassifoliusGeisel)，將其提取成分通過張力測(cè)量和膜片鉗技術(shù)等體外實(shí)驗(yàn)，呼吸阻力測(cè)量等活體實(shí)驗(yàn)探究其作用機(jī)理，試圖開發(fā)出一種安全有效的中藥來抑制氣道平滑肌的異常收縮，從而緩解哮喘.

雞骨香為大戟科，巴豆屬植物，味辛、苦，以根入藥，主要分布于我國西南地區(qū)，常用于治療咽喉腫痛、關(guān)節(jié)炎、胃炎等疾病[6]. 雞骨香具有抗炎、抗腫瘤等作用，其化學(xué)成分包括萜類、揮發(fā)油類、甾醇類等[7]. 二萜類成分為雞骨香的主要化學(xué)成分，其中克羅烷型二萜chettaphanin Ⅰ、3S-methoxyl-teucvin等都具有抗炎活性[8-9]. 目前國內(nèi)外對(duì)雞骨香的藥理研究仍然有限，到目前為止，尚無有關(guān)雞骨香中的特定成分具有抑制小鼠氣道平滑肌收縮潛力的文獻(xiàn)報(bào)道. 并且有研究表明，雞骨香乙醇提取物(ethanol extracts fromCrotoncrassifoliusGeisel， EECC)具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[10]. 因此，本文以EECC為研究對(duì)象，研究EECC在氣道平滑肌中的舒張作用及作用機(jī)制，以此探究EECC對(duì)哮喘的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司購買的SPF級(jí)7～8周雄性BALB/c小鼠120只，許可證號(hào)SCXK(遼)2020-0001，飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中南民族大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行，許可證號(hào)為2016-SCUEC-AEC-0030.

1.2 材料和儀器

雞骨香藥材于2019年9月采自廣東湛江市草藥藥材基地(湛江市屬于熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫為23 ℃. 草藥藥材基地位于湛江紅壤分布區(qū)，此區(qū)土壤呈酸性，地理坐標(biāo)為110°30′ N， 21°20′ E)，共采集5 kg，經(jīng)中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉虹副教授鑒定為雞骨香的根莖. 將采集的雞骨香根部清洗、烘干、粉碎，干粉在4 ℃冰箱密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?；氯化乙酰膽堿(ACh)(上海源葉)；乙醇、二甲基亞砜(國藥集團(tuán))；牛血清蛋白(BSA)、Pyrazole 3(Pyr 3)、Gadolinium、硝苯地平(Nifedipine)(Sigma公司)．

高鉀溶液、2 mmol·L-1Ca2+-PSS(PSS)、0 mmol·L-1Ca2+-PSS、Li-PSS溶液、電極內(nèi)液、細(xì)胞外液、木瓜蛋白酶溶液、膠原蛋白酶溶液，參考文獻(xiàn)[11]配置.

中草藥粉碎機(jī)(天津市秦斯特儀器)；BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技)；IX51膜片鉗顯微鏡(日本OLYMPUS)；EPC-10膜片鉗放大器(德國HEKA)；小動(dòng)物肺功能儀(SCIREQ Inc.，Montreal，Canada).

1.3 雞骨香乙醇部提取物的制備

稱取雞骨香粉1 kg，在室溫下浸泡于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中7 d，固液比為1∶10. 7 d后將上清液真空抽濾得濾液，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得乙醇浸膏. 將提取的雞骨香乙醇部放置于真空干燥箱中保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)，將EECC溶解于二甲基亞砜.

1.4 小鼠氣管環(huán)的獲取與處理

用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，取出肺與氣管，放置于冰浴的PSS溶液中. 在體視顯微鏡下清除主氣管周圍多余組織，剪取氣管三角區(qū)附近長(zhǎng)約6 mm的主氣管. 將主氣管用兩個(gè)邊長(zhǎng)約7 mm的三角鉤固定住，懸掛到張力換能器上，把主氣管初始前負(fù)荷調(diào)節(jié)到300 mg左右并持續(xù)15 min，PSS溶液每15 min更換一次，重復(fù)4次. 待4次平衡結(jié)束，使用100 μmol·L-1ACh或80 mmol·L-1高鉀溶液對(duì)主氣管進(jìn)行預(yù)刺激，待主氣管充分的收縮后，再用PSS溶液洗脫使其恢復(fù)至基線[11]. 主氣管在基線狀態(tài)下休息25 min后再開始正式實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)6次，即隨機(jī)選用6只小鼠做實(shí)驗(yàn)).

