亞麻油與棕櫚油配比對絨山羊體外瘤胃微生物數(shù)量和脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響

■姜聯(lián)廣 張 娟 郭曉宇 趙艷麗 郭詠梅 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物 營養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙 古呼和浩特 010018）

隨著生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對牛羊肉的營養(yǎng)價(jià)值關(guān)注越來越多，特別是對富含功能性營養(yǎng)成分的牛羊肉更是青睞有加。山羊肉相比于綿羊肉、牛肉所含的多不飽和脂肪酸(PUFA)更多[1]。近些年來，由于天然草場的資源限制，舍飼育肥成為了羊肉生產(chǎn)的主要方式。但舍飼時(shí)，絨山羊的n-3PUFA含量低于天然放牧，因此，研究者致力于通過營養(yǎng)途徑調(diào)節(jié)舍飼羊肉的n-3PUFA組成。

反芻動(dòng)物日糧中添加亞麻油或棕櫚油都可以對肌肉組織的脂肪酸（FA）組成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)在荷斯坦奶牛日糧中添加6.5%亞麻籽可顯著增加牛奶脂肪中的n-3PUFA[3]，但其易抑制瘤胃發(fā)酵，且會(huì)加重氧化應(yīng)激[4]，進(jìn)而負(fù)面影響動(dòng)物的生理功能。有人利用羊瘤胃液進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵的研究得出棕櫚油可以在不影響瘤胃發(fā)酵前提下提高PUFA含量[5]。但是，棕櫚油不同添加劑量對體內(nèi)FA組成的影響鮮有報(bào)道[6]。亞麻油與棕櫚油進(jìn)行混合添加相比于單獨(dú)添加對反芻動(dòng)物體內(nèi)FA組成的優(yōu)化結(jié)果不盡一致。有報(bào)道指出，奶牛日糧中添加單一亞麻油，其牛奶的PUFA 組成與品質(zhì)優(yōu)于棕櫚油和亞麻油以1∶1 比例的混合添加組[7]。課題組前期的研究結(jié)果指出，亞麻油與棕櫚油混合添加可以調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)酶的活性和瘤胃微生物的組成，其機(jī)制與棕櫚油替代部分亞麻油后降低了瘤胃內(nèi)亞麻油酸的氫化作用，增加了其過瘤胃效果有關(guān)[8]。提示亞麻油與棕櫚油的混合添加改變了瘤胃中與脂類代謝有關(guān)的微生物和酶活性，但相關(guān)的研究報(bào)道甚少。鑒于此，本試驗(yàn)利用體外方法研究日糧中添加不同配比的亞麻油與棕櫚油對絨山羊脂類代謝相關(guān)酶活性、微生物數(shù)量及營養(yǎng)物質(zhì)降解的影響，研究結(jié)果對在舍飼條件下改善絨山羊體組織中n-3PUFA 的比例具有重要的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康、體況相近、體重為（44.72±3.54）kg 的阿爾巴斯白絨山羊作為瘤胃液供體羊。供體羊每日8：00和15：00兩次飼喂，自由飲水。采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。共設(shè)7個(gè)處理組，一組為對照組(CON)，不添加任何油脂，一組為亞麻油組（LSO），只添加亞麻油，其余5組為混合油脂組，分別在底物日糧中添加按照設(shè)計(jì)要求確定的不同重量比例配合的亞麻油與棕櫚油，亞麻油與棕櫚油配比分別為9∶1（LP1）、8∶2（LP2）、7∶3（LP3）、6∶4（LP4）和5∶5（LP5）。除對照組外，各處理組油脂的添加總量均為2%。底物日糧精粗比為5∶5，其組成詳見表1。體外培養(yǎng)體系60 mL（瘤胃液與緩沖液配比為1∶2），在體外培養(yǎng)24 h后采集樣品。

表1 底物日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 脂肪代謝酶活性

先采集瘤胃液，配置緩沖液[9-10]。稱取底物1 g，進(jìn)行體外培養(yǎng)操作[9]，后終止發(fā)酵，過濾轉(zhuǎn)移，-20 ℃保存待測酶活性相關(guān)指標(biāo)，即用酶聯(lián)免疫法[11]（ELISE）測定脂肪代謝相關(guān)酶活性，包括脂肪從頭合成酶（FAS）、乙酰輔酶羧化酶（ACC）、超長鏈脂肪酸延長酶（ELOVL5）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）；脂肪水解相關(guān)酶，如激素敏感脂酶（HSL）、脂蛋白脂酶（LPL）；脂肪酸去飽和相關(guān)酶，如硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、脂肪酸脫氫酶（FADS1）、丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）。

