黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐熱突變體的篩選

李珊珊，劉德海，刁文濤*，陳曉飛，權淑靜

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008）

甘露聚糖是自然界中含量僅次于木聚糖的半纖維素，是由甘露糖以β-1,4糖苷鍵連接形成主鏈，由半乳糖和葡萄糖參與形成一些側鏈的高聚物，廣泛分布在高等植物和一些藻類的細胞壁及一些豆科植物的種子中[1-3]。在多種行業(yè)中甘露聚糖都會影響到相關植物類原料的利用，例如，當飼料中含有較多甘露聚糖時，就會在動物腸道中形成高黏度的膠狀物質(zhì)而影響腸道內(nèi)消化酶對飼料的消化，而降低動物對飼料的利用效率[4-6]；在生物能源、造紙、紡織等工業(yè)中，甘露聚糖都會產(chǎn)生不利的影響[2，7]。所以，在許多情況下需要對原料中的甘露聚糖進行水解。

由于甘露聚糖結構復雜，對其徹底水解需要多種酶的參與，包括β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脫乙酰酯化酶等，其中β-甘露聚糖酶主要水解β-1,4糖苷鍵連接形成的主鏈，其作用最為關鍵[1-2，8-9]。所以在上述行業(yè)中β-甘露聚糖酶被用于消除甘露聚糖的消極影響[2，4-7，10]。此外，在食品行業(yè)中β-甘露聚糖酶可以應用于甘露寡糖的制備[11-12]，在石油開采行業(yè)中β-甘露聚糖酶用于降解壓裂液而增加壓裂液的反排率[2]，在洗滌劑中添加β-甘露聚糖酶可以增加洗滌劑對衣物上甘露糖的洗滌效果[13]。所以，β-甘露聚糖酶類產(chǎn)品有著廣闊的應用市場。

而在許多情況下，β-甘露聚糖酶的制備與應用過程中需要經(jīng)歷高溫環(huán)境，因此開發(fā)β-甘露聚糖酶產(chǎn)品首先需要選取耐熱性良好的β-甘露聚糖酶[14-16]。β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，其中因微生物來源的β-甘露聚糖酶相對于動植物來源的β-甘露聚糖酶更適宜于生產(chǎn)應用而得到更廣泛的研究，其中大多數(shù)已知的β-甘露聚糖酶并不具備耐熱性，而在絲狀真菌和一些芽孢菌中發(fā)現(xiàn)了一些耐熱β-甘露聚糖酶[2，17-21]，為了進一步改良這些β-甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)，使其更適用于生產(chǎn)應用，提高生產(chǎn)效率，一般通過分子生物學的手段對其進行基因改造[21-23]。本研究利用易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）與定點突變的方法對一個黑曲霉來源的糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）家族5的耐熱型酸性β-甘露聚糖酶ManA進行了耐熱突變體篩選，獲得耐熱性提升的突變體，并對突變位點進行分析，為GH5家族β-甘露聚糖酶的改造提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和基因

大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態(tài)細胞：江蘇康為世紀生物科技有限公司；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115細胞、畢赤酵母表達載體pGAPZαA：武漢淼靈生物科技有限公司；黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA：根據(jù)Genebank中登錄的氨基酸序列（XM_001390670.1），委托華大基因股份有限公司進行密碼子改造后合成。

1.1.2 化學試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ（20000U/mL）、NotⅠ（20000U/mL）、AvrⅡ（5000U/mL）：北京NEB公司；T4連接酶（5000U/mL）：美國Thermo公司；Taq酶（2×TaqPlus MasterMix）：江蘇康為世紀生物科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）回收試劑盒：天根生物科技有限公司；Pfu DNA聚合酶（2 500 U/mL）和DNA Marker：全式金生物科技有限公司；蛋白Marker：生工生物工程股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：北京酷來博科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白濃度測定試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；其他分析純試劑均為國藥集團化學試劑有限公司；引物：華大基因股份有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)采用Luria Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5 g/L和瓊脂糖15 g/L。

酵母培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L和葡萄糖20 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖山梨醇（yeast extract peptone dextrose sorbitol，YPDS）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇182 g/L和瓊脂糖15 g/L。

