擬柱孢藻毒素生物合成的分子基礎與進化特征

蔣永光，王志高，王純波

(1.中國地質大學 環(huán)境學院，武漢 430074;2.中國科學院 水生生物研究所，武漢 430072)

水體富營養(yǎng)化和藍藻水華的頻繁暴發(fā)是工業(yè)化社會典型的重大環(huán)境問題，加之全球氣候變暖對藍藻生長的促進作用，藍藻水華已經(jīng)在世界范圍內引起了廣泛重視[1-2].水華藍藻產(chǎn)生的藍藻毒素給飲用水安全帶來了極大風險[3].1979年，澳大利亞昆士蘭州棕櫚島上的許多居民(多數(shù)是兒童)因為飲用水中毒突發(fā)肝因性腸炎.流行病學調查發(fā)現(xiàn)水源地暴發(fā)的拉氏尖頭藻(原名拉氏擬柱孢藻，Raphidiopsisraciborskii)水華產(chǎn)生了致病性物質，導致了飲用水污染，該物質最終被鑒定為擬柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，簡稱CYN)[4-7].小鼠腹腔注射實驗表明，CYN的半數(shù)致死劑量(LD50)約為200 μg/kg體質量，在注射毒素5～6 d后發(fā)生致死效應[6].該毒素對肝臟、胸腺、腎臟和心臟等多個器官均有毒性，肝臟是主要的靶器官[8].在致毒機理方面，研究表明CYN能夠抑制蛋白質、還原型谷胱甘肽以及尿嘧啶核苷酸的合成[9-11]，還會誘導DNA雙鏈斷裂，具有遺傳毒性[12].有關CYN毒理的詳細資料可以參考已經(jīng)發(fā)表的綜述[13-16].

CYN的化學結構主要由三環(huán)胍基、羥甲基尿嘧啶和硫酸基團組成(圖1)，分子式為C15H21N5O7S(m=415 u)，是一種兩性離子生物堿，具有水溶性[6].由于第7位碳原子(C7)是手性結構，CYN還存在一種對映異構體，即7-epi-CYN[17].此外，C-7缺少羥基修飾的CYN結構類似物稱為脫氧擬柱孢藻毒素(7-deoxy-CYN)[18]，第12位碳原子(C12)的硫酸基團修飾也缺失的類似物稱為脫氧脫硫擬柱孢藻毒素(7-deoxy-desulfo-CYN).C12上的硫酸基團被乙?；〈念愃莆锸?-deoxy-desulfo-12-acetyl-CYN[19].毒理學實驗表明7-epi-CYN與CYN有相似的毒性，而7-deoxy-CYN 未顯示出毒性效應，因此，C7的羥基是產(chǎn)生毒性的必要結構，并且尿嘧啶基團也是產(chǎn)生毒性所必需的[17-21].

拉氏尖頭藻水華原本主要發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū).近年來，該種水華藍藻在全球范圍內快速擴散，其水華發(fā)生頻次也不斷增加[22-24].此外，在其他水華藍藻，如彎形尖頭藻(R.curvata)、地中海尖頭藻(R.mediterranea)、魚腥藻(Anabaena)、束絲藻(Aphanizomenon)和顫藻目的Kamptonema(原名Oscillatoria)中也陸續(xù)檢測到了產(chǎn)CYN的藻株[25-33].迄今為止，除南極外，其他大陸的水體中均有檢測到CYN的報道[34].該種毒素的污染及其引起的飲用水安全風險和生態(tài)風險也日益引起學術界和管理部門的廣泛關注.CYN的合成與產(chǎn)量受到溫度、光照以及氮、磷和硫元素的供應等多種環(huán)境因子的影響[35-41]，但是，由于不同研究者所用的藻株和實驗條件的差異，得出的結論往往缺乏一致性.細胞內CYN的合成是由特定的毒素基因控制的[42].環(huán)境因子對毒素產(chǎn)生的調節(jié)作用都要通過影響毒素基因的表達或酶的活性來實現(xiàn).

