田 輝,謝引榮,王 琰,馬 卓,范文廣,趙 萍,曹瑩瑩,任海偉
(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050)
發(fā)酵食品可提高食品的營(yíng)養(yǎng)和安全性,改善食品感官特性[1]。而酵母菌是許多發(fā)酵食品中必不可少的功能性微生物之一,在工業(yè)食品生產(chǎn)和傳統(tǒng)發(fā)酵食品中都發(fā)揮著重要作用[2]。酵母菌作為單細(xì)胞真核微生物,長(zhǎng)期以來(lái)不僅被用于面包和酒精類食品生產(chǎn)中,在其他發(fā)酵食品生產(chǎn)中也具有主導(dǎo)作用,如傳統(tǒng)發(fā)酵類的植物、乳制品、魚(yú)類和肉類[3]。酵母菌主要在食品發(fā)酵中起到產(chǎn)生酒精、改善質(zhì)地、酸化保藏、產(chǎn)生抑菌性物質(zhì)、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、去除抗?fàn)I養(yǎng)因子以及產(chǎn)生生物活性肽和維生素等作用[4]。
自然界中發(fā)現(xiàn)的酵母菌已有1 500多種[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酵母種類也很多,且不同食品中的酵母菌種類也有差異,如傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、庫(kù)德畢赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)及其他畢赤酵母屬(Pichiaspp.)菌株;發(fā)酵肉制品中的漢遜德巴利酵母(Debaryomyce shansenii)、誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)及解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica);發(fā)酵橄欖、可可和咖啡中的釀酒酵母、仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniaspora opuntiae)、畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomycessp.)及假絲酵母屬(Candidaspp.)[3]。除酵母菌的發(fā)酵特性及有益作用外,部分酵母菌通過(guò)產(chǎn)生水解酶類、形成氣體、分解有機(jī)酸、產(chǎn)生色素或異味等,導(dǎo)致食品(以高酸性或高糖度食品為主)腐敗[6]。
我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類豐富、原料多樣、所含菌種資源豐富。微生物的多樣性研究,有助于闡明傳統(tǒng)食品的發(fā)酵機(jī)制及開(kāi)發(fā)自主產(chǎn)權(quán)發(fā)酵劑,或有效控制腐敗微生物生長(zhǎng),保障食品安全。紅茶菌、藏靈菇及酸菜作為我國(guó)傳統(tǒng)自制發(fā)酵食品,其營(yíng)養(yǎng)特性及所含有的微生物種類逐漸受到人們重視,不同地區(qū)和培養(yǎng)環(huán)境下,其中的酵母菌種類和特性具有一定差異性,有待深入研究及利用[7-9]。本研究從紅茶菌、藏靈菇及甘肅地區(qū)酸菜中分離和鑒定酵母菌,并對(duì)菌株發(fā)酵性能進(jìn)行分析,以期為酵母菌資源利用提供數(shù)據(jù)支持。
1.1.1 樣品
紅茶菌:采集自甘肅省蘭州市和陜西省寶雞市,各1份;藏靈菇:采集自山東省德州市和安徽省蕪湖市,各1份;酸菜:采集自甘肅省永登市2個(gè)不同農(nóng)戶,各1份。
1.1.2 培養(yǎng)基
紅茶菌活化培養(yǎng)基:綠茶2 g,蔗糖15~20 g,蒸餾水500 mL,煮沸15~20 min,于超凈臺(tái)中用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾,密封后備用。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)改良培養(yǎng)基:200 g去皮土豆(切塊)煮沸20 min后,過(guò)濾冷卻,添加瓊脂粉16 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,氯霉素0.1 g,蒸餾水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。
PDA培養(yǎng)基:200 g去皮馬鈴薯(切塊)煮沸20 min,冷卻后用四層紗布過(guò)濾,加葡萄糖20 g,固體培養(yǎng)基加瓊脂粉16 g,蒸餾水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min。
1.1.3 試劑
亞甲基藍(lán)、重鉻酸鉀、無(wú)水乙醇、蛋白胨、氯霉素、葡萄糖、蔗糖、乳糖及瓊脂粉(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酵母基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化科技有限公司;ExTaqDNA聚合酶(5 U/mL):寶生物工程有限公司。
LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;UV2600A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼科(上海)儀器有限公司;TGL-16G離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;SK200生物顯微鏡:麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;SHZ-82恒溫振蕩器:常州國(guó)華電器有限公司。
1.3.1 酵母菌的分離純化[10]
無(wú)菌條件下,吸取不同樣品(或發(fā)酵液)25 mL至225 mL生理鹽水(8.5 g/L NaCl)中,充分混勻,并以10倍梯度稀釋法稀釋至10-8,再取100 μL不同梯度的稀釋液涂布于PDA改良培養(yǎng)基(含氯霉素)上,倒置于30 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征。使用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落,分別劃線于PDA固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后,根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行第二次劃線和培養(yǎng),得到酵母菌單一純化菌落。
1.3.2 菌種的保藏與活化[11]
挑取單一菌落至PDA 液體培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩(200 r/min)培養(yǎng)24 h,連續(xù)培養(yǎng)兩代,按酵母菌液∶甘油溶液=3∶2的比例添加滅菌的體積分?jǐn)?shù)50%的甘油溶液,使甘油最終體積分?jǐn)?shù)為20%,混勻后-20 ℃冷凍保藏。
保藏菌種使用前需進(jìn)行活化,即將菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩(200 r/min)培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化兩代。
1.3.3 酵母菌的鑒定
(1)菌株形態(tài)學(xué)鑒定
觀察純化單一菌落的顏色、形狀、邊緣、表面光滑度及濕潤(rùn)度等特征。
挑取單一菌落,進(jìn)行美藍(lán)染色,并在光學(xué)顯微鏡(40×)物鏡下觀察菌體形態(tài)。
(2)糖發(fā)酵試驗(yàn)
分別將PDA液體培養(yǎng)基中的碳源設(shè)定為D-葡萄糖、蔗糖及乳糖。采用杜氏管法,將活化三代后菌株以2%的接種量接種至裝有倒置杜氏管的10 mL PDA培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)2~3 d,觀察和記錄菌株對(duì)不同碳源的發(fā)酵情況。對(duì)于不發(fā)酵或發(fā)酵力較弱的菌株,延長(zhǎng)觀察至10 d[12]。
(3)rDNA基因間隔序列(ITS)測(cè)定
離心收集菌體,提取基因組,對(duì)rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。正反向引物分別為ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。采用50 μL反應(yīng)體系為:2.5 U ExTaq酶,5 μL 10×ExTaqBuffer(Mg2+),50 μmol 脫氧核糖核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP)Mixture,2 μg模板,5 μmol正反向引物,無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min,35個(gè)循環(huán)包括:94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 000 bp/min。最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。所得DNA序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站上通過(guò)基于局部比對(duì)算法的搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行比對(duì),初步確定菌株的種屬[13]。并將rDNA-ITS序列提交至GenBank獲取序列注冊(cè)號(hào)。
使用MEGA 6軟件構(gòu)建基因發(fā)育樹(shù),將目標(biāo)序列與多個(gè)模式菌株的rDNA-ITS,通過(guò)鄰接法(neighborhood-joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),自展值(bootstrap value)分析設(shè)置重復(fù)1 000次。
1.3.4 酵母菌的發(fā)酵與生長(zhǎng)特性
(1)產(chǎn)乙醇試驗(yàn)
