荷斯坦奶牛瘤胃部分微生物的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

■任雨龍 王秋菊 孫 愉 張 昊 魏 笑 高炳南 李暢洋

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍 江大慶 163319）

近些年，為了減少抗生素在養(yǎng)殖行業(yè)中的大量濫用，人們開(kāi)始研制各種微生物制劑來(lái)代替抗生素的使用[1]。微生物制劑在很多領(lǐng)域內(nèi)都發(fā)揮著重要的作用，尤其是食品、飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，有著較為廣闊的發(fā)展前景[2-3]。瘤胃微生物與微生物制劑的研究也成為了人們較為感興趣的內(nèi)容，希望通過(guò)在飼料中添加某些微生物，直接或間接地改善反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，降低疾病發(fā)生概率，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)代謝的正常進(jìn)行[4-5]。但目前用于反芻動(dòng)物微生物制劑的菌種較為單一，而瘤胃又是反芻動(dòng)物體內(nèi)最復(fù)雜的消化系統(tǒng)之一，存在著大量的微生物。比如原蟲(chóng)、細(xì)菌、真菌等，也是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化分解的主要部位[6]。因此，如何從反芻動(dòng)物瘤胃中發(fā)現(xiàn)更多能夠用于研制微生物制劑的菌類(lèi)，開(kāi)發(fā)出效果更好的單菌或者復(fù)合微生物制劑，從而促進(jìn)瘤胃生理功能的充分發(fā)揮，提高動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)利用效率，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，達(dá)到提高奶牛養(yǎng)殖行業(yè)生產(chǎn)收入的目的，是目前研究的主要內(nèi)容。

本研究旨在通過(guò)16S rDNA序列同源性比較以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析等方法對(duì)分離的菌株進(jìn)行種屬鑒定，從荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)分離出可以用于微生物制劑研制的菌類(lèi)和引起常見(jiàn)疾病的病原菌，并確定其生化特性，從而為微生物制劑的研發(fā)提供備選菌種信息以及為有害病原菌的防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從黑龍江省九三某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)選取10頭荷斯坦奶牛，于早晨6：30～7：30利用負(fù)壓裝置采集瘤胃內(nèi)容物，瘤胃內(nèi)容物裝瓶后，用封口膜纏繞瓶口，置于保溫泡沫箱中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采樣奶牛具體信息如表1所示。

表1 采樣奶牛信息

本試驗(yàn)采樣的養(yǎng)殖場(chǎng)根據(jù)產(chǎn)奶量以及泌乳天數(shù)進(jìn)行分群飼養(yǎng)，采用全混合日糧（TMR）飼喂技術(shù)，青貯飼料、干草和精料等均衡供應(yīng)，自由飲水。每天分別在06：00、14：00 和21：00 進(jìn)行擠奶，發(fā)料車(chē)于每次擠奶30 min 后進(jìn)行撒料。飼糧組成以及營(yíng)養(yǎng)水平如表2所示。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.1.2 引物合成與測(cè)序

在本試驗(yàn)中，提取完DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，添加細(xì)菌通用引物，由上海生物工程股份有限公司完成通用引物的合成以及測(cè)序內(nèi)容。所用的引物序列為：

F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[7]。

1.1.3 培養(yǎng)基以及試劑（見(jiàn)表3）

表3 試驗(yàn)所用試劑

1.1.4 主要儀器（見(jiàn)表4）

表4 試驗(yàn)儀器設(shè)備

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

將各培養(yǎng)基按照說(shuō)明書(shū)配比稱(chēng)取好后置于250 mL無(wú)菌錐形瓶中，放于水浴鍋中加熱，玻璃棒攪拌溶解5～10 min。然后用牛皮紙將錐形瓶包好，再置于高壓滅菌鍋中，121 ℃，15 min，進(jìn)行滅菌操作。滅菌完成后，待培養(yǎng)基溫度冷卻到手可以拿起時(shí)（50 ℃左右），進(jìn)行倒板，培養(yǎng)基厚度大約為玻璃平皿高度的1/3。倒板結(jié)束后，待所有培養(yǎng)基冷卻凝固，纏上封口膜，置于超凈臺(tái)中進(jìn)行紫外線(xiàn)滅菌。