藍藻等微生物含有豐富的次級代謝產(chǎn)物.這些結構多樣的化合物的生物合成往往是由一系列的酶催化反應完成的，包括眾多具有多個結構域的多功能酶，以及一般的代謝酶和修飾酶[43-44].這些合成酶的編碼基因多數(shù)在基因組上彼此毗鄰，甚至共用一個轉錄起始位點，這種特殊的基因排列稱為基因簇(gene cluster).非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)和聚酮合酶(polyketide synthase,簡稱PKS)是參與藍藻毒素分子骨架構建的兩類主要的多功能酶.NRPS的基本結構包括氨酰基腺苷酸化域(A)、肽鍵縮合域(C)和肽基載體蛋白(PCP)3個部分，分別具有特異性氨基酸激活、肽鏈延長和肽基運載的功能.另外，NRPS還含有氨基轉移酶(AMT)和差向異構酶(Ep)等修飾酶結構域.PKS的基本結構包括酰基轉移酶(AT)、β-酮合成酶(KS)和?；d體蛋白(ACP)3個部分，還常含有酮還原酶(KR)、脫氫酶(DH)、烯酰基還原酶(ER)和甲基轉移酶(MTF)等修飾酶結構域.處于鏈延長反應末端的NRPS和PKS還含有硫酯酶(TE)結構域，具有釋放成熟化合物的功能.

為了便于從分子水平上加深對CYN產(chǎn)生的了解，建立有效的分子手段用于產(chǎn)毒藻(如無特殊說明，下文所說的產(chǎn)毒藻均指產(chǎn)CYN及其結構類似物的藻株)的檢測和評估水體藻類產(chǎn)毒潛力及其與環(huán)境因子的關聯(lián)性，本文結合作者前期的研究工作積累，對CYN合成基因及其進化特征的研究進展進行系統(tǒng)總結.

1 CYN合成的分子機理

1.1 CYN的合成基因

MIHALI等首先從產(chǎn)毒藻株R.raciborskiiAWT205中擴增出了完整的CYN合成基因簇(cyrcluster)[42]，全長43 kb，含有15個開放閱讀框(圖2A)，包括：脒基轉移酶基因cyrA，NRPS/PKS雜合基因cyrB，4個PKS基因cyrC～cyrF，胞嘧啶脫氨基酶的同源基因cyrG和cyrH，磺基轉移酶基因cyrJ，羥基化酶基因cyrI，鈉離子轉運蛋白的同源基因cyrK，腺苷酰硫酸激酶基因cyrN，推測的調控因子cyrO，以及不參與毒素合成的轉座酶基因cyrL和cyrM.在產(chǎn)毒藻R.raciborskiiCHAB3438[45]、R.curvataCHAB1150[46]、Aphanizomenonsp.10E6[47]和Kamptonemasp.PCC 6506[30]的cyr基因簇中未發(fā)現(xiàn)cyrN和cyrO(圖2).MAZMOUZ等認為cyrN基因是參與硫元素基礎代謝的持家基因，并非特異性的毒素基因[30].但是，JIANG等通過對尖頭藻中的產(chǎn)毒藻株和不產(chǎn)毒藻株進行基因檢測和比較表明，cyrN僅存在于產(chǎn)毒藻株中，推測其是cyr基因簇特有的[45-46]，在尖頭藻中還有另一個預測的腺苷酰硫酸激酶基因可能與基礎代謝有關[48].此外，cyrO存在于所有尖頭藻中，推測其不是cyr基因簇特有的[45-46]，但是cyrO是否參與毒素合成的調控仍不清楚.

1.2 CYN合成路徑

同位素標記實驗表明胍基乙酸分子能夠整體嵌合到CYN分子骨架中[49]，因此，CYN可以看作是由胍基乙酸起始合成的聚乙酰鏈結構.毒素分子中的碳原子分別來源于甘氨酸，5個乙酸單位和一碳單位，尿嘧啶基團是毒素合成過程中形成的，并非直接來源于含尿嘧啶的底物[49].因此，CYN的合成過程是由NRPS和PKS參與完成的.MIHALI等根據(jù)同位素標記實驗和生物信息學分析的結果，推測了圖3所示的CYN合成路徑[42].