將活化菌株以2%(V/V)的接種量接種于PDA液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃發(fā)酵3 d,采用重鉻酸鉀比色法測(cè)定產(chǎn)乙醇能力[13]。以乙醇含量(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制乙醇含量-吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程為y=23.886x+0.001 6,相關(guān)性系數(shù)R2=0.996 3。
(2)生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將酵母菌按5%(V/V)的接種量接入PDA液體培養(yǎng)基中,在30 ℃條件下培養(yǎng),以未接種PDA培養(yǎng)基為對(duì)照,每組設(shè)置兩個(gè)平行,每隔3 h測(cè)定培養(yǎng)液在波長(zhǎng)600 nm處的OD600nm值,連續(xù)測(cè)48 h,繪制酵母菌的生長(zhǎng)曲線。
經(jīng)過(guò)3次平板劃線培養(yǎng),分別從藏靈菇、紅茶菌及酸菜中分離到14株酵母菌疑似菌株(見(jiàn)表1)。
表1 不同食品來(lái)源中的酵母菌疑似菌株Table 1 Suspected yeasts from different food sources
2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征
觀察14株疑似酵母菌的菌落特征與細(xì)胞形態(tài),結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,菌落形態(tài)基本上都是圓形,顏色分別呈白色、乳白色或淡黃色,大多菌落表面光滑。細(xì)胞形態(tài)有圓形、橢圓形、卵圓形或臘腸狀等。根據(jù)不同食品來(lái)源,其中紅茶菌中的酵母菌菌落較大,而藏靈菇和酸菜中菌落較小。以上特征說(shuō)明不同來(lái)源之間酵母菌具有形態(tài)學(xué)多樣性。
表2 不同食品來(lái)源疑似酵母菌的菌落特征與菌體細(xì)胞形態(tài)Table 2 Colony characteristics and cell morphology of suspected yeasts from different food sources
2.2.2 糖發(fā)酵試驗(yàn)
由表3可知,大部分疑似菌株(X1-1、X1-2、X3-3、Y4-2、R5-1、R5-2、R5-3、R5-4、M2-1、M2-2)可代謝葡萄糖,而對(duì)蔗糖和乳糖發(fā)酵性能較弱或不能發(fā)酵,如發(fā)酵蔗糖時(shí),菌株X1-1和X3-3可較快產(chǎn)氣,而X1-2則需7 d后才產(chǎn)生氣泡;發(fā)酵乳糖時(shí),僅X1-1和X3-3表現(xiàn)出可代謝性能。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)特征觀察及糖發(fā)酵試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)菌株間存在一定差異,但需配合rDNA-ITS序列測(cè)定對(duì)其種屬進(jìn)行更為精確的鑒定。
表3 不同食品來(lái)源疑似酵母菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sugar fermentation test of suspected yeasts from different food sources
2.2.3 rDNA-ITS序列分析
rDNA-ITS序列經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序后,通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)中BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)(見(jiàn)表4)。經(jīng)序列測(cè)定和分析,確定了14株疑似酵母菌中有9株為酵母菌,而其他5株的rDNA-ITS序列未能通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)DNA產(chǎn)物,推測(cè)其為單細(xì)胞原核微生物。將9株菌的rDNAITS提交至GenBank后,獲得序列注冊(cè)號(hào)分別為:MZ506852(M2-1)、MZ506853(M2-2)、MZ506854(R5-1)、MZ506855(R5-2)、MZ506856(R5-3)、MZ506857(R5-4)、MZ506858(X1-1)、MZ506859(X1-2)及MZ506860(X3-3)。
使用MEGA6軟件構(gòu)建了目標(biāo)菌株與參考菌株rDNAITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。
