功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦非特異性免疫力及抗氧化能力的影響

萬(wàn)金娟，薛暉，唐建清*，黃鴻兵，孟祥龍，田立立，孫敏，陳風(fēng)蔚

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009）

克氏原螯蝦（）俗稱小龍蝦，隸屬甲殼綱（Cmstacea），十足目（Decapoda），螯蝦科（Cambaridae），因其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美以及特殊的飲食文化而受到消費(fèi)者青睞。近年來(lái)，克氏原螯蝦的養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)克氏原螯蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)208.96萬(wàn)t，養(yǎng)殖總面積達(dá)128.6萬(wàn)hm，與2018年相比分別增長(zhǎng)27.52%和14.80%；其產(chǎn)量占淡水蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的50%以上，成為我國(guó)目前重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象。隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其病害問(wèn)題也逐漸凸顯，給克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大損失。因此，如何提高克氏原螯蝦自身免疫力和健康狀況是產(chǎn)業(yè)迫切需要解決的問(wèn)題之一。

隨著濫用抗生素造成的危害日漸為人們所知，在養(yǎng)殖過(guò)程中使用適當(dāng)?shù)墓δ苄燥暳咸砑觿?，以提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力，增強(qiáng)其抗病性成為當(dāng)下研究的重點(diǎn)。其中，中草藥飼料添加劑已被報(bào)道在提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力上發(fā)揮著重要作用。穿心蓮、大青葉、大黃、辣蓼等是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有激活機(jī)體免疫因子、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化、抗病毒等功效；?；撬嵬瑯颖蛔C實(shí)具有促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗急性脅迫的能力。但有關(guān)飼料中添加中草藥和?；撬岬膹?fù)合添加劑對(duì)克氏原螯蝦的影響尚未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)通過(guò)功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦非特異性免疫力和抗氧化能力的影響的試驗(yàn)，以期為克氏原螯蝦功能性飼料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、花生粕、豆粕等為蛋白源，豆油、大豆磷脂油為脂肪源，配制基礎(chǔ)日糧，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分分析見(jiàn)表1和表2。同時(shí)，在基礎(chǔ)日糧中添加2%功能性飼料添加劑（項(xiàng)目組研制，其主要成分為穿心蓮、大青葉、大黃、辣蓼、?；撬岬龋?，制成功能性飼料。試驗(yàn)飼料按照克氏原螯蝦商品料由江蘇海普瑞飼料有限公司加工制作。

表1 飼料組成① %

表2 飼料營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)） %

1.2 試驗(yàn)蝦與飼養(yǎng)管理

克氏原螯蝦由江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（克氏原螯蝦）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系基地提供。試驗(yàn)池塘位于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地。蝦運(yùn)至基地后，先在水泥池中暫養(yǎng)、馴化7 d，隨后挑選附肢完整、體格健壯、規(guī)格基本一致的幼蝦[初均體質(zhì)量（9.84±1.17）g]，隨機(jī)分為2組（對(duì)照組D1，投喂普通商品料；試驗(yàn)組D2，投喂功能性飼料），放入養(yǎng)殖池塘中。為保證2組養(yǎng)殖試驗(yàn)條件的一致性，將1 334 m的塘從中間用防逃網(wǎng)隔成兩個(gè)667 m的試驗(yàn)小塘口（栽種等量的水草）。每個(gè)試驗(yàn)塘各投入15 kg幼蝦。試驗(yàn)期間，每天19：00定量投喂1次，初始投飼量為蝦總體質(zhì)量的4%，隨后日投飼量根據(jù)蝦的吃食情況進(jìn)行調(diào)整，保證不過(guò)剩；減少人為干擾，每日觀察蝦的攝食及死亡情況，并及時(shí)將死蝦撈出，查明死亡原因，做好記錄；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水質(zhì)情況。

1.3 采樣與處理

在正式投喂前（0 d）以及投喂后10，20，30，40 d分別采樣，每次采樣前禁食24 h。采樣時(shí)，從每個(gè)試驗(yàn)塘隨機(jī)選取體質(zhì)量基本一致的雌、雄蝦各3尾，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，用1 mL的一次性注射器從每尾蝦的頭胸甲后部刺入心臟，抽取0.5 mL血淋巴，放入裝有等量抗凝劑（140 mmol/L NaCl，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸三鈉，26 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L NaDTA，pH值4.6）的1.5 mL離心管內(nèi)，4℃靜置4 h，然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，用于部分生理生化指標(biāo)測(cè)定。隨后解剖，取出肝胰腺，置于-20℃冰箱中保存，用于檢測(cè)抗氧化指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血淋巴生化指標(biāo)的測(cè)定

選取溶菌酶（LZM）、堿性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）活性作為非特異性免疫指標(biāo)。LZM、ALP、ACP的活性采用相應(yīng)試劑盒方法測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.4.2 肝胰腺抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