1.2.1CyrA催化的起始反應

轉脒基酶是將供體分子的脒基轉移到受體分子的氨基上，形成胍基基團.精氨酸:甘氨酸轉脒基酶主要存在于脊椎動物和植物中，是胍基化合物合成的關鍵酶，在脊椎動物能量代謝(如肌酸合成)和高等植物次級代謝物的合成中有重要作用[50-52].蛋白質模型分析表明CyrA與人類精氨酸:甘氨酸轉脒基酶(AGAT)具有較高的結構相似性，且參與底物結合的氨基酸位點也高度保守，具有利用精氨酸和甘氨酸作為底物的結構特征[53].MUENCHHOFF在大腸桿菌中表達和純化了CyrA，并加入精氨酸和甘氨酸進行體外酶活性表征，利用核磁共振氫譜鑒定出反應產(chǎn)物中含有胍基乙酸以及精氨酸脫去脒基后的鳥氨酸[54].底物類似物添加實驗表明CyrA的底物特異性比AGAT更高，脒基供體的羧基是與酶蛋白結合時所必需的，進一步的點突變實驗表明CyrA活性位點的第245和247位氨基酸對于底物特異性和活性位點穩(wěn)定性至關重要[54-55].另外，CyrA催化反應的初始速率、中間產(chǎn)物和產(chǎn)物抑制特征表明該酶的反應動力學具有乒乓反應和隨機順次反應的雙重特征，酶分別在pH 8.5和pH 6.5時具有最大活性和最大穩(wěn)定性，其最適溫度為32 ℃[54].此外，蛋白純化鑒定的結果表明CyrA在細胞內以二聚體和四聚體形式存在[54].盡管體外實驗提供了較為確鑿的證據(jù)，BURGOYNE等在培養(yǎng)的產(chǎn)毒藻中未能檢測到同位素標記的精氨酸脒基轉移到胍基乙酸[49]，該結果可能是由于藻細胞不能攝取外源添加的精氨酸所致[53].另外，也有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒藻和不產(chǎn)毒藻都可以積累胍基乙酸，說明藍藻中還存在其他胍基乙酸生成途徑[56].以上研究結果表明CyrA是第一個在原核生物中發(fā)現(xiàn)的精氨酸:甘氨酸轉脒基酶，催化CYN合成的起始反應，將精氨酸的脒基轉移到甘氨酸的氨基上形成胍基乙酸[53-54].

1.2.2CyrB催化第一步碳鏈延長反應

在預測的參與碳鏈延長反應的5個多功能酶中(CyrB～CyrF)，只有CyrB含有NRPS的A結構域(CyrB-A)，具有結合并激活起始底物的功能.但是，已知的A結構域都不能利用胍基乙酸作為底物[42].通過比較多種A結構域底物結合區(qū)的氨基酸殘基，KELLMANN等發(fā)現(xiàn)A結構域的第一個位點都是天冬氨酸，可以與底物氨基酸的α氨基形成氫鍵，第8個位點一般是疏水性氨基酸，但CyrB-A是天冬氨酸，推測CyrB-A的兩個天冬氨酸有可能與胍基乙酸的2個氨基形成氫鍵，從而促進該底物的識別和結合[53].利用短桿菌肽合成酶(GrsA)的結構模型對CyrB-A進行的建模分析也表明胍基乙酸能夠嵌入到其底物結合區(qū)[53].CyrB-A激活胍基乙酸后，可通過PCP的擺動臂將其轉移到KS結構域.與此同時，AT結構域激活一分子丙二酰CoA，使其結合到ACP上，在KS催化下與胍基乙酸發(fā)生縮合反應，完成第一個乙酸單位的添加.

CyrB的KR和DH結構域可以協(xié)同催化將來源于胍基乙酸的酮基還原并脫水，形成第13位和14位碳原子之間的烯鍵(C13=C14).CyrB的MTF結構域與S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶同源，預測其催化了C13的甲基化.同位素標記實驗也證實C13上的甲基來源于S-腺苷甲硫氨酸[49].此外，用氘代乙酸作為C13前體的實驗也表明CYN合成過程中C13上的全部氘原子均被去除，最后產(chǎn)物分子中C13上的氫原子是反應過程中添加的，間接證明了上述反應過程推測的合理性.

CYN分子中三環(huán)結構的形成機制尚不清楚，CyrB催化的反應完成后，線性產(chǎn)物可能直接進入下一步碳鏈延長反應[53].MIHALI等提出CyrB催化反應的產(chǎn)物可能發(fā)生環(huán)化，即第19位脒基氮可以通過“Michael加成反應”的方式親核攻擊上述烯鍵，并與C14鍵合，生成CYN分子骨架中的第一個環(huán)狀結構，即五元含N雜環(huán)[42].根據(jù)鮑德溫規(guī)則，這一分子內關環(huán)反應在能量上是有利的，可以在無酶催化的條件下隨機發(fā)生[57].