1.2.2 樣品處理

事先將滅過(guò)菌的1 000 mL藍(lán)蓋瓶充滿(mǎn)CO2置于水浴鍋中37 ℃保溫，準(zhǔn)備一個(gè)泡沫箱，在泡沫箱中放一些保溫袋，然后將藍(lán)蓋瓶放于泡沫箱中，等待采取瘤胃內(nèi)容物。瘤胃內(nèi)容物采集完成之后，使用無(wú)菌醫(yī)用紗布過(guò)濾掉飼料殘?jiān)?，濾液置于新的藍(lán)蓋瓶中，進(jìn)行離心。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

在超凈臺(tái)中，用生理鹽水將離心好的瘤胃上清液稀釋至不同的濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9），然后取10-6、10-7、10-8、10-9四個(gè)濃度進(jìn)行涂布，每個(gè)濃度分別做兩組，一組置于厭氧培養(yǎng)箱，另外一組置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)。接菌時(shí)每個(gè)培養(yǎng)平皿中接種100 μL 稀釋菌液，用涂布棒將菌液均勻涂布在平皿中，做好標(biāo)記。

在涂布完成后，每隔12 h將平皿里生長(zhǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行挑菌操作，將挑出的菌落用劃線(xiàn)的方法接到新培養(yǎng)基平皿中，重復(fù)此步驟4～5次。若培養(yǎng)基平皿中的菌落完全相同，沒(méi)有雜菌生長(zhǎng)，則說(shuō)明純化培養(yǎng)完成，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 菌的保存

純化完成的菌一部分接種到液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用移液槍抽取配置好的30%甘油以1∶1的比例，混合于EP管中，混勻后再置于-80 ℃冰箱中凍存，即完成保菌工作。

1.2.5 菌的鑒定

DNA 的提取通過(guò)物理提取法或者試劑盒提取均可達(dá)到試驗(yàn)要求，在本試驗(yàn)中，利用試劑盒（TIAN GEN）完成菌DNA 提取，再繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表5。

表5 PCR反應(yīng)體系

在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、3 min，95 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃延伸30 s，整個(gè)PCR反應(yīng)包括30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

在PCR 程序結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，由于本試驗(yàn)中預(yù)計(jì)基因片段大小在1 500 bp左右，因此瓊脂糖濃度選擇1%即可滿(mǎn)足試驗(yàn)需要。在凝膠樣空中加入6 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)使用DL 2000 Marker作為電泳參照。

電泳完成后，將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送到委托公司測(cè)序。

1.2.6 生化特性鑒定

本試驗(yàn)所有細(xì)菌生化特性的鑒定方法主要參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)試驗(yàn)指導(dǎo)》進(jìn)行。

①纖維素酶活性的鑒定[8]

培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O、NaCl 0.5 g、（NH4）2SO41 g、瓊脂15 g、純化水1 000 mL。調(diào)pH至7.21，121 ℃滅菌20 min。

試劑：FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl20.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、100 mL純化水。

評(píng)定方法：將接過(guò)菌的平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h 后，用移液槍吸取2 mL 的剛果紅溶液（1 mg/mL）添加到培養(yǎng)基中，靜置15 min 后倒去液體，添加2 mL的NaCl溶液（1 mol/mL），靜置15 min后倒去液體，觀察是否有透明圈產(chǎn)生，透明圈的大小跟菌降解纖維素的能力有關(guān)。

②產(chǎn)蛋白酶活性的鑒定[9]

培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O 1.07 g、K2HPO40.36 g、酪蛋白4 g、ZnCl20.014 g、NaCl 1.2 g、CaCl20.002 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.02 g、瓊脂20 g、純化水1 000 mL。

試劑：氯化汞15 g，濃鹽酸20 mL，純化水100 mL。

評(píng)定方法：將菌接種到培養(yǎng)基之后，37 ℃培養(yǎng)24-48 h，滴加顯色試劑，觀察菌落周?chē)欠裼型该鲄^(qū)域產(chǎn)生。

③產(chǎn)淀粉酶活性的鑒定[9]

培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、純化水1 000 mL。

試劑：碘液。

評(píng)定方法：將菌接種于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后在菌落處滴加碘液，碘液范圍要覆蓋菌落，觀察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈出現(xiàn)，透明圈的大小與菌產(chǎn)生淀粉酶的能力有關(guān)。

④硝酸鹽還原試驗(yàn)[10]

培養(yǎng)基：琥珀酸鈉10 g、NaNO31 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.2 g、蒸餾水1 000 mL，配制完成后通CO22～3 min。