選取超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）作為抗氧化指標(biāo)。SOD、CAT活性及MDA含量采用相應(yīng)試劑盒方法測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

同一采樣時(shí)間不同組之間的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件中獨(dú)立樣本檢驗(yàn)（Independent samples-test）進(jìn)行差異顯著性分析；同一組不同采樣時(shí)間之間的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏多重比較法進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，當(dāng)＜0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著投喂時(shí)間的增加，2組蝦血淋巴溶菌酶活力呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。在投喂前及投喂后第10、20天時(shí)，2組間溶菌酶的活力差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；投喂后第30、40天時(shí)，功能性飼料組蝦的溶菌酶活力均顯著高于對(duì)照組（＜0.05）。

圖1 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影響

2.2 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著投喂時(shí)間的增加，2組蝦血淋巴堿性磷酸酶的活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）時(shí)，兩組間堿性磷酸酶的活性差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；投喂后第10、20天時(shí)，功能性飼料組蝦的堿性磷酸酶活力均顯著高于對(duì)照組（＜0.05）。

圖2 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

2.3 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著投喂時(shí)間的增加，兩組蝦血淋巴酸性磷酸酶活性的變化同堿性磷酸酶一致，均呈先升高后降低的趨勢(shì)。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）時(shí)，2組間酸性磷酸酶的活性差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；投喂后第10、20天時(shí)，功能性飼料組蝦的酸性磷酸酶活力均顯著高于對(duì)照組（＜0.05）。

圖3 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

2.4 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著投喂時(shí)間的增加，兩組蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性呈略有降低的趨勢(shì)。在投喂前、后，兩組間超氧化物歧化酶的活性均差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

圖4 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

2.5 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著投喂時(shí)間的增加，兩組蝦肝胰腺過(guò)氧化氫酶的活性呈逐漸降低的趨勢(shì)。在投喂前、后，兩組間過(guò)氧化氫酶的活性均差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

圖5 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

2.6 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響

功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著投喂時(shí)間的增加，兩組蝦肝胰腺丙二醛的含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。在投喂前及投喂后第10、40天時(shí)，兩組間丙二醛的含量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；投喂后第20、30天時(shí)，功能性飼料組蝦的丙二醛含量均顯著低于對(duì)照組（＜0.05）。

圖6 功能性飼料添加劑對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影響

3 討論

已有研究結(jié)果表明，功能性飼料添加劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)、提高免疫力、抗氧化和抗應(yīng)激的能力。

血清LZM在甲殼動(dòng)物機(jī)體內(nèi)能破壞革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖層，從而使機(jī)體抵御病原微生物的入侵。ALP和ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在甲殼動(dòng)物免疫體系中是衡量機(jī)體免疫機(jī)能和健康狀況的重要標(biāo)志。在該試驗(yàn)中，功能性飼料組克氏原螯蝦血清LZM的活性在投喂后第30、40天，ALP和ACP的活性在投喂后10、20 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，表明在基礎(chǔ)商品料中添加功能性飼料添加劑能提高蝦體LZM、ALP和ACP的活性，從而提高機(jī)體的免疫力。陳孝煊等用分別含1%的大黃、穿心蓮、板藍(lán)根和金銀花水提取物的餌料連續(xù)28 d飼喂異育銀鯽，結(jié)果顯示，投喂后第4、7天時(shí)，血清溶菌酶的活性顯著高于對(duì)照組；符云等報(bào)道，在飼料中添加一定量的復(fù)方中草藥制劑（主要成分為黃芪、金銀花、杜仲等），可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中的LZM、NOS、ALP和SOD等活性；崔青曼等在報(bào)道中指出，復(fù)方飼料添加劑（主要成分為海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等）能顯著提高河蟹機(jī)體的免疫功能，與該研究結(jié)果一致。

正常狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)本身具有清除氧自由基的能力，抗氧化酶主要包括SOD、CAT和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的反應(yīng)產(chǎn)物，其在機(jī)體中的積累程度可以反映機(jī)體過(guò)氧化受損狀況。有研究表明，復(fù)方中草藥（大黃、黃芪、連翹、黃芩和丹皮）、穿心蓮、?；撬崮芴岣甙c(diǎn)鮭、半滑舌鰨、虹鱒等水產(chǎn)動(dòng)物的肝臟抗氧化能力。在該試驗(yàn)中，功能性飼料添加劑的添加雖未顯著影響蝦肝胰腺SOD和CAT的活性，但蝦的肝胰腺M(fèi)DA含量在投喂后第20、30天時(shí)顯著降低。表明中草藥和?；撬釓?fù)方添加劑在一定程度上提高了克氏原螯蝦的抗氧化功能。這是因?yàn)?，穿心蓮、大黃等中草藥的有效成分——穿心蓮內(nèi)酯、大黃素等，可以抑制自由基生成，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低自由基毒性，起到抗氧化的作用；?；撬峥赡苁且?yàn)槠渚哂蟹€(wěn)定細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的能力，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。