表面活性素體外抗菌效果研究

趙 賓，白 靜

（1.北京英惠爾生物技術(shù)有限公司，北京 100081；2.北京師范大學(xué)靜海附屬學(xué)校，天津 301636）

表面活性素（Surfactin）是芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑合成的小分子脂蛋白。它由4 個亮氨酸、1個纈氨酸、1個谷氨酸和1個天冬氨酸共7個氨基酸殘基的多肽環(huán)通過酯鍵與含有12~17個碳原子β-羥基脂肪酸結(jié)合形成內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩性化合物[1]。它是一種極具應(yīng)用前景的微生物表面活性劑，只需較少劑量就可以使溶液體系界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化[2]。正是由于其極強(qiáng)的表面活性能力賦予了它抗菌殺菌活性，其抗菌作用方式與抗生素不同，不具有特異性，不易引起病原菌的耐藥性突變，隨著細(xì)菌耐藥性的問題越來越嚴(yán)重，人們渴望找到新型的抗菌殺菌產(chǎn)品，表面活性素就是抗生素的理想替代品之一[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)“禁抗令”的頒布，表面活性素越來越被行業(yè)所關(guān)注。

許多研究表明，表面活性素具有抗細(xì)菌、真菌、腫瘤和病毒的作用，抗菌譜較廣[4]，但是其對動物源致病菌的抑制效果報道少見。據(jù)此，筆者研究了表面活性素體外抗動物源性致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與沙門氏菌的作用效果，并且與部分抗生素在抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的能力方面進(jìn)行了對比，旨在為表面活性素作為飼料添加劑在養(yǎng)殖行業(yè)中替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 主要試劑及儀器

表面活性素（Surfactin），購自海麥克林生化科技有限公司；桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽，購自綠康生化股份有限公司；LB與RCM 培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；紫外分光光度計（型號為UV5），購自梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號為HT-600B），購自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.2 菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027、金黃色葡萄球菌ATCC6538P、大腸桿菌CVCC233、沙門氏菌SK236，均來自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

2 方 法

2.1 指示菌的活化及培養(yǎng)

從甘油管中吸取產(chǎn)氣莢膜梭菌200 μL，分別轉(zhuǎn)接至含有5 mL 的無菌RCM 液體培養(yǎng)基的試管中，各吸取1 mL 無菌液體石蠟加入接種完畢的試管中，置于培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液以2%的接種量接入新的裝有50 mL 無菌RCM 液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，各吸取5 mL 無菌液體石蠟加入接種完畢的試管中，置于培養(yǎng)箱，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌濃度為5×108cfu·mL-1，獲得試驗用指示菌懸液，置4 ℃冰箱中貯存，備用。

分別從甘油管中吸取大腸桿菌CVCC233、金黃色葡萄球菌ATCC6538P 和沙門氏菌SK236 各200 μL，轉(zhuǎn)接至含有5 mL無菌LB液體培養(yǎng)基的試管中，置于搖床培養(yǎng)中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)后的菌液以2%的接種量接入新的裝有50 mL 無菌LB 液體培養(yǎng)基的搖瓶中，置于恒溫?fù)u床中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)18 h。調(diào)整菌濃度為1.5×108cfu·mL-1，獲得試驗用指示菌懸液，置4 ℃冰箱中貯存，備用。

2.2 指示菌培養(yǎng)平板的制備

分別將指示菌懸液以2%的比例接種至無菌的固體培養(yǎng)基中（50 ℃），混勻后趁熱倒入無菌培養(yǎng)皿中冷卻，制得指示菌培養(yǎng)平板。

2.3 表面活性素對不同致病菌的抑菌效果

在無菌條件下將牛津杯置于制備好的指示菌平皿內(nèi)，于牛津杯內(nèi)加入10 μg·mL-1表面活性素100 μL（每樣品做3 個平皿），將其放入4 ℃冰箱過夜[5]。待藥液充分?jǐn)U散后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌指示菌平皿厭氧培養(yǎng)，其他致病菌有氧培養(yǎng)。取出后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，進(jìn)行3次平行試驗，最終求3次試驗的平均值。

2.4 表面活性素與抗生素對產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度（MIC）測定

取無菌試管11支，排成一排，第1支加入4.6 mL的RCM培養(yǎng)基，其余各管均加入1 mL的RCM，在第1 管中加入1 000 μg·mL-1測試樣品0.4 mL，混勻，然后再吸取1 mL 于第2 管中，混勻再吸取1 mL 至第3 管中，如此倍比稀釋至第9 管，從第9 管中吸取1 mL 棄去，第10 管為不含測試樣品的對照管，第11管為只加RCM的陰性對照[6-7]。觀察結(jié)果并記錄，與對照組對比后確定MIC。

3 結(jié)果與分析

3.1 表面活性素對不同致病菌的抑菌效果

測定表面活性素對不同致病菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見表1。

表1 7種致病菌的抑菌圈直徑平均值（R） mm

由表1可以看出，表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 病原性的產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑均超過了15 mm，說明表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌為極敏感，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為8.78 mm，對大腸桿菌和沙門氏菌沒有產(chǎn)生抑菌圈，說明表面活性素對大腸桿菌CVCC233和沙門氏菌SK236 的抑制作用不明顯或者沒有抑制作用。