1.2.3PKS催化添加4個乙酸單位

毒素合成基因簇編碼了4個PKS，其中CyrC包含KS,AT,KR,ACP 4個結構域，能夠在鏈延長反應后還原酮產(chǎn)生一個羥基.CyrD和CyrE均包含KS,AT,KR,DH,ACP 5個結構域，都能夠在鏈延長反應后還原酮并脫水產(chǎn)生一個烯鍵.CyrF僅包含KS,AT,ACP 3個結構域，鏈延長反應產(chǎn)物含有2個酮基.根據(jù)酶反應產(chǎn)物的特征、CYN的化學結構和同位素標記實驗結果可以推測催化反應順序依次為CyrC,CyrD和CyrE,CyrF[42].

首先，同位素標記實驗表明CYN的C12上單鍵鍵合的氧原子來自乙酸前體，是由酮基還原產(chǎn)生[49].氘代乙酸培養(yǎng)實驗也表明CYN合成過程中C11上的2個氘原子都沒有丟失，說明C11沒有經(jīng)歷脫氫反應[49].這兩個結果表明，C11與C12鍵合后的產(chǎn)物只發(fā)生了酮基還原，符合CyrC的催化反應特征.因此，可以推測CyrB催化反應的產(chǎn)物轉移到了CyrC的KS結構域，在其催化下添加第2個乙酸單位，隨后CyrC的KR結構域催化C12位上的酮基還原成羥基.

CyrD和CyrE具有相同的結構域組成，尚不清楚二者的反應順序.以CyrD為例，其KS結構域結合CyrC催化反應的產(chǎn)物，催化添加第3個乙酸單位.CyrD的KR和DH結構域依次催化C10位上的酮基還原和脫水形成烯鍵(C9=C10).氘代乙酸培養(yǎng)實驗表明CYN合成過程中C9上僅保留了1個氘原子，證明C9確實經(jīng)歷了脫氫反應[49].CyrD催化反應產(chǎn)物的第19位脒基氮可以通過“Michael加成反應”的方式親核攻擊上述烯鍵，并與C10鍵合，生成CYN分子骨架中的第2個環(huán)狀結構，即六元含N雜環(huán)[42].

CyrE的KS結構域結合上述含有并環(huán)的產(chǎn)物，催化添加第4個乙酸單位.其KR和DH結構域依次催化C8上的酮基還原和脫水形成烯鍵(C7=C8).氘代乙酸培養(yǎng)實驗表明CYN合成過程中C7位上的氘原子均被去除，證明C7確實經(jīng)歷了脫氫反應[49]，并且C7位的羥基也不是來源于乙酸，而是在修飾酶催化下添加的.CyrE催化反應產(chǎn)物的第18位氮也可以通過“Michael加成反應”的方式親核攻擊上述烯鍵，并與C8鍵合，生成CYN分子骨架中的第2個六元含N雜環(huán)[42]，CYN的三環(huán)結構得以形成.這一中間產(chǎn)物與CyrF的KS結構域結合，在其催化下添加第5個乙酸單位，產(chǎn)物的C4和C6上各有1個未被還原的酮基.

1.2.4CyrG和CyrH催化尿嘧啶環(huán)的形成

同位素分析表明C4上的氧原子來自乙酸前體，說明尿嘧啶環(huán)是在毒素合成過程中形成的，是一種新的尿嘧啶合成途徑.該途徑包括C4和C6共同與1個脒基的2個氮原子鍵合[42,49].CyrG和CyrH具有較高相似度，均是胞嘧啶脫氨基酶的同源蛋白，表明二者與氮碳鍵的形成有關，且催化相似的反應.因此，CyrG和CyrH有可能催化了第2個脒基與碳鏈的鍵合反應.當脒基的第1個氮與C6鍵合時，C6上的羥基在脫水反應中被去除，并形成1個烯鍵(C5=C6).脒基的第2個氮與C4鍵合，同時伴隨著中間產(chǎn)物分子與CyrF-ACP之間硫酯鍵的斷裂，該產(chǎn)物就是7-deoxy-desulfo-CYN.由于CyrF缺少TE結構域，不能催化硫酯鍵的水解，間接表明了上述反應過程推測的合理性.由于產(chǎn)物分子中脒基碳(C2)上是羰基，脒基的供體可能是尿素分子或者含胍基的化合物(如精氨酸)，胍基供體的碳鏈以類似脫氨的方式與脒基分離，該反應可能也是由CyrG或CyrH催化的.

