重組酶擴增技術(shù)及其在病原檢測中的應用

劉可欣，王倩穎，楊森，劉俊峰，胡建軍，張淑琴※

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

最近幾年，重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification,RPA）因其可使核酸在體外等溫條件下就可以進行擴增，且具有敏感度高、檢測用時短、成本低、特異性強和便攜等特點，有望成為取代聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)的新的核酸體外擴增技術(shù)。RPA技術(shù)是2006年英國劍橋科學家Piepenburg[1]等研發(fā)的一種體外核酸擴增檢測新技術(shù)。英國TwistDX公司于2014年生產(chǎn)了具有可進行商業(yè)生產(chǎn)檢測RPA的試劑盒。該試劑盒大大推動了RPA檢測技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)學診斷以及生物檢測等眾多領(lǐng)域中的推廣應用[2]。

1 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的原理及特點

1.1 重組酶聚合酶擴增技術(shù)的原理

RPA基本原理是依賴于DNA修復中的一個關(guān)鍵過程——同源重組。其擴增原理是重組酶蛋白（recombinant enzyme protein,REP）與寡核苷酸引物在鏈置換DNA聚合酶及能量作用下發(fā)生結(jié)合產(chǎn)生重組酶絲狀復合物，該復合物在雙鏈DNA模板中尋找靶點。重組復合物在定位后引起鏈發(fā)生置換反應后形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，為避免出現(xiàn)在新鏈DNA還未合成時就發(fā)生母鏈聚集配對的現(xiàn)象，單鏈結(jié)合蛋白（single-stranded binding protein,SSB）與發(fā)生置換反應的模板單鏈DNA結(jié)合[3]，之后重組酶絲狀復合物掃描DNA模板鏈，當掃描識別到的序列可與設(shè)計的引物互補配對時，負責堿基配對的REP可通過與SSB相互結(jié)合，阻止攔截細胞核內(nèi)DNA水解酶降解單鏈DNA[3]，最后DNA聚合酶在引物的3'端添加相應堿基片段進行DNA復制并延伸。

1.2 RPA引物探針設(shè)計

引物在RPA反應中也同樣重要。RPA的引物與傳統(tǒng)常規(guī)PCR引物并不完全相同。當我們設(shè)計RPA引物的時候，RPA引物長度需要在30～35 bp之間，以便于重組酶與引物形成復合物。因其引物比PCR技術(shù)長，所以特異性也較之更好。引物片段過短（15 bp），則會導致反應重組率降低；引物片段過長（45 bp），雖然能夠使用，但是極易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)及潛在的引物現(xiàn)象[4]。一般而言，兩個RPA引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物建議不超過500 bp，最適合的長度為100～200 bp。引物選擇基本分為3個步驟，首先選擇靶區(qū)域，之后設(shè)計候選引物，最后進行實驗篩選。因為現(xiàn)在科研人員對RPA技術(shù)的研究了解還不透徹，還沒有專門軟件可以對RPA引物進行設(shè)計，但有一些規(guī)則可遵循，即引物長度最好在30～35 bp之間；5'端的3～5個堿基要避免出現(xiàn)鳥嘌呤（G），3'端最后3個核苷酸最好是鳥嘌呤（G）或胞嘧啶（C），鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）的含量應在30%～70%之間，同時無需考慮引物退火溫度，但要求引物的濃度范圍在400～500 nmol/L之間[5]。

大多數(shù)常用的PCR探針系統(tǒng)不適用于實時熒光定量RPA（Real time-RPA,RT-RPA）反應，確切地說利用聚合酶的5'至3'聚合酶活性的探針系統(tǒng)不能用于RPA反應。Real time-RPA探針一般分別在5'端和3'端設(shè)計1個熒光基團和熒光猝滅基團，還有與兩個基團相連的中間位置設(shè)計脫堿基位點（abasic site）類似物（THF）。在一個反應中，推薦探針濃度為120 nmol/L，有時調(diào)整探針濃度會促進反應的進行，因此可在50～150 nmol/L濃度范圍內(nèi)，對探針濃度進行優(yōu)化[6]。

2 RPA產(chǎn)物的檢測

RPA技術(shù)可以和多種檢測方法相結(jié)合。常見的有凝膠電泳檢測技術(shù)、橫向流動試紙條檢測技術(shù)（RPALFD）、Real time-RPA和電化學檢測等。凝膠電泳檢測法成本低，所用設(shè)備簡單，但缺點是為避免電泳結(jié)果出現(xiàn)抹帶等現(xiàn)象，檢測前需要對擴增產(chǎn)物進行純化。