1.5 小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的制備

將氣管和肺固定于盛有冰浴解離液的膠板上，清除支氣管和主氣管上的多余組織，剪除軟骨環(huán)，獲取平滑肌肌條. 將肌條置于37 ℃預(yù)熱的木瓜蛋白酶溶液中消化21 min，然后將肌條轉(zhuǎn)移到37 ℃預(yù)熱的膠原蛋白酶溶液中消化3 min，再用冰浴的BSA溶液清洗肌條兩次，最后將肌條轉(zhuǎn)移到含400 μL BSA溶液的EP管中，用力彈EP管使肌條分散成單個(gè)細(xì)胞，置于4 ℃冰箱備用．

1.6 VDLCCs電流的記錄

利用膜片鉗系統(tǒng)，采用步階式刺激方式作用于急性分離的單個(gè)氣管平滑肌細(xì)胞，通過全細(xì)胞記錄方式來記錄L型電壓依賴性鈣通道(L-type voltage dependent calcium channels， VDLCCs)電流(實(shí)驗(yàn)分為兩組，每組6只小鼠).

1.7 小鼠呼吸系統(tǒng)阻力(respiratory system resistance，Rrs)的測(cè)量

首先給實(shí)驗(yàn)小鼠稱重，然后根據(jù)體重皮下注射1%的戊巴比妥鈉使其麻醉. 深度麻醉小鼠后，在小鼠的氣管上用剪刀開一個(gè)小的“T”型開口，并插入專用插管. 手術(shù)后的小鼠通過插管連接肺功能儀，利用霧化頭給藥，使用不同濃度的ACh升高小鼠Rrs，測(cè)量藥物對(duì)小鼠Rrs的影響，從而反映藥物的作用(實(shí)驗(yàn)分為兩組，每組6只小鼠).

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 EECC對(duì)高鉀誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌收縮的舒張作用

在氣道平滑肌中，必須通過多種機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控胞內(nèi)Ca2+的濃度，以維持適當(dāng)?shù)臍獾劳〞承訹12]. 高鉀可以誘導(dǎo)VDLCCs開放，使胞外Ca2+通過VDLCCs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致氣道平滑肌反應(yīng)過度，發(fā)生收縮. EECC能夠以劑量依賴的方式完全舒張由高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠主氣管，并達(dá)到最大舒張值(圖1A). 重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致，平均最大舒張比值為(102.12 ± 0.05)%，小鼠主氣管100%舒張時(shí)EECC的濃度為0.129 mg·mL-1(圖1B). 加入10 μmol·L-1Nifedipine(VDLCCs通道的特異性阻斷劑)可以完全抑制由高鉀誘導(dǎo)的小鼠主氣管的收縮(圖1C). 而EECC并不影響靜息狀態(tài)下的正常的主氣管(圖1D). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：EECC以劑量依賴的方式抑制了高鉀誘導(dǎo)的小鼠主氣管的收縮，并且VDLCCs可能參與了該過程.

A.EECC以劑量依賴的方式完全舒張高鉀誘導(dǎo)收縮的主氣管；B.EECC舒張高鉀誘導(dǎo)收縮的主氣管的量效曲線(n=6)；C.10 μmol·L-1 Nifedepine完全舒張高鉀誘導(dǎo)收縮的主氣管；D.EECC對(duì)靜息狀態(tài)下的正常的主氣管無影響A.EECC completely relaxed the main trachea induced by high potassium in a dose-dependent manner； B.Dose response curve of EECC in relaxing the main trachea induced by high potassium (n=6)；C.10 μmol·L-1 Nifedepine completely relaxed the main trachea induced by high potassium； D.EECC had no effect on the normal main trachea at rest圖1 EECC對(duì)高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠氣道平滑肌的舒張作用Fig.1 Relaxation effect of EECC on mouse airway smooth muscle with high potassium induced pre-contraction

2.2 EECC抑制高鉀誘導(dǎo)的外部鈣內(nèi)流

在0 mmol·L-1Ca2+條件下，高鉀不能引起主氣管收縮，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溶液中Ca2+濃度恢復(fù)到2 mmol·L-1時(shí)，主氣管異常收縮，加入0.129 mg·mL-1EECC，預(yù)收縮的主氣管完全舒張(圖2A). 提前孵育0.129 mg·mL-1EECC，實(shí)驗(yàn)溶液中的Ca2+濃度由0 mmol·L-1恢復(fù)到2 mmol·L-1后，主氣管只產(chǎn)生了微弱短暫的瞬時(shí)收縮(圖2B). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：EECC可以通過抑制VDLCCs，從而抑制外部環(huán)境中的Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)，舒張高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的主氣管.