試劑：Griess試劑。

評(píng)定方法：將各個(gè)菌接入到培養(yǎng)基中，接完菌后37 ℃培養(yǎng)24 h。用移液槍或無(wú)菌注射器抽取菌液，取適量置于平皿中，平皿置于白紙上（使顯色更加明顯）。抽取配好的Griess 試劑，每個(gè)平皿中1 滴即可，30 s 后發(fā)生變色（即產(chǎn)生紅色或者粉色，說(shuō)明該菌具有還原性，若不變色，則不具有還原性）

⑤甲基紅（Methyl red）試驗(yàn)[10]

培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、KH2PO40.5 g、1 000 mL 純化水、加熱溶解，調(diào)pH 至7.2，6.895×10-2MPa，滅菌15 min，分裝各個(gè)試管，具體配制視試驗(yàn)所需，按比例縮小。

試劑：甲基紅0.02 g、95%乙醇溶液60 mL、純化水40 mL，將甲基紅碾碎放于乙醇溶液中，再添加純化水。

評(píng)定方法：將菌接入試管中，35 ℃，48 h，取出部分培養(yǎng)液滴加甲基紅指示劑，觀察顏色變化。若為紅色（即不變色），則呈陽(yáng)性，若為黃色（即變色），則呈陰性。

⑥產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)

培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。

評(píng)定方法：本培養(yǎng)基可倒平板也可倒斜面（本研究發(fā)現(xiàn)倒斜面效果會(huì)更加明顯），將菌穿刺接入培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?，呈?yáng)性，無(wú)變化呈陰性。

⑦靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）[11]

培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、1 000 mL 純化水，調(diào)pH 至7.6，6.895×10-2MPa 滅菌15 min，分裝各個(gè)試管。

試劑：對(duì)二甲基氨基苯甲醛5 g、95%乙醇溶液150 mL、濃鹽酸50 mL。

評(píng)定方法：將菌分別接種到各個(gè)試管中，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，取出部分培養(yǎng)液滴加顯色試劑，觀察顏色變化。若為紅色（即變色），則呈陽(yáng)性，若為黃色（即不變色），則呈陰性。

⑧尿素酶試驗(yàn)[11]

培養(yǎng)基：將葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、KH2PO42 g、NaCl 5 g 混合于1 000 mL 純化水中，加熱溶解，調(diào)pH 至7.2，再加瓊脂20 g、0.4 %酚紅溶液2 mL，混勻過(guò)濾。高壓滅菌20 min，待溫度冷至60 ℃左右時(shí)，加入用濾菌器過(guò)濾的50 %尿素水1 mL，混勻后倒平板或者斜面。

評(píng)定方法：將菌接種入平板后，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基呈紅色為陽(yáng)性，不變色為陰性。

⑨接觸酶試驗(yàn)[12]

試劑：3%H2O2溶液。

評(píng)定方法：將菌液滴數(shù)滴置于高壓滅菌的試管或者玻片上，再滴加3%的H2O2。若產(chǎn)生大量氣泡則為陽(yáng)性，沒(méi)有氣泡產(chǎn)生則為陰性。直接將3%H2O2溶液滴加到不含血液成分的菌培養(yǎng)液中，也能觀察到上述現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖1）

圖1 部分細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)目的基因片段大小為1 500 bp左右，與預(yù)測(cè)基因片段大小相符。結(jié)果如圖1所示。

2.2 基因測(cè)序（見(jiàn)表6、圖2）

表6 16S rRNA系列比對(duì)結(jié)果

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司完成測(cè)序工作，再把測(cè)序結(jié)果在NCBI 的GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)獲得菌種的同源性在99%以上，比對(duì)結(jié)果如表6所示。

本研究從奶牛瘤胃內(nèi)容物中共分離得到32株細(xì)菌，12 種菌。主要包括：枯草芽孢桿菌CC2FG2、地衣芽孢桿菌LR2HG4、芽孢球菌PA3、馬鏈球菌LU1542、不動(dòng)桿菌Ue2-1、弗氏檸檬酸桿菌K32、假單胞菌705B5、溶血性葡萄球菌PH4-1、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌LP1547、吉氏庫(kù)特菌LA3、腸球菌DSM7374、雙歧桿菌N145。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖2）

圖2 部分細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用Mega7.0 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步證明了試驗(yàn)所篩選出來(lái)的菌與GenBank 比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同源性均達(dá)到97%以上。

2.4 生化特性鑒定結(jié)果（見(jiàn)表7）

本研究主要對(duì)分離得到的菌進(jìn)行了革蘭氏陰陽(yáng)性、硝酸還原、靛基質(zhì)（吲哚）、產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接觸酶以及發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)硫化氫等特性進(jìn)行了鑒定。生化特性鑒定的結(jié)果如下表7所示。