上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Tpersonal型PCR儀：德國Biometra公司；3001型全波長掃描式讀數(shù)儀：美國Thermo公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀、Genepulser Mx Cell型電穿孔儀、0.2 cm電轉(zhuǎn)杯：美國Bio-Rad公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設備有限公司；HYG-A型恒溫搖床：太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1β-甘露聚糖酶基因manA重組表達載體的構建

根據(jù)Genebank 中登錄的ManA 氨基酸序列（XM_001390670.1）合成黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA，用DNA限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對基因manA和畢赤酵母組成型表達載體pGAPZαA同時進行雙酶切，之后用T4 DNA連接酶將基因manA連接進載體pGAPZαA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，涂布在含有30 μg/mL博來霉素的低鹽LB平板上篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pGAPZαA-manA。

1.3.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化

挑取GS115單克隆至5mLYPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)過夜；取1 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至100 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=1.0～1.3），取1 mL菌液分裝到1.5 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用無菌水（4 ℃預冷）重懸，同樣條件下離心，棄上清；加入1 mL處理液[100 mmol/L LiAc；10 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）；0.6mol/L山梨醇；10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）]重懸細胞，室溫放置20min；4℃、10000r/min離心1 min，棄上清，加入1 mL 1 mol/L的山梨醇溶液重懸后離心，重復一次，之后將細胞重懸在80 μL的1 mol/L山梨醇溶液中，制成感受態(tài)細胞；在80 μL感受態(tài)細胞中加入1～10 μg的AvrⅡ線性化的質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移至預冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5 min；設置電壓1.5 kV，脈沖6 ms（1.5 kV，200 Ω，25 μF），電擊一次；電擊后迅速加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇溶液重懸細胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，30 ℃靜置1 h后，將其涂布于含有100 μg/mL博來霉素的YPDS培養(yǎng)基上，30 ℃避光培養(yǎng)3 d。

1.3.3 易錯PCR

以pGAPZαA-manA為模板，采用引物GAP-mF：5'-CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG-3'，GAP-mR：5'-GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG-3'，以Taq酶作為聚合酶，進行PCR，在反應體系中補加0.1 mmol/L的MnCl2和0.5 mmol/L的脫氧鳥苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate，dGTP）；PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸5 min，循環(huán)30次；72 ℃反應10 min；即得pGAPZαA-manA突變文庫，用DNA回收試劑盒回收后乙醇沉淀，直接用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化（不需要AvrⅡ酶切）。

1.3.4β-甘露聚糖酶酶活測定

β-甘露聚糖酶酶活參考國家標準GB/T 36861—2018《飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力的測定分光光度法》進行測定。β-甘露聚糖酶酶活定義：在37 ℃、pH值5.5條件下，每分鐘從3 mg/mL的甘露聚糖溶液中釋放1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活單位（U）。

1.3.5β-甘露聚糖酶耐熱克隆篩選

將pGAPZαA-manA突變體文庫電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，涂布在含100 μg/mL博來霉素的YPDS培養(yǎng)基平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d篩選陽性克?。惶羧PDS平板上的所有克隆，分別接入2 mL的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 d；取發(fā)酵液，12 000 r/min離心2 min，收集上清，取200 μL于75 ℃加熱30 min后涼水冷卻至室溫，以DNS法分別測定上清加熱前后的β-甘露聚糖酶活性，計算加熱后發(fā)酵液與加熱前發(fā)酵液的酶活比值作為相對酶活，篩選相對酶活顯著高于野生型（wt）ManA的突變克隆。

1.3.6β-甘露聚糖酶定點突變

以pGAPZαA-manA為模板，Pfu酶作為聚合酶進行聚合酶鏈式反應，PCR擴增程序是：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 min，循環(huán)15次；72 ℃反應10 min；以表1中的引物分別將β-甘露聚糖酶283位組氨酸（histidine，H）突變?yōu)槠渌被?，PCR結束后在反應體系中加入限制性內(nèi)切酶DpnⅠ，37 ℃反應消化原始模板后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，涂布在含有30 μg/mL博來霉素的低鹽LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜篩選陽性克隆，提取突變體質(zhì)粒后，基因測序確定突變成功。