2.3 EECC抑制VDLCCs全細(xì)胞電流

為了進(jìn)一步探討VDLCCs在EECC舒張氣道平滑肌中的作用，采用步階電壓刺激急性分離的單個(gè)氣道平滑肌細(xì)胞，利用膜片鉗系統(tǒng)記錄VDLCCs全細(xì)胞電流. 觀察到加入Nifedipine或EECC均可抑制VDLCCs電流(圖3A). 用步階電壓(-70 mV～+40 mV)刺激細(xì)胞，隨著電壓逐漸升高，電流先升高后降低，當(dāng)加入EECC或Nifedipine時(shí)，電流被抑制(圖3B). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明EECC與Nifedipine作用相似，EECC可以通過抑制VDLCCs電流即阻斷VDLCCs，從而抑制外部鈣內(nèi)流，舒張氣道平滑?。?/p>

A.EECC阻斷了高鉀所致的鈣內(nèi)流； B.存在EECC的情況下，高鉀不能使主氣管產(chǎn)生收縮A.EECC blocked calcium influx induced by high potassium；B.In the presence of EECC， high potassium could not cause contraction of the main trachea圖2 EECC對(duì)高鉀引起的外部鈣內(nèi)流的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of EECC on calcium influx induced by high potassium

A.EECC作用于VDLCCs的時(shí)間—電流圖；B.EECC作用于VDLCCs的電壓-電流圖A.Time current diagram of EECC acting on VDLCCs； B.Voltage current diagram of EECC acting on VDLCCs圖3 EECC阻斷VDLCCs電流Fig.3 EECC blocked VDLCCs current

2.4 EECC對(duì)ACh誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌收縮的舒張作用

ACh可以激活調(diào)控Ca2+的多種離子通道，如非選擇性陽離子通道(non-selective cation channels，NSCCs)和VDLCCs等，使外部鈣內(nèi)流和內(nèi)部鈣釋放，導(dǎo)致氣道平滑肌過度收縮. EECC能夠以劑量依賴的方式舒張ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的主氣管，并達(dá)到最大舒張值(圖4A). 重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致，平均最大舒張比值為(97.21 ± 0.39)%(圖4B)，此時(shí)EECC的濃度為0.562 mg·mL-1.

A.EECC劑量依賴地舒張ACh誘導(dǎo)收縮的主氣管；B.EECC舒張ACh誘導(dǎo)收縮的主氣管的量效曲線(n=6)A.EECC relaxed the main trachea induced by ACh in a dose-dependent manner；B.Dose response curve of EECC in relaxing the main trachea induced by ACh (n=6)圖4 EECC對(duì)ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠氣道平滑肌的舒張作用Fig.4 Relaxation effect of EECC on ACh-induced pre-contraction mouse airway smooth muscle

2.5 排除VDLCCs 后，EECC依然能夠舒張氣道平滑肌

用高鉀誘導(dǎo)小鼠主氣管收縮并達(dá)到穩(wěn)定后，加入Nifedipine，小鼠主氣管完全舒張，再加入0.129 mg·mL-1EECC，發(fā)現(xiàn)小鼠主氣管的張力值沒有發(fā)生變化(圖5A). 先用 Nifedipine阻斷VDLCCs后，加入高鉀，小鼠主氣管沒有發(fā)生收縮，再加入0.129 mg·mL-1

A.10 μmol·L-1 Nifedipine完全舒張主氣管后，EECC對(duì)主氣管的影響；B.提前孵育10 μmol·L-1 Nifedipine，EECC對(duì)高鉀刺激的主氣管的影響；C.10 μmol·L-1 Nifedipine部分舒張主氣管后，EECC對(duì)主氣管的影響；D.提前孵育10 μmol·L-1 Nifedipine，EECC對(duì)ACh刺激的主氣管的影響A.The effect of EECC on the main trachea was observed after complete relaxation of the main trachea by 10 μmol·L-1 Nifedepine；B.Effects of early incubation with 10 μmol·L-1 Nifedipine and EECC on high potassium stimulated main trachea；C.The effect of EECC on the main trachea was observed after partial relaxation of the main trachea by 10 μmol·L-1 Nifedepine；D.Effects of early incubation with 10 μmol·L-1 Nifedipine and EECC on ACh stimulated main trachea圖5 排除VDLCCs后，EECC對(duì)ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的小鼠氣道平滑肌的舒張作用Fig.5 Relaxation effect of EECC on ACh-induced pre-contraction mouse airway smooth muscle without VDLCCs

EECC，小鼠主氣管的張力值依然沒有變化(圖5B). 用ACh誘導(dǎo)小鼠主氣管收縮并達(dá)到穩(wěn)定后，加入Nifedipine，小鼠主氣管部分舒張，再加入0.562 mg·mL-1EECC，小鼠主氣管完全舒張(圖5C). 先用 Nifedipine抑制VDLCCs后，再加入ACh，小鼠主氣管仍能收縮并達(dá)到穩(wěn)定，該收縮可被0.562 mg·mL-1EECC抑制(圖5D). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：EECC可以通過阻斷VDLCCs從而使氣道平滑肌舒張，并且EECC不僅抑制VDLCCs，還可能通過抑制其它通道從而舒張小鼠氣道平滑肌.