1.2.2 瘤胃微生物數(shù)量

稱取底物1 g，體外培養(yǎng)操作，后終止發(fā)酵，過濾轉(zhuǎn)移，-80 ℃保存待進(jìn)行瘤胃微生物DNA提取。本試驗(yàn)測定的體外培養(yǎng)液中的微生物主要包括：細(xì)菌總數(shù)（Total bacteria）、蛋白糖分解丁酸弧菌（B. proteoclasticum）、亨氏丁酸弧菌（B. hungatei）、白色瘤胃球菌（R.albus）和脂解厭氧弧桿菌（Anaerovibrio lipolytica）等。在瘤胃液微生物總DNA 提取后，采用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR法[12]測定，其中引物設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 PCR擴(kuò)增引物

1.2.3 營養(yǎng)物質(zhì)降解率

體外培養(yǎng)后，測定干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、Ca 及P 的降解率，其中DM、Ca、P 含量測定參考張麗英主編的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[15]。CP、EE含量分別使用半自動(dòng)凱式定氮儀及海能脂肪測定儀進(jìn)行測定[16]；NDF、ADF含量參考韓璐璐[17]試驗(yàn)操作方法測定。

養(yǎng)分降解率（%）=（放入尼龍袋中飼料某養(yǎng)分含量-消化后尼龍袋所剩某養(yǎng)分含量）/放入尼龍袋中飼料某養(yǎng)分含量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS8.2 軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan’s進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外瘤胃培養(yǎng)液中的脂肪代謝相關(guān)酶活性（見表3）

表3 亞麻油與棕櫚油不同配比對絨山羊體外瘤胃培養(yǎng)液中脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響

如表3 所示，各處理組間FAS 活性和PDK4 活性均無顯著差異（P=0.836、P=0.279）；LSO、LP4、LP5 組的ACC 活性顯著高于CON 組及其他混合油組（P=0.001），LP2 組則較CON 組顯著降低（P=0.001）；與CON 組相比，各添加油脂組G6PDH 活性均顯著降低（P=0.002），且隨亞麻油比例降低而降低，尤以LP4組最低；LSO、LP1 組MDH 活性顯著高于CON 組（P=0.004），其他各組與CON 組差異并不顯著；與CON 組相比，各添加油脂組HSL、ELOVL5、LPL 活性均顯著升高（P=0.009、P=0.022、P=0.021），但各油脂組間無顯著差異；除LP2 組外其他組FADS1 活性較CON 組顯著升高（P=0.010）；LSO組的SCD活性顯著高于CON組及除LP4 組以外其他各油脂組（P=0.002），LP1、LP2、LP3、LP4組隨著棕櫚油比例升高呈逐漸升高趨勢。

2.2 體外模擬瘤胃培養(yǎng)液中微生物數(shù)量（見表4）

如表4所示，各組間Total bacteria數(shù)量無顯著差異（P=0.409）。與CON組相比，各添加油脂組B.hungatei數(shù)量顯著降低（P=0.006），LSO、LP1、LP2、LP3、LP4 組B.proteoclasticum數(shù)量較CON 組顯著降低（P=0.042），其中LP4 組低，顯著低于LSO 組和LP5組（P=0.042）。然而，各添加油脂組R. albus、Anaerovibrio lipolytica數(shù)量與CON 組相比均顯著升高（P=0.041、P=0.004），但各添加油脂組間并無顯著差異。

表4 亞麻油與棕櫚油不同配比對絨山羊體外瘤胃培養(yǎng)液中微生物數(shù)量的影響（16S rDNA拷貝數(shù)以10為底的對數(shù))

2.3 體外瘤胃培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)降解率（見表5）

表5 亞麻油與棕櫚油不同配比對絨山羊體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響（%）

由表5可知，各處理組DM、EE、CP、ADF、Ca、P的體外瘤胃降解率均差異不顯著（P＞0.05）。相比于CON 組，LSO、LP1、LP2、LP3 組各添加油脂組NDF 降解率顯著降低（P=0.040）。LP4 組在各油脂添加組中指標(biāo)在數(shù)值上最高，但相比于LSO、LP1、LP2、LP3、LP5組并無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