RPA-LFD技術(shù)以RPA技術(shù)擴增原理為基礎(chǔ)，引物帶有生物素標志，探針帶有羧基熒光素（FAM）標志，引物、探針與靶核酸發(fā)生擴增反應，使最終擴增產(chǎn)物同時攜帶FAM和生物素標志[7]。將橫向流動試紙條檢測與RPA技術(shù)相組合，擴增與檢測合計在30 min內(nèi)，可以實現(xiàn)低至1～10 DNA拷貝的檢測限。此方法十分適用于基層進行檢測，因為此方法無需提前對操作員進行專業(yè)培訓，也不需要昂貴的高端復雜精密儀器，僅通過肉眼就可以觀察出檢測結(jié)果，并且，此方法所用成本比實時熒光定量檢測法低。鄧王平等[8]應用此技術(shù)檢測了日本血吸蟲。

RT-RPA檢測法目前已被廣泛應用。RPA的實時熒光檢測應選用特定探針，如Exo探針。Exo探針[9]是與靶序列具有同源性的寡核苷酸，含有脫堿基位點THF，兩側(cè)分別有一個熒光基團和淬滅基團，3'端帶有阻斷物以避免探針延伸。當探針不反應時，熒光基團信號被淬滅基團壓制；而Exo探針與靶序列結(jié)合時，核酸外切酶III在THF位點切割探針，熒光基團與淬滅基團分離，實現(xiàn)熒光信號與擴增產(chǎn)物的同步累積。實時熒光RPA不同于RT-PCR，其一直處于一個恒定的最佳反應溫度進行，可連續(xù)加入樣本擴增。

電化學檢測利用電化學活性物質(zhì)產(chǎn)生與核酸擴增有關(guān)的信號。大多數(shù)電化學檢測RPA的方法都是通過RPA-酶聯(lián)免疫吸附測定或RPA-酶促測定來檢測電流信號[10,11]。Ng等和Lau等[12,13]已經(jīng)采用金納米粒子作為RPA擴增子檢測的信號傳感器。金納米粒子可以選擇性地結(jié)合RPA擴增子，并將RPA擴增子的濃度轉(zhuǎn)移到可測量的電化學信號中，而這種電化學檢測方法有著較高的分析靈敏度。Ng等[12]能夠檢測到低至1CFU的結(jié)核分枝桿菌DNA，Lau等[13]可檢測到低至214 pM的假單胞菌DNA。顯然RPA-電化學檢測的高分析靈敏度是一個優(yōu)勢，同時其檢測快速，低成本，適用于現(xiàn)場檢測。

3 RPA的特點

RPA對溫度要求不高，在37～42℃條件下可以恒溫擴增。PCR技術(shù)需要一個較高溫度循環(huán)使模板變形擴增，環(huán)介導等溫擴增（LAMP）要在65℃條件下退火，RPA技術(shù)并不需要，這使得RPA技術(shù)操作與其他擴增技術(shù)相比更為簡單，并且減少了實驗所需成本；RPA不僅可擴增RNA，也可以擴增DNA[14]，而核酸序列依賴性擴增卻只能用于檢測RNA；RPA耗時短，在5～20 min之內(nèi)就可以完成反應，比PCR、環(huán)介導等溫擴增、依賴核酸序列的擴增等技術(shù)節(jié)省了很多時間；RPA對技術(shù)操作要求不高，不受檢測場地限制，并且應用RPA技術(shù)檢測時也不需要十分高精尖的設(shè)備，甚至可以直接利用人體腋下溫度對樣品進行檢測[15]；RPA技術(shù)對檢測樣品要求也很低——模板可直接使用經(jīng)簡單裂解液裂解60 s的樣品，故十分適用于現(xiàn)場實地檢測；RPA技術(shù)的特異性佳，靈敏度高[16]，其特異性可以與RT-PCR相媲美[17]。

RPA技術(shù)擴增產(chǎn)物在進行凝膠電泳檢測時，為了避免其他成分對結(jié)果造成的影響，需要對產(chǎn)物進行純化。RPA技術(shù)單份檢測費用不低，因為現(xiàn)階段使用的RPA試劑均產(chǎn)自英國，且目前沒有一款專業(yè)的軟件能夠設(shè)計和篩選RPA技術(shù)的引物和探針。RPA技術(shù)不能檢測較短序列的DNA或RNA，而且在檢測大量樣品時，很難控制反應同時進行。