由表4、圖1可知,9株酵母菌歸為4個(gè)不同的屬。其中,藏靈菇發(fā)酵乳中分離到的3株菌(X1-1、X1-2、X3-3)鑒定為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromy cesmarxianus);紅茶菌發(fā)酵液中獲得的3株菌(R5-2、R5-3、R5-4)鑒定為異常假絲酵母(Candida incommunis)及1株菌鑒定為Starmerella davenportii;酸菜中分離到的2株菌(M2-1、M2-2)鑒定為瑟氏哈薩克斯坦酵母(Kazachstania servazzii)。不同種類食品中菌株屬于不同種類酵母菌。
圖1 基于rDNA-ITS序列不同食品來(lái)源篩選酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of screened yeasts from different food sources based on rDNA-ITS sequences
表4 基于rDNA-ITS序列菌株對(duì)比結(jié)果Table 4 Comparison of strains based on rDNA-ITS sequences
2.3.1 產(chǎn)乙醇能力
酵母菌屬于兼性厭氧菌,無(wú)氧環(huán)境下會(huì)將葡萄糖分解產(chǎn)生CO2和乙醇。乙醇發(fā)酵是評(píng)價(jià)酵母菌發(fā)酵性能的重要指標(biāo)之一。
由圖2可知,產(chǎn)乙醇量最低的菌株為馬克斯克魯維酵母X3-3(29.6%),產(chǎn)乙醇量較高的為異常假絲酵母R5-2(75.8%)和瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2(71.0%)。相對(duì)而言,紅茶菌和酸菜中的酵母菌株產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)于藏靈菇中酵母菌,即馬克斯克魯維酵母的產(chǎn)乙醇力較弱,而Starmerella davenportii、異常假絲酵母及瑟氏哈薩克斯坦酵母的產(chǎn)乙醇力較強(qiáng)。
圖2 不同酵母菌產(chǎn)乙醇能力比較Fig.2 Comparison of ethanol production capacity of different strains
2.3.2 生長(zhǎng)特性
選取每個(gè)種屬中乙醇產(chǎn)量最高的菌株,進(jìn)行0~51 h生長(zhǎng)曲線的測(cè)定(見(jiàn)圖3)。由圖3可知,4種酵母菌中馬克斯克魯維酵母生長(zhǎng)能力最佳,菌株X1-2在約6 h時(shí)即進(jìn)入對(duì)數(shù)期,且在約30 h時(shí)達(dá)到最大菌數(shù)(OD600nm值=6.152)。
圖3 四株酵母菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of 4 yeast strains
而其他3種酵母在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較緩慢,其中瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2在約9 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期,約15 h進(jìn)入穩(wěn)定期,而此階段OD600nm值<0.6。異常假絲酵母R5-2在0~39 h期間的菌體增殖較為平緩,但在39~51 h期間增殖較為迅速,并在51 h達(dá)到最大吸光度值(OD600nm值=1.313)。Starmerella davenportiiR5-1在0~51 h內(nèi)增殖最為緩慢,整個(gè)階段,OD600nm值<0.2,可能是PDA培養(yǎng)基中缺少該菌株所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致的。
馬克斯克魯維酵母最初曾被歸屬為酵母屬,后來(lái)劃歸至克魯維酵母屬[15]。馬克斯克魯維酵母分別被美國(guó)和歐洲認(rèn)定為滿足“公認(rèn)安全”(generally regarded as safe,GRAS)和“安全資格認(rèn)定”(qualified presumption of safety,QPS)的安全菌株標(biāo)準(zhǔn)[16]。由圖1可知,馬克斯克魯維酵母與瑟氏哈薩克斯坦酵母在一個(gè)進(jìn)化分支上。瑟氏哈薩克斯坦酵母以前被稱為賽瓦酵母,屬于酵母屬[17]。因此,馬克斯克魯維酵母與瑟氏哈薩克斯坦酵母進(jìn)化關(guān)系較為接近,與本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果是一致的。Starmerella davenportii與異常假絲酵母在另一個(gè)進(jìn)化分支上。Starmerella davenportii曾被稱為Candida davenportii,后來(lái)被重新命名為Starmerella davenportii,可見(jiàn)二者具有較為接近的進(jìn)化關(guān)系[18]。