1.2.5CyrJ和CyrN協(xié)同催化7-deoxy-desulfo-CYN的硫酸化

在CYN的結構類似物中，7-deoxy-CYN應當是由7-deoxy-desulfo-CYN經(jīng)硫酸化反應生成的，推測CyrJ催化磺基轉移到7-deoxy-desulfo-CYN的C12羥基，生成7-deoxy-CYN[42].CyrN催化的產(chǎn)物3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)為CyrJ提供活化的硫酸基團.另一結構類似物7-deoxy-desulfo-12-acetyl-CYN是在C12羥基上鍵合了乙?；?，其生成機制尚不清楚，推測是O-?；D移酶催化了這一反應[58].已知的cyr基因簇中都沒有編碼這種酶的基因，因此，需要對發(fā)現(xiàn)這一化合物的藻株進行基因組測序分析，以期確定O-?；D移酶的來源.

1.2.6CyrI催化7-deoxy-CYN的羥基化

CyrI與2-酮戊二酸依賴的鐵氧化酶(2-ODIO)同源，而2-ODIO在真核和原核生物中廣泛存在，催化各種氧化反應.將CyrI的蛋白序列與2-ODIO進行比對，可以發(fā)現(xiàn)CyrI的二級結構中含有在2-ODIO中高度保守的二價鐵和2-酮戊二酸結合區(qū)域，說明CyrI具有氧化酶的特征[59].體外表達和酶催化實驗表明CyrI能夠催化7-deoxy-CYN 的C7羥基化生成CYN或7-epi-CYN[59].此外，CyrI不會將C7的羥基氧化成酮，也不具有差向異構酶的活性，不能介導CYN和7-epi-CYN的轉變[59].對于CyrI催化產(chǎn)生兩種手性異構體CYN或7-epi-CYN的機制，MAZMOUZ等[59]調查了不同產(chǎn)毒藻的CyrI蛋白序列相似度，以及手性異構體的含量和比例，發(fā)現(xiàn)CyrI蛋白可以分成兩種基因型，分別對應于高比例的CYN和7-epi-CYN.因此，CyrI蛋白依其本身的序列和結構特征具有一定的立體選擇性，二級結構中的1個α-螺旋可能是立體選擇性的調控元件[60].JIANG等分離鑒定了含有CyrI天然堿基突變和插入突變的產(chǎn)毒藻株，這些藻株只能合成7-deoxy-CYN，為CyrI功能的鑒定提供了進一步的證據(jù)[45-46].另一種藍藻毒素石房蛤毒素的合成基因簇也編碼了類似CyrK的轉運蛋白，SxtF和SxtM，研究表明藻細胞能夠在鈉離子和鉀離子誘導下排出石房蛤毒素，恰好與這兩個蛋白的功能相一致[61].因此，推測CyrK也具有輔助藻細胞響應鹽離子排出毒素的功能，但是還需要實驗驗證.另外，JIANG等分離了具有單堿基缺失的CyrK的產(chǎn)毒藻株，這些藻株的CyrK的C端缺失了部分氨基酸，但是毒素的排出并未被阻斷，可能C端部分氨基酸缺失不會顯著影響CyrK的功能[45].

2 CYN合成基因表達的調節(jié)

澳大利亞拉氏尖頭藻的cyr基因簇缺少明顯的啟動子區(qū)域，且在基因組上定位于氫化酶基因簇(hyp)中[42,62]，而hyp基因的表達受到氮代謝調控因子(NtcA)的調節(jié)[63]，推測cyr基因簇可能也受到NtcA調控.NtcA能夠激活氮同化基因，這與拉氏尖頭藻在缺氮條件下毒素含量最高的結果相一致[64].此外，在從中國水體中分離的產(chǎn)毒尖頭藻中，只有cyrN位于hyp中，cyr基因簇主體已經(jīng)轉移到了基因組的其他位置[45].盡管如此，這些藻株仍表現(xiàn)出了受NtcA調控的特征，在缺氮條件下產(chǎn)毒量明顯增加[65].毒素產(chǎn)生還與固氮作用相關，缺氮和富磷的組合條件下拉氏尖頭藻的生長率增加，固氮作用增強，毒素合成量也增加[66].