表1 RPA與其他核酸檢測技術(shù)的比較Table 1 Comparison of RPA and other nucleic acid isothermal amplification methods

4 RPA技術(shù)在獸醫(yī)方面的應用

4.1 RPA對病毒的檢測

姜一瞳等[28]建立了一種RPA方法針對檢測犬細小病毒（CPV）。該實驗引物序列的設(shè)計基于CPVVP2基因的保守區(qū)序列，通過優(yōu)化不同反應條件，建立了犬細小病毒的RPA檢測方法。該方法最適反應溫度為38℃，恒溫反應，反應15 min后即可特異、快速地檢測出犬細小病毒。該方法特異性強，敏感度高，同時使用普通PCR法、膠體金和RPA法檢測疑似CPV感染的臨床樣品，普通PCR和膠體金的檢出率（82%、76%）明顯低于建立的RPA方法的陽性檢出率（88%）。故該實驗建立的檢測犬細小病毒方法簡單易于操作，反應靈敏度高，結(jié)果真實可信，適用于CPV的快速檢測。林彥星等[29]建立了非洲豬瘟病毒（African swine fever virus）核酸LFD-RPA的快速檢測法。該方法以非洲豬瘟病毒B646L基因保守區(qū)序列為依據(jù)，設(shè)計nfo RPA特異性引物和探針，結(jié)果表明，該方法高特異性，且不與PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV及SVA等病原核酸發(fā)生反應；最低可以檢測到1.57 102copies/L重組質(zhì)粒pUC-B646L；檢測快速，其中RPA擴增20 min，LFD檢測10～20 min。應用該法對24個模擬樣品進行檢測，檢測結(jié)果與RT-PCR法一致。該研究建立的LFDRPA快速檢測方法操作方便簡單，為ASFV現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)支持。焦健等[30]建立快速檢測蘋果病毒的RT-RPA方法，其以蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus）、蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus）和蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus）為檢測對象，通過設(shè)計特異性RPA引物以及探索反應最適條件，與傳統(tǒng)RT-PCR方法比較其靈敏度、特異性，結(jié)果顯示所設(shè)計的RPA引物特異性高，最適反應溫度為37℃，反應時間為20 min，RT-RPA對4種蘋果病毒的檢測靈敏度為9.63 101copies，是傳統(tǒng)RT-PCR的102～103倍。

4.2 RPA對細菌的檢測

王素華等[31]基于炭疽桿菌BA5345基因建立了有效檢測炭疽桿菌的RPA方法，在39℃水浴鍋中反應30 min即可實現(xiàn)對目的基因片段的有效擴增，對重組質(zhì)粒pUC57-BA5345的最低檢測限為102copies/L，利用該研究建立的RPA方法對35份污染樣品進行檢測，檢測的陽性率（65.71%）較常規(guī)PCR檢測的陽性率（42.86%）更高。劉立兵等[32]建立了沙門氏菌的RPA檢測方法。該研究選擇檢測的靶基因為沙門氏菌invA基因，設(shè)計特異性引物，反應溫度為38℃，在水浴鍋中反應20 min即可完成檢驗。此方法操作簡便，特異性高，靈敏性可達到1.1 10-3ng/L。劉昂[33]等依據(jù)之前測序鑒定的羊源多殺性巴氏桿菌KMT1基因序列構(gòu)建了pET-28a(+)-KTM1標準質(zhì)粒，設(shè)計適用于RT-RPA技術(shù)的特異性引物及熒光探針，建立RT-RPA方法的最適反應體系，結(jié)果顯示，該試驗建立的RTRPA方法最適反應溫度為39℃，最佳引物為KMT1-Fe1，靈敏度達100 kb/L，檢測下限為10 kb/L，與大腸桿菌（Escherchia.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副 傷 寒 沙 門 氏 菌（Salmonella paratyphi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、布魯氏菌S2株（Brucella S2 strain）和鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）均無交叉反應。對13個組織樣本進行檢測，陽性率為76.9%，與RT-PCR檢測結(jié)果的符合率達92.3%。綜上所述，該實驗建立的羊源多殺性巴氏桿菌RT-RPA方法具有特異性強、靈敏性高、安全可靠和快捷等特點，可用于臨床診斷多殺性巴氏桿菌。