根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》,馬克斯克魯維酵母對(duì)葡萄糖、蔗糖和乳糖的發(fā)酵性能為可變性;異常假絲酵母不可發(fā)酵乳糖,對(duì)葡萄糖的發(fā)酵至7 d后才出現(xiàn)氣泡,對(duì)蔗糖發(fā)酵力具有可變性[19]。而本實(shí)驗(yàn)中馬克斯克魯維酵母X1-1和X3-3對(duì)3種糖都具有發(fā)酵能力;異常假絲酵母R5-2、R5-3及R5-4對(duì)葡萄糖的發(fā)酵至7 d后觀察到氣泡,對(duì)蔗糖和乳糖都不能發(fā)酵。在《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中,賽瓦酵母(瑟氏哈薩克斯坦酵母)可發(fā)酵葡萄糖,不可發(fā)酵蔗糖和乳糖[19]。哈薩克斯坦酵母屬由于缺乏β-半乳糖苷酶,因此不能利用乳糖[20]。本研究中,瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-1與M2-2可發(fā)酵葡萄糖,對(duì)另兩種糖都未觀察到發(fā)酵能力。因此,馬克斯克魯維酵母、異常假絲酵母及瑟氏哈薩克斯坦酵母的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》基本一致。
Starmerella davenportii在《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中未被收錄。但文獻(xiàn)報(bào)道中的益生型酵母Starmerella davenportiiDo18可發(fā)酵D-葡萄糖、棉子糖及果糖,不發(fā)酵乳糖[18]。本研究中Starmerella davenportiiR5-1對(duì)D-葡萄糖的發(fā)酵至7 d后產(chǎn)氣,而對(duì)蔗糖和乳糖則不能發(fā)酵,因此試驗(yàn)結(jié)果與菌株Do18基本一致。
藏靈菇即西藏開(kāi)菲爾粒,是由乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等微生物組成的共生體[21]。盧曼等[22]從藏靈菇中分離出釀酒酵母屬、克魯維酵母屬及亞羅酵母屬中的16株菌,其中8株確定為馬克斯克魯維酵母菌。馬克斯克魯維酵母菌作為一種食品級(jí)酵母,具有多種益生特性,如可代謝乳糖和菊粉、較高耐熱性、可產(chǎn)生溶解酶類、較高生長(zhǎng)速率及產(chǎn)生乙醇等,因而非常適合工業(yè)應(yīng)用[15]。
紅茶菌即康普茶,是茶糖水經(jīng)酵母菌、醋酸菌及乳酸菌等微生物發(fā)酵而成的一種功能性飲料[23]。紅茶菌中主要有假絲酵母屬、酒香酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、類酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、德克酵母屬及德巴利酵母屬等[23-24]。近期報(bào)道的益生型酵母Starmerella davenportiiDo18也分離自紅茶菌[18]。
酸菜和泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜類食品,含有多種酵母菌和乳酸菌等微生物。烏日娜等[25]從延邊泡菜中分離出4株耐鹽較強(qiáng)的賽瓦酵母。瑟氏哈薩克斯坦酵母(賽瓦酵母)在一些發(fā)酵食品中可以起到改善風(fēng)味的作用[26]。但有研究認(rèn)為,瑟氏哈薩克斯坦酵母是韓國(guó)泡菜中形成不良白色菌膜的主要酵母之一,會(huì)導(dǎo)致泡菜產(chǎn)品脹包、形成不良?xì)馕都耙鹋莶速|(zhì)地軟化[27]。
馬克斯克魯維酵母相較于其他酵母菌,具有更快的生長(zhǎng)速率,這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[15]。在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中,馬克斯克魯維酵母的生長(zhǎng)速率是釀酒酵母的兩倍[28]。馬克斯克魯維酵母同釀酒酵母一樣,屬于兼性厭氧菌,可通過(guò)將糖發(fā)酵成乙醇產(chǎn)生能量,也可通過(guò)氧化磷酸化及三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)產(chǎn)生更多能量[15]。而后者有利于菌體生物量的增加。本研究中馬克斯克魯維酵母產(chǎn)乙醇力較弱,而生長(zhǎng)性能優(yōu)異,因此菌株X1-1、X1-2及X3-3更偏向于將更多碳源通過(guò)有氧呼吸產(chǎn)生能量,從而提高了菌體繁殖速率。
從3種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離到4個(gè)不同種屬中的9株酵母菌,包括藏靈菇中的3株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromy cesmarxianus)、紅茶菌中的1株Staemerella dovenpoetii酵母和3株異常假絲酵母(Candida incommunis)及酸菜中的2株瑟氏哈薩克斯坦酵母(Kazachstania servazzii)。不同食品來(lái)源的酵母菌種屬及發(fā)酵性能各不相同,且菌株之間發(fā)酵性能具有顯著差異性。3株馬克斯克魯維酵母產(chǎn)乙醇力較弱,但菌株X1-2生長(zhǎng)速率快且活菌數(shù)高;異常假絲酵母R5-2和瑟氏哈薩克斯坦酵母M2-2產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)。