SHALEV-MALUL等發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下束絲藻的細胞內毒素含量明顯減少[37]，但該研究沒有測定釋放到細胞外的毒素.由于胞外毒素最高可能占到總毒素的50%以上，尚不能確定束絲藻產(chǎn)毒過程對氮供給的響應特征[65].在束絲藻中，反向轉錄的cyrA和cyrC基因各有2個轉錄起始位點.在缺氮和高光的脅迫下基因轉錄起點不同，其表達量比氮充足和低光時較低，毒素的產(chǎn)量也較低，但與基因表達量的變化程度不完全一致，說明毒素合成還受到轉錄后調控[37].與cyrA和cyrC的啟動子區(qū)特異結合的AbrB蛋白(細胞轉換態(tài)調控因子)也已經(jīng)被分離出來，推測其參與了轉錄調節(jié)過程[37].然而，如圖2所示，在尖頭藻和顫藻中cyrA和cyrC的間隔區(qū)已經(jīng)被破壞，AbrB蛋白是否還能結合到新的啟動子區(qū)還有待研究.另外，BAR-YOSEF等還發(fā)現(xiàn)橢胞束絲藻(Aphanizomenonovalisporum)毒素基因的表達量在缺磷條件下升高，相應的毒素產(chǎn)量也增加[41].但在拉氏尖頭藻中，毒素基因的表達相對穩(wěn)定，不受磷缺乏的影響，毒素產(chǎn)量與生長率正相關，在低磷條件下產(chǎn)量也低[67].因此cyr基因的表達調控模式在不同藻株中存在差異，即具有藻株特異性.

3 CYN合成基因的進化特征

微生物次級代謝產(chǎn)物與其生物學和生態(tài)學功能密切相關[43]，藍藻毒素合成基因的進化過程可以基于其現(xiàn)生階段的某些生理作用做簡單推測，但是缺少確鑿的證據(jù).盡管如此，研究者仍可以根據(jù)毒素合成基因簇的排列模式和序列變異來對其進化特征進行分析[68].例如，微囊藻毒素合成基因與16S rRNA基因具有共進化特征，結合產(chǎn)微囊藻毒素種類已知的最早化石記錄，推測微囊藻毒素的起源早于后生動物，因此，該毒素并不是藍藻在抵御后生動物捕食過程中進化出來的[69].

3.1 cyr基因簇的重排現(xiàn)象

目前已經(jīng)報道的產(chǎn)CYN藻的cyr基因簇在基因組上的排列方式具有明顯的地域性和種間差異(圖2).從澳大利亞分離的拉氏尖頭藻均具有圖2(A)所示的基因簇結構[42,62]，而從中國水體分離的尖頭藻均具有圖2(B)或圖2(C)所示的cyr基因排列方式[45-46].尖頭藻和束絲藻均屬于念珠藻目，在這些產(chǎn)毒藻中，cyr基因簇整體上是由4個模塊片段按不同的排列順序構成，包括2個多順反子片段：S1(cyrA-cyrB-cyrE)和S2(cyrD～cyrK)，以及單基因片段S3(cyrC)和S4(cyrN).因此，藻株的基因簇排列方式可以分為3種，以R.raciborskiiAWT205為代表的S2-S1-S3-S4，以R.raciborskiiCHAB3438為代表的S1-S3-S2和S4，以Aphanizomenonsp.10E6為代表的(S3-S2)(反向互補)-S1.不同藻株片段銜接位點的序列高度相似，說明以上cyr基因簇是由共同的原始結構形式重排產(chǎn)生.在Kamptonemasp.PCC 6506中，S2被分割成了不同的部分，分布于S1和S3的上下游.在Aphanizomenonsp.10E6和Kamptonemasp.PCC 6506中檢測到的腺苷酰硫酸激酶與CyrN相似度過低，不能確定其是否屬于cyr基因簇的S4.總體上，念珠藻目種類的cyr基因排列非常相似，具有一定的同線性(synteny)，并與顫藻的cyr基因排列高度分歧.毒素基因簇結構的差異程度與產(chǎn)毒藻的分類學差異相一致，表明cyr基因簇可能起源于藍藻祖先類群，在進化過程中發(fā)生了重排現(xiàn)象[45-47].