3.2 最小抑菌濃度的測定

測定表面活性素、桿菌肽、亞甲基水楊酸桿菌肽對4種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC，結(jié)果見表2。

表2 表面活性素與2種抗生素對4種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC μg·mL-1

由表2可知，表面活性素、桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽對4 種產(chǎn)氣莢膜梭菌均具有良好的抑菌效果，但MIC 尚有差別。表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124的MIC為10 μg·mL-1，對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 的MIC為20 μg·mL-1，對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030 的MIC為40 μg·mL-1；桿菌肽對4 種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC均為16 μg·mL-1；亞甲基水楊酸桿菌肽對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124 的MIC 為0.5 μg·mL-1，對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 的MIC為1 μg·mL-1，對產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030 的MIC為2 μg·mL-1。由以上結(jié)果可知，表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果與桿菌肽對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大體一致。

4 討 論

本研究表明，表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈，這與前人研究結(jié)果一致[8-9]。但表面活性素對大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性菌沒有產(chǎn)生抑菌圈，表明表面活性素對這兩種陰性致病菌抑制作用不明顯或者沒有抑制作用。Zhou Z.Y.等[10]研究結(jié)果顯示表面活性劑能抑制大腸桿菌，但對沙門氏菌沒有有效的抑制作用。Huang X.Q.等[11]的研究結(jié)果顯示表面活性素對沙門氏菌有較高的殺菌效果。這可能是因為表面活性素只對部分大腸桿菌和沙門氏菌有抑制作用，所以導(dǎo)致了本次試驗結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)存在差異，此結(jié)果為后續(xù)探究表面活性素的抑菌譜提供了參考。

產(chǎn)氣莢膜梭菌引起豬、牛、羊發(fā)病死亡率逐年升高，而且患畜死亡突然，易被懷疑為中毒死亡，在養(yǎng)殖業(yè)日益發(fā)達(dá)的今天，產(chǎn)氣莢膜梭菌是所有梭菌屬中引起腸道疾病最嚴(yán)重的病原[12-13]。桿菌肽作為多肽類抗菌藥物，對多數(shù)革蘭氏陽性菌有抑制作用，被廣泛應(yīng)用在飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域[14-15]。本研究表明桿菌肽類抗生素對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，表面活性素對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果與桿菌肽對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果相近。表面活性素作為脂肽類生物表面活性劑具有廣譜抗菌作用，表面活性素通過破壞細(xì)胞膜來發(fā)揮其抗菌作用[16]。表面活性素在合適濃度下，能夠在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成離子傳導(dǎo)孔[17-18]，與Ca2+發(fā)生結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞膜的滲透作用，破壞細(xì)胞膜發(fā)揮其抗菌作用。表面活性素還可以驅(qū)動其他單價和二價陽離子通過有機(jī)屏障，從而抑制環(huán)磷酸二酯酶的活性[19-20]，所以表面活性素對細(xì)菌的抑制作用沒有特異性，不易引起病原菌的耐藥性突變。由于表面活性素產(chǎn)量低，提純成本高，用表面活性素直接飼喂動物的應(yīng)用研究不多。多數(shù)研究還是利用芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵和固體發(fā)酵產(chǎn)生的多種脂肽代謝物去飼喂動物，并研究代謝物中表面活性素含量和飼喂效果的關(guān)系。比如，地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物改善了受球蟲攻毒后肉雞的日增重，增加了抗球蟲活力，調(diào)節(jié)了有益菌和有害菌的組成[21]?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵產(chǎn)物顯著改善了梭菌攻毒狀態(tài)下肉雞的腸道形態(tài)和腸炎壞死情況，發(fā)酵物中的表面活性素是抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的有效抗菌肽[22]。地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物顯著改善了梭菌攻毒狀態(tài)下肉雞的腸道形態(tài)和腸炎壞死情況，效果比商業(yè)抗生素還要好[21-23]。隨著“禁抗令”的實施，表面活性素作為抗生素的替代品在畜禽生產(chǎn)和飼料加工中具有廣泛的應(yīng)用前景[16]。

表面活性素不僅具有廣譜抗菌的優(yōu)點，而且在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率、提高胴體品質(zhì)等方面有積極作用[16]。斜帶石斑魚飼料中添加100 mg 的表面活性素能夠調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝酶的活性，降低血清中總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的濃度，增加高密度脂蛋白膽固醇的濃度，改善脂質(zhì)代謝，從而改善機(jī)體健康狀況[24]。同時，表面活性素能夠促進(jìn)生長，提高飼料系數(shù)，提高斜帶石斑魚消化道蛋白酶和脂肪酶活性，降低血清中尿素氮、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，提高白蛋白和溶菌酶水平[25]。陳旭波[26]研究表明，斷奶仔豬日糧中添加100~150 mg·kg-1的表面活性素可明顯改善腹瀉率，具有促生長作用，同時能降低血清中尿素的含量，具有一定降血脂作用。

5 結(jié) 論

表面活性素具有廣譜抗菌作用，尤其對產(chǎn)氣莢膜梭菌的有著較強(qiáng)的抑制能力，在飼料添加劑領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。