A.EECC阻斷了ACh誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流；B.孵育EECC可以抑制鈣內(nèi)流引起的主氣管收縮；C.排除VDLCCs后，EECC對(duì)ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的主氣管的影響；D.三種不同通道阻斷劑作用后，EECC仍能舒張ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的主氣管；E) Pyr 3，Gadolinium和EECC舒張作用統(tǒng)計(jì)圖A.EECC blocked the calcium influx induced by ACh； B.EECC inhibited the contraction of main trachea induced by calcium influx；C.Effect of EECC on ACh-induced pre-contracted main trachea after excluding VDLCCs； D.EECC relaxed ACh pre-contracted main trachea after three different channel blockers； E.Statistical chart of relaxation of Pyr 3， Gadolinium and EECC注：*、**、***分別表示p<0.05,p<0.01,p<0.001;NS表示無顯著性差異.下圖同.圖6 EECC對(duì)ACh引起的外部鈣內(nèi)流和內(nèi)部鈣釋放的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of EECC on ACh-induced external calcium influx and internal calcium release

2.6 EECC抑制ACh誘導(dǎo)的外部鈣內(nèi)流和內(nèi)部鈣釋放

在0 mmol·L-1Ca2+條件下，加入ACh，主氣管只能產(chǎn)生微弱的收縮，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溶液中Ca2+濃度恢復(fù)到2 mmol·L-1時(shí)，主氣管發(fā)生持續(xù)收縮并達(dá)到穩(wěn)定，加入0.562 mg·mL-1EECC能抑制這種收縮(圖6A). 提前孵育0.562 mg·mL-1EECC，即使加入ACh，實(shí)驗(yàn)溶液中的Ca2+濃度由0 mmol·L-1恢復(fù)到2 mmol·L-1時(shí)，主氣管也只產(chǎn)生短暫微弱的收縮(圖6B). 根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)：EECC通過阻斷VDLCCs和NSCCs，抑制ACh誘導(dǎo)的內(nèi)部鈣釋放和外部鈣內(nèi)流.

為了驗(yàn)證以上推測(cè)，首先用Nifedipine阻斷VDLCCs. 在0 mmol·L-1Ca2+條件下，加入ACh，主氣管只產(chǎn)生了微弱的收縮，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溶液中Ca2+濃度恢復(fù)到2 mmol·L-1時(shí)，主氣管發(fā)生持續(xù)穩(wěn)定收縮并達(dá)到最大收縮值. 直接加入0.562 mg·mL-1EECC，小鼠主氣管可以完全舒張(圖6C). 依次加入NSCCs中兩種TRP通道的特異性阻斷劑Pyr 3和Gadolinium，再加入EECC，發(fā)現(xiàn)兩種阻斷劑和EECC各舒張一部分預(yù)收縮的小鼠主氣管(圖6D、6E). 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：VDLCCs和NSCCs參與ACh引起的氣道平滑肌的收縮，EECC可以通過阻斷VDLCCs和NSCCs從而抑制內(nèi)部鈣釋放和外部鈣內(nèi)流.

2.7 EECC抑制Na+/Ca2+交換

Na+/Ca2+交換體(Na+/Ca2+exchangers，NCX)是一種介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的重要離子通道，氣道平滑肌的基礎(chǔ)張力可通過連續(xù)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Na+濃度來保持[13]. 當(dāng)實(shí)驗(yàn)溶液為含Na+的PSS時(shí)，加入ACh，小鼠主氣管會(huì)收縮，此收縮可以被0.562 mg·mL-1EECC抑制(圖7A). 當(dāng)實(shí)驗(yàn)溶液為L(zhǎng)i-PSS(用Li+替Na+)致使實(shí)驗(yàn)溶液中無Na+時(shí)，小鼠主氣管的基礎(chǔ)張力升高，加入ACh，