4.3 RPA對寄生蟲的檢測

王盛琳等[34]基于RPA技術(shù)，建立出一種可在等溫環(huán)境下檢測日本血吸蟲核酸的方法，該方法敏感性強、特異性高、簡便且快速。該研究以Sj28S基因片段為靶序列，在39℃條件下，20 min即可完成對目的基因的擴增。該方法與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、單尾尾蚴感染釘螺、華支睪吸蟲、大片形吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲和牛帶絳蟲及陰性釘螺基因組DNA均無交叉反應，具有良好的特異性。敏感性試驗結(jié)果顯示，所建方法最低可檢出100 fg/L的日本血吸蟲成蟲基因組DNA，或者是100 copies/L的目的基因。Li等[35]建立了一種檢測旋毛蟲（Trichinella.）的LF-RPA方法，該LFRPA方法可檢測100 fg DNA，而傳統(tǒng)PCR方法只能檢測到1 pg DNA，LF-RPA檢測靈敏度約為傳統(tǒng)PCR方法的10倍。在對實驗感染旋毛蟲組和對照組小鼠的舌組織樣品、膈膜組織樣品和腹肌組織樣品的檢測中，LF-RPA法和傳統(tǒng)PCR法均可檢測到感染，實驗感染小鼠的組織，對照組中都未出現(xiàn)假陽性。Yuan等[36]通過建立LF-RPA方法檢測爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogynejavanica），該方法檢測限為1 pg純化基因組DNA，或0.01個雌成蟲，或0.1個第2期幼蟲，靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的檢測方法。檢測16個土壤樣品，用直接從土壤中提取的DNA進行LF-RPA檢測，10個人工接種的爪哇根結(jié)線蟲樣品中只有3個樣品檢測為陽性，而用改進的Baermann漏斗法從土壤樣品中分離的線蟲gDNA，所有人工接種的爪哇根結(jié)線蟲樣品均被檢測為陽性；所有不含根結(jié)線蟲的土壤和人工接種南方根結(jié)線蟲的土壤樣本均未檢測到陽性。Xing等[37]建立了基于高重復反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座SjR2基因的檢測日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）的RPA方法，RPA方法的檢測限為0.9 fg，與實時PCR相當。用RPA方法對30份感染糞便標本和30份未感染糞便標本進行分析，其結(jié)果與改良加藤氏厚涂片法結(jié)果一致，敏感性和特異性均為100%。在對200名居民的糞便標本檢測中，使用毛蚴孵化試驗被確認為陽性61人（31.5%），其中包括使用改良加藤氏厚涂片法檢測為陽性的48人（24%），隨后，將這200份糞便標本分別進行RPA、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和間接血凝試驗（IHA），結(jié)果顯示，RPA檢測出了陽性患者66名，其中包括5名假陽性，陰性患者134名；ELISA檢出陽性患者72名，其中假陽性患者23名，陰性患者128名，其中假陰性患者12名；IHA檢出陽性患61名，其中假陽性患者9名，陰性患者139名，其中假陰性患者9名。ELISA和IHA的靈敏度和特異度分別為85.2%和93.5%，80.3%和83.4%，RPA的靈敏度和特異度為100%和96.4%，該RPA方法較好地改善了現(xiàn)有檢測技術(shù)對低負荷感染不敏感的問題。Kate等[38]對比建立了基于曼氏血吸蟲（S.mansoni）ITS基因和28SrDNA基因的LF-RPA方法，基于28S基因的LF-RPA方法有著更好的特異性和敏感性，其檢測靈敏度限為10 pg DNA。

5 前景展望

RPA作為在恒定溫度條件下反應的新型核酸體外擴增技術(shù)，具有耗時短、靈敏度高、特異性強及操作簡單等獨特的優(yōu)越性，引起了科研人員的大量關(guān)注[39]。但重組酶聚合酶擴增技術(shù)作為一種新興起的等溫檢測技術(shù)，仍存在著一些缺點和不足，需進一步完善。盡管RPA存在一些不足，但隨著科學家們RPA技術(shù)的不斷應用和探索，將會改善這些不足，引起一場核酸檢測的革命，使RPA技術(shù)在不同領(lǐng)域尤其病原現(xiàn)場檢測中發(fā)揮更多的作用。