前人研究表明，棕櫚油部分替代亞麻油后可以通過提高脂肪代謝相關(guān)酶活性及瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量來改善體內(nèi)FA的組成結(jié)構(gòu)，但究竟替代多大比例更好，尚未見資料報(bào)道。HSL 和LPL 均為脂肪水解過程中的限速酶，SCD、ACC是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，ELOVL5、FADS1 則對脂肪酸的去飽和與延長作用有重要作用[18]。在本試驗(yàn)中，LP4 組的上述酶活性均與亞麻油組相似，且兩組均高于CON 組。課題組前期研究也得出了相似的結(jié)果。Wang 等[8]在絨山羊日糧中混合添加亞麻籽油與棕櫚油（2∶1）時(shí)，發(fā)現(xiàn)其肌肉組織的FADS1 mRNA 表達(dá)會(huì)上調(diào)；在絨山羊日糧中添加熱亞麻籽可提高ELOVL5活性[19]。Olaia等[20]發(fā)現(xiàn)肉羊日糧添加亞麻油可增加其皮下脂肪組織LPL 的mRNA 表達(dá)量；Choi 等[21]研究發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物日糧中添加亞麻籽油可刺激其皮下脂肪SCD基因的表達(dá)，與本研究結(jié)果相似。這表明亞麻油與棕櫚油的混合添加比例為6∶4，即棕櫚油部分替代亞麻油時(shí)對瘤胃內(nèi)的脂肪降解、脂肪酸的合成、去飽和與延長作用可與單一添加亞麻油具有相同的促進(jìn)效果，提示增加了亞麻油中C18∶3n-3 等n-3 PUFA 的過瘤胃效果，這也部分解釋了課題組前期得出是棕櫚油與亞麻油混合添加可以保護(hù)亞麻油中的C18∶3n-3免受瘤胃的降解[8]，增加過瘤胃效果。Adeyemi 等[22]發(fā)現(xiàn)亞麻油與富含C18∶1n-9c 的棕櫚油混合添加可以降低C18∶3n-3在瘤胃內(nèi)的氫化，使其轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸（SFA）更少，本試驗(yàn)的酶活性變化可部分解釋其原因。

G6PDH、MDH 與體內(nèi)脂質(zhì)合成過程的能量提供有關(guān)。本研究得出，LP4 組的G6PDH 活性顯著低于CON 組；LSO 組的MDH 活性高于CON 組,且與LP4 組差異不顯著，提示日糧中亞麻油與棕櫚油以6∶4 混合添加可能導(dǎo)致瘤胃中FA從頭合成減少。

Anaerovibrio lipolytica、R.albus、B.proteoclasticum、B.hungatei與脂肪酸在瘤胃中的氫化作用有關(guān)。姜雅慧等[23]發(fā)現(xiàn)B.proteoclasticum在反式C18∶1 轉(zhuǎn)變?yōu)镃18∶0 過程起主導(dǎo)作用。本試驗(yàn)中，各油脂添加組的體外瘤胃液Anaerovibrio lipolytica、R.albus的數(shù)量均顯著高于CON組，B.proteoclasticum、B.hungatei的數(shù)量呈現(xiàn)相反之規(guī)律。這說明棕櫚油代替亞麻油對瘤胃內(nèi)脂肪酸的氫化作用效果與單一添加亞麻油相似。

在瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)降解率方面，各處理組的DM、EE、CP、ADF、Ca及P降解率均無顯著差異，說明日糧中油脂的加入并未負(fù)面影響營養(yǎng)物質(zhì)的降解；但油脂的添加不同程度降低了NDF降解率，與CON組相比，LSO、LP1、LP2 與LP3 混合油組顯著降低，但LP4 與LP5組的降低不顯著，說明LP4組、LP5組可減弱亞麻油添加對NDF降解引起的抑制作用。

綜上所述，當(dāng)亞麻油與棕櫚油的混合配比為6∶4時(shí)，可以提高絨山羊體外瘤胃培養(yǎng)液中脂肪水解與脂肪酸從頭合成相關(guān)酶活性，促進(jìn)了脂肪酸的去飽和與延長作用；LP4 組可減少亞麻油中C18∶3n-3 等n-3 PUFA在瘤胃中的氫化，增加其過瘤胃效果，減弱亞麻油添加對NDF降解引起的抑制作用。然而，目前在該領(lǐng)域的研究甚少，確切的機(jī)理還有待于進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

亞麻油與棕櫚油以6∶4 混合添加，可增加體外瘤胃培養(yǎng)液中脂類水解、脂肪酸的從頭合成、去飽和與延長有關(guān)的酶活性，改變脂肪酸代謝相關(guān)微生物含量，減弱亞麻油添加對NDF降解引起的抑制作用。