A.EECC抑制ACh引起的主氣管收縮；B.EECC抑制Na+/Ca2+交換；C.是A)和B)中的基礎(chǔ)張力值、ACh收縮值和EECC舒張值的統(tǒng)計(jì)圖A.EECC inhibited the contraction caused by ACh； B.EECC inhibited Na+/Ca2+ exchange；C.A statistical map of the basic tension values， ACh contraction and EECC relaxation values in A. and B.圖7 EECC對(duì)Na+/Ca2+交換的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of EECC on Na+/Ca2+ exchange

小鼠主氣管產(chǎn)生收縮，0.562 mg·mL-1EECC可將此收縮舒張到基礎(chǔ)張力以下(圖7B). 兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)比并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，小鼠主氣管的基礎(chǔ)張力及收縮值有顯著性差異(圖7C). 以上實(shí)驗(yàn)說明：EECC可以通過抑制NCX通道，從而抑制ACh引起的氣道平滑肌的收縮.

2.8 EECC對(duì)組織活性的影響

為了研究EECC對(duì)小鼠組織活性的影響，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)：加入EECC舒張高鉀或ACh預(yù)收縮的主氣管，用PSS洗脫EECC后，再加入高鉀或ACh刺激主氣管，主氣管可以再次收縮并達(dá)到穩(wěn)定(圖8A、8C). 經(jīng)過6次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得，用ACh或高鉀刺激主氣管前后兩次的收縮值具有明顯差異(圖8B、8D). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：EECC對(duì)小鼠組織活性有一定的影響.

A-B.EECC對(duì)ACh預(yù)刺激的組織活性的影響(n=6)；C-D.EECC對(duì)高鉀預(yù)刺激的組織活性的影響(n=6)A-B.The effect of EECC on tissue activity stimulated by ACh (n=6)； C-D.The effect of EECC on tissue activity stimulated by high potassium (n=6)圖8 EECC對(duì)氣管組織活性的影響Fig.8 Effect of EECC on airway tissue activity

2.9 EECC對(duì)呼吸系統(tǒng)阻力(Rrs)的影響

上述實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞和組織水平驗(yàn)證了EECC可以舒張小鼠氣道平滑肌，為了進(jìn)一步驗(yàn)證EECC在活體水平上對(duì)小鼠影響，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：麻醉的小鼠吸入霧化的ACh(濃度梯度為0～50 mg·mL-1)，小鼠氣管收縮，Rrs升高. 加入5.62 mg·mL-1EECC，利用肺功能儀檢測(cè)藥物對(duì)小鼠Rrs的影響. 經(jīng)6次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得：EECC能夠顯著降低ACh引起的小鼠Rrs的上升(圖9). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：在活體水平上，EECC也可以舒張小鼠氣道平滑肌.

圖9 EECC對(duì)小鼠呼吸系統(tǒng)阻力的影響Fig.9 Effect of EECC on mouse respiratory system resistance

3 結(jié)論

哮喘是一種很難治愈的慢性支氣管疾病，病理特征是氣道重塑、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[14-15]. 由于目前常用的藥物無法治愈哮喘并具有一定副作用，因此，通過探究哮喘的發(fā)病機(jī)制及藥物的作用機(jī)理來開發(fā)用于治療哮喘的新型藥物極其重要. 本文以中藥雞骨香為研究材料，從細(xì)胞、組織和活體水平探討其對(duì)氣道平滑肌的舒張作用及作用機(jī)制.

哮喘的重要癥狀之一是氣道平滑肌的過度收縮[16]. 本文通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EECC以濃度依賴的方式舒張高鉀或ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣道平滑肌. 氣道平滑肌收縮是一個(gè)復(fù)雜的電生理過程，涉及多種離子通道，這些離子通道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和氣道平滑肌舒張與收縮[17]. 組織水平實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EECC通過阻斷VDLCCs、NSCCs和NCX，抑制高鉀或ACh引起的外部鈣內(nèi)流和內(nèi)部鈣釋放. 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證明EECC可阻斷VDLCCs電流. 活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)EECC能夠顯著降低小鼠的Rrs. 一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EECC具有舒張氣道平滑肌的作用. 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雞骨香有望成為一種新型的用于治療哮喘的中藥，進(jìn)一步豐富了防治哮喘的天然藥物的研究基礎(chǔ). 本文初步探討了EECC舒張氣道平滑肌的作用機(jī)理，但仍可對(duì)其進(jìn)行深入研究：一方面，可以建立哮喘模型深入研究EECC對(duì)哮喘相關(guān)的炎癥因子及蛋白表達(dá)的影響；另一方面，可以進(jìn)一步探究EECC中的化學(xué)成分如chettaphanin Ⅰ等對(duì)氣道平滑肌的舒張作用及作用機(jī)制.