從圖2可以看出，在cyr基因簇中分布有較多的轉座酶及其殘余序列，這說明轉座機制可能介導了cyr基因簇的重排.JIANG等發(fā)現(xiàn)R.curvataCHAB1150的cyrI基因中存在轉座酶插入導致的基因失活，進一步證明了轉座酶在基因簇進化過程中的關鍵作用[46].澳大利亞拉氏尖頭藻的cyr基因簇定位于hypF和hupC基因之間[62]，中國拉氏尖頭藻和彎形尖頭藻的cyr基因簇主體部分定位于基因組其他位置，只有cyrN還留在這一位點[45].因此，在中國的兩種尖頭藻中，cyr基因簇主體部分發(fā)生了相似的基因組內位置轉移.系統(tǒng)發(fā)育分析表明中國水體和澳大利亞水體的產(chǎn)CYN拉氏尖頭藻可以聚成一類，彎形尖頭藻則形成獨立的分枝[48].這些結果表明cyr基因簇的位置轉移可能在尖頭藻祖先類群中就已經(jīng)發(fā)生，而澳大利亞藻株的cyr基因簇主體部分可能經(jīng)歷了第2次位置轉移，又回到了hypF和hupC基因之間.

3.2 cyr基因的保守性

基于產(chǎn)毒藻的cyr基因和16S rRNA基因所做的系統(tǒng)發(fā)育樹總體上是一致的，其拓撲結構與產(chǎn)毒藻分類地位相一致.這種一致性也對應了產(chǎn)毒藻株間cyr基因簇結構的共線性現(xiàn)象[45].因此，cyr基因與16S rRNA基因在一定程度上具有共進化的關系.但是，與16S rRNA基因的系統(tǒng)樹相比，在cyrA基因以及cyr基因串聯(lián)簇的系統(tǒng)發(fā)育樹中[45,53]，念珠藻目種類以更低的分歧度聚成一類，其cyr基因的相似度也要等于或高于16S rRNA基因，表明cyr基因在念珠藻目中具有高度的保守性[46-47].與之相反，念珠藻目產(chǎn)毒藻和顫藻在系統(tǒng)樹上具有明顯分歧，cyr基因的相似度也低于16S rRNA基因.

基因水平轉移(HGT)和凈化選擇是影響基因保守性的2個重要因素.STUCKEN等發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒藻在藍藻系統(tǒng)樹上的分布是隨機的，由此認為cyr基因是通過HGT在產(chǎn)毒藻中傳播的[70].在拉氏尖頭藻和束絲藻中，cyr基因簇與基因組上的相鄰區(qū)域相比具有較高的GC含量，進一步證實了HGT事件的可能[47].因此，念珠藻目產(chǎn)毒藻之間cyr基因的高度保守性可能是HGT事件的結果[45].另外，盡管念珠藻目種類的CyrK蛋白序列高度相似并與顫藻差異顯著，但是Aphanizomenonsp.10E6與Kamptonemasp.PCC 6506在相對更多位點上有相同的氨基酸，這些位點的氨基酸很有可能是從祖先蛋白繼承來的.也就是說束絲藻比尖頭藻更接近祖先產(chǎn)毒藻，因而推測cyr基因簇可能是從束絲藻轉移到了尖頭藻.此外，顫藻中cyrI基因的2種基因型在產(chǎn)毒藻株中的分布與藻株之間的系統(tǒng)發(fā)育距離并不一致[59]，推測cyr基因在顫藻中也是通過HGT傳播的[59].圖4顯示了cyr基因簇可能發(fā)生的HGT事件，為了進一步驗證HGT的可能，還需要對更多地理來源的產(chǎn)毒藻株進行cyr基因簇的測序分析.

通過分析蛋白質編碼基因受到的選擇壓力也可以解釋基因序列的保守性以及基因產(chǎn)物在維持細胞生命活動和環(huán)境適應中的重要性.凈化選擇經(jīng)常是許多重要基因保守進化的機制[71]，這種機制也可能影響了念珠藻目種類而非顫藻的cyr基因.JIANG等發(fā)現(xiàn)cyr基因的重組位點稀少且不具有顯著性，這與序列本身的保守性相一致[46].另外，cyr基因受到的選擇壓力并不一致，NRPS/PKS基因顯著偏離中性進化，并存在較多的負選擇位點，推測這些基因受到凈化選擇，但是在局部的進化分枝上也存在少量正選擇的位點[45].YILMAZ等利用環(huán)境DNA進行PCR擴增，獲得了美國佛羅里達州水體中橢胞束似藻的cyrB基因序列，發(fā)現(xiàn)其也受到凈化選擇[72].NRPS/PKS基因受到凈化選擇的內在機制尚不清楚.同種藍藻中既有產(chǎn)毒種類，也有不產(chǎn)毒種類，毒素的有無對藻細胞生長和生理似乎并沒有決定性作用.盡管如此，拉氏尖頭藻的產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株相比，其孔蛋白表達在缺鐵條件下顯著增強，對脅迫環(huán)境的耐受性也更強[73]，CYN可能介導了這種耐受性，但是還需要進一步的研究證據(jù).此外，cyrA,cyrG,cyrH,cyrI,cyrJ以及cyrK整體上處于中性進化，但存在負選擇和正選擇的部分位點[45].