表1 283位氨基酸定點突變引物Table 1 Primers for site-directed mutagenesis of H283

續(xù)表

1.3.7β-甘露聚糖酶純化與濃度測定

挑取β-甘露聚糖酶ManA畢赤酵母工程菌至2 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物至100 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d，12 000 r/min離心20 min，收集上清，與用結合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 7.9）平衡后的鎳柱填料（HisPurTMNi-NTA Superflow Agarose，Thermo）混合，用結合緩沖液漂洗3次，然后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪唑，pH 7.9）洗脫，收集洗脫液；用超濾膜濃縮洗脫液后用分子篩柱子（SuperdexTM200 10/300GL）進一步純化（緩沖液為150 mmol/L NaCl），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純化結果，用BCA法測定β-甘露聚糖酶濃度。

1.3.8β-甘露聚糖酶酶學性質(zhì)測定

最適反應溫度測定：在pH4.0條件下測定不同溫度（45℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃）下β-甘露聚糖酶酶活，計算各溫度條件下酶活與最高酶活的比值作為相對酶活；最適反應pH值測定：在80 ℃條件下測定不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，100 mmol/L 檸檬酸鈉）條件下β-甘露聚糖酶酶活，計算各pH條件下酶活與最高酶活的比值作為相對酶活，并計算pH 4.0條件下β-甘露聚糖酶比酶活；溫度耐受性檢測：取200 μL酶液于不同溫度（70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃）條件下加熱30 min后涼水冷卻至室溫，然后測定加熱前后的β-甘露聚糖酶酶活，以相應溫度條件下加熱后酶活與加熱前酶活的比值作為相對酶活；pH耐受性檢測：將酶液于50 ℃在不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0（50 mmol/L檸檬酸鈉）、7.0（50 mmol/L磷酸鈉）、8.0、9.0（50 mmol/L Tris-HCl））條件下處理24 h后測定β-甘露聚糖酶酶活，以相應pH條件下處理后酶活與處理前酶活的比值作為相對酶活。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件分析實驗數(shù)據(jù)并制作圖表；蛋白結構B因子圖及蛋白結構信息圖用Pymol 2.3.2軟件作圖；蛋白序列在ClustalW2網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 酵母重組表達載體構建

利用質(zhì)粒小提試劑盒從連接轉(zhuǎn)化后的Top10感受態(tài)中提取重組質(zhì)粒pGAPZαA-manA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。由圖1可知，得到3 100 bp和1 000 bp的DNA片段，與預期相符，證明質(zhì)粒pGAPZαA-manA構建成功。

圖1 質(zhì)粒pGAPZαA-manA酶切瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of digestion of plasmid pGAPZαA-manA

2.2 易錯PCR與耐熱突變體篩選

將以pGAPZαA-manA為模板進行的易錯PCR得到的產(chǎn)物見圖2A。由圖2A可知，通過易錯PCR得到了特異性的PCR條帶。將PCR產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，在含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板上篩選陽性克隆結果見圖2B。由圖2B可知，畢赤酵母轉(zhuǎn)化成功，平板上長有較多的陽性克隆。并對所有克隆的發(fā)酵液的β-甘露聚糖酶耐熱性進行檢測，篩選到2號克隆在75 ℃加熱30 min后的相對酶活為76.95%，較野生型的26.66%相對酶活有顯著提高。提取2號克隆的基因組DNA，以其為模板，以通用引物GAP-F和3'AOX1進行PCR，對PCR產(chǎn)物進行測序，經(jīng)序列比對后確定2號克隆中基因manA的848位的腺嘌呤（adenine，A）突變?yōu)轼B嘌呤（guanine，G），相應的蛋白ManA的283位組氨酸（H）突變?yōu)榫彼幔╝rginine，R）。

圖2 質(zhì)粒pGAPZαA-manA易錯PCR（A）與GS115轉(zhuǎn)化克?。˙）Fig.2 Error-prone PCR (A) of plasmid pGAPZαA-manA and transformants of GS115 (B)

2.3 ManA 283位氨基酸定點突變與耐熱性提高突變體篩選

以pGAPZαA-manA為模板進行定點突變將ManA的第283為組氨酸（H）分別突變?yōu)槌彼幔≧）外的其他18種常見氨基酸，提取突變質(zhì)粒，并分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115表達ManA突變體蛋白，并測定ManA各個突變體在75 ℃加熱30 min后的相對酶活結果見圖3。由圖3可知，在這些突變體中僅有H283K突變體的相對酶活較野生型顯著提高，相對酶活達到83.57%，而其他突變體的相對酶活均在10%以下，顯著低于野生型。