表7 不同菌種的生化特性鑒定

3 討論

本研究中所用的培養(yǎng)基從功能上來(lái)劃分，主要分為兩種：富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基。但是有些分離培養(yǎng)基中得到的菌和目標(biāo)菌并不相同，一部分原因可能是培養(yǎng)基的特異性不強(qiáng)，還有一部分原因可能是由于菌培養(yǎng)的環(huán)境不統(tǒng)一，比如濕度、氧氣含量等，都可能會(huì)影響菌的生長(zhǎng)以及傳代過(guò)程[13]。此外，接菌、挑菌等操作的正確性也對(duì)試驗(yàn)有很大的影響，任何錯(cuò)誤或者不當(dāng)?shù)牟僮鞫伎赡軙?huì)造成菌的污染或者目標(biāo)細(xì)菌的死亡[14]。

鄧慧媛[15]從奶牛瘤胃中分離出了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，本試驗(yàn)和其相比的話(huà)，培養(yǎng)出了弗氏檸檬酸桿菌、吉氏庫(kù)特菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、雙歧桿菌等菌種。這種情況主要是由于培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)環(huán)境的不同造成的。而近年來(lái)關(guān)于牛源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌以及吉氏庫(kù)特菌的研究較少，對(duì)其一些生物學(xué)特性并不清楚。本試驗(yàn)填充了這部分信息的空白。

此外，瘤胃微生物的分離可以根據(jù)試驗(yàn)所需制備不同成分的培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)環(huán)境，從而篩選出想要獲得的目標(biāo)菌種。傅帥[16]通過(guò)減少培養(yǎng)基中蛋氨酸的含量，改進(jìn)發(fā)酵條件，從瘤胃內(nèi)容物中篩選出一株能夠合成蛋氨酸的熱帶假絲酵母菌。王平[17]利用纖維素剛果紅培養(yǎng)基和固體發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，從牛瘤胃內(nèi)容物中分離出具有較強(qiáng)纖維素分解能力的纖維素酶高產(chǎn)菌株。在這些分離菌的試驗(yàn)中，影響分離菌株種類(lèi)的一個(gè)重要因素是培養(yǎng)環(huán)境氧氣含量。因?yàn)榱鑫钢写蠖鄶?shù)的微生物都嚴(yán)格厭氧，如果在常規(guī)的恒溫箱中培養(yǎng)，最后得到的是好氧菌或者兼性厭氧一類(lèi)的菌種，而厭氧菌在這種環(huán)境中生長(zhǎng)較為困難，這也是本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)厭氧、好氧兩種培養(yǎng)環(huán)境的原因。

有關(guān)分離動(dòng)物微生物的研究較多，但研究對(duì)象大部分都集中在單胃動(dòng)物上[18]，在反芻動(dòng)物上主要關(guān)注于微生物多樣性的分析，這可能與反芻動(dòng)物獨(dú)特的消化方式有關(guān)[19]。有研究認(rèn)為由于瘤胃中存在大量微生物的原因，飼料中添加的單一菌種微生物制劑在較短時(shí)間會(huì)被反芻動(dòng)物通過(guò)代謝作用排出體外[20]。在犢牛飼料中添加微生物制劑，會(huì)改變犢牛瘤胃微生物區(qū)系，影響優(yōu)勢(shì)菌的定植[21]。而在成年奶牛添加微生物制劑，在短時(shí)期內(nèi)也會(huì)起到改善瘤胃內(nèi)環(huán)境、增加奶牛的產(chǎn)奶量和增強(qiáng)免疫力等作用[22-25]。目前運(yùn)用于反芻動(dòng)物的微生物制劑較少，菌種較為單一，多種復(fù)合菌制劑的開(kāi)發(fā)將是接下來(lái)研究的熱點(diǎn)。因此，從瘤胃中分離更多微生物，可以為微生物制劑提供更多的菌種參考，幫助開(kāi)發(fā)更多種類(lèi)的反芻動(dòng)物微生物制劑。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)從荷斯坦奶牛瘤胃中共分離出32 株菌，其中益生菌有12 株，致病菌有20 株，益生菌占比相對(duì)較少。

②推測(cè)本次采樣奶牛場(chǎng)中環(huán)境或者飼料存在一定的問(wèn)題，對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能存在一定的影響。

③在本試驗(yàn)中，益生菌的鑒定以及生化特性的檢測(cè)作為后備菌種為微生物制劑的研究開(kāi)發(fā)提供幫助。