3.3 cyr基因的變異特點

JIANG等測定了中國淡水水體中的cyrI和cyrJ基因序列，并將這些環(huán)境序列與產(chǎn)毒藻的相應基因序列匯總起來，根據(jù)序列變異特征劃分出了不同的基因型[45].對于cyrI基因，根據(jù)其插入序列和片段重復，可以分為4種類型(圖5(A)).已知的多數(shù)產(chǎn)毒藻cyrI基因屬于Itype1，其中部分序列含有堿基突變，并導致了基因內部的終止密碼子和cyrI基因失活.與Itype1相比，Itype2和Itype3中多出的序列并沒有改變基因的閱讀框，只是在相應的蛋白質序列內部出現(xiàn)了寡肽的重復拷貝，這些增加的肽段是否影響了基因的功能尚不清楚.Itype4比Itype1多了一段插入序列，引起了基因內部的終止密碼子和截斷的蛋白序列，導致了cyrI基因失活.這些插入序列含有反向末端重復，屬于典型的轉座元件.Itype4af和Itype4ar的插入序列反向互補，推測是轉座元件自身倒位形成的.Itype4b的插入序列內部包含一個完整的轉座酶編碼基因，證實了轉座元件在基因變異中的關鍵作用.

根據(jù)cyrJ基因序列中重復片段數(shù)目和核苷酸缺失情況可以將其分為3種類型(圖5(B)).其中Jtype2包括3種亞類型，Jtype2a含有兩個完整的重復片段，Jtype2b的第一個片段缺失了6聚核苷酸，Jtype2c在第2個片段中缺失了6聚核苷酸.已知的產(chǎn)毒藻株的cyrJ基因分別屬于Jtype2a和Jtype2c，毒素檢測結果表明這兩種亞類型均能催化硫酸化反應.與Jtype2比，Jtype1和Jtype3中重復片段的缺失和增加都沒有改變基因閱讀框，只是在相應蛋白質序列內部存在數(shù)目不同的寡肽重復拷貝，其酶活性特征還有待研究.

4 總結和展望

由于拉氏尖頭藻等產(chǎn)CYN藍藻尚缺乏有效的遺傳操作手段，有關毒素合成的生物學機制的研究多是基于生物信息學和化學結構分析所做的推測，少數(shù)基因的功能通過體外表達實驗得到了驗證.天然突變體的鑒定和表征與反向遺傳學手段類似，也可以驗證目的基因的細胞內功能，cyr基因較高的突變率為研究其功能提供了一種新的途徑.但是，天然突變體出現(xiàn)的概率與基因本身的特性有關，且總體較低，分離篩選工作量大.對CYN合成基因進化特征的分析表明，cyr并不是單一的進化路線，凈化選擇在部分基因中起到重要作用，HGT則影響了整個基因簇的進化過程.

根據(jù)國內外的研究進展，今后對CYN生物合成路徑的研究應當著重在以下幾個方向展開：分離純化無細菌污染的拉氏尖頭藻，建立可靠的反向遺傳學操作體系，對毒素基因進行定向敲除和回補，并檢測突變藻株的代謝產(chǎn)物，從而驗證目的基因的確切功能，分析毒素結構形成的中間產(chǎn)物和實際過程；探究毒素合成的調控機制，通過生物信息學分析和基因突變定位調控元件；通過多種產(chǎn)毒藻在同等條件下的檢測分析實驗，確定影響毒素合成的環(huán)境因子；在全球不同地域分離產(chǎn)毒藻株，測定其cyr基因簇結構，分析產(chǎn)毒藻及其毒素的起源；根據(jù)合成生物學的理論和方法，利用毒素合成路徑開展長鏈烷烴或含尿嘧啶化合物的生物合成研究.