圖3 283位氨基酸突變耐熱性篩選Fig.3 Screening of heat resistant mutants at amino acid position 283

2.4 野生型與突變體ManA蛋白的酶學性質(zhì)比較

純化ManA的野生型和H283K、H283R突變體蛋白的SDS-PAGE結果見圖4。由圖4可知，純化后的ManA野生型及突變體蛋白都達到了較高的純度。

圖4 純化后的野生型及突變體蛋白的SDS-PAGE結果Fig.4 SDS-PAGE results of purified wild type and mutant protein

分別測定野生型和H283K、H283R突變體蛋白在70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃下加熱30 min后的酶活，計算相對酶活，其熱穩(wěn)定性結果見圖5A。由圖5A可知，在75 ℃加熱30 min后，H283K、H283R突變體的相對酶活分別為76.95%和83.57%，顯著高于野生型的相對酶活（26.66%），在80 ℃加熱30 min后，H283K、H283R突變體的相對酶活分別為11.65%和27.35%，同樣顯著高于野生型的相對酶活（0.52%）。測定野生型和H283K、H283R突變體的不同反應溫度條件下的酶活，相對酶活計算結果見圖5B。由圖5B可知，野生型和H283K、H283R突變體的最適反應溫度均為80 ℃。野生型和H283K、H283R突變體的最適反應pH值及pH穩(wěn)定性分別見圖5C和圖5D。由圖5C可知，野生型和H283K、H283R突變體的最適反應pH值均為4.0。由圖5D可知，在pH3.0～9.0的條件下，50 ℃保存24 h，H283K突變體與野生型的相對酶活均＞90%，而H283R突變體在pH3.0時穩(wěn)定性較野生型有所降低，相對酶活下降到84.72%。

圖5 野生型與突變體蛋白酶學性質(zhì)檢測結果Fig.5 Determination results of enzyme property of protein produced by wild type and mutant

計算野生型和H283K、H283R突變體在80 ℃、pH4.0條件下的比酶活，結果見表2。由表2可知，這兩種突變體與野生型的比酶活沒有顯著變化，說明這兩種突變在提升β-甘露聚糖酶ManA耐熱性的同時對其比酶活沒有明顯影響。

表2 野生型與突變體的比酶活Table 2 Specific activities of wild type and mutants

2.5 討論

由以上實驗結果可以看到將黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA的第283位組氨酸（H）突變?yōu)榫彼幔≧）或賴氨酸（K）后，其耐熱性有顯著的提升，為尋找其耐熱性提升的原因，將黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA的蛋白晶體結構信息（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）號：3WH9）與另外2種的GH5家族的β-甘露聚糖酶（PDB號：3WFL）、（PDB號：3ZIZ）的結構信息進行比較，根據(jù)B因子（B-factor）對其進行作圖，如圖6A、6B、6C所示，可以看到3WH9中H283位點的B因子明顯大于相應的3WFL的K283位點和3ZIZ的R293位點，而B因子的大小可以反應出原子、氨基酸側鏈以及整個區(qū)域的靈活度，B因子越低時一般熱穩(wěn)定性越高[24-26]。與之相符的是通過蛋白晶體結構中氨基酸的相互作用可以看到3WH9中H283位點的側鏈參與了2個氫鍵的形成（見圖6D），而3WFL的K283位點的側鏈與其他3個氨基酸（G321、Y322、T323）的主鏈形成了3個氫鍵（見圖6E），3ZIZ的R293位點的側鏈與3個氨基酸（Y289、F334、T335）的主鏈和1個氨基酸（Q297）的側鏈形成了4個氫鍵（見圖6F），所以相對于3WH9，3WFL和3ZIZ在該位點處的原子相互作用更強，結構也更加穩(wěn)定。比對3WH9、3WFL、3ZIZ以及另外2種GH5家族的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列（見圖6G），可以看到與3WFL的K283和3ZIZ的R293形成氫鍵的氨基酸在這5種GH5家族的β-甘露聚糖酶中具有較高的保守性，而且因為這些氨基酸多數(shù)是由主鏈參與氫鍵形成，所以氨基酸的種類對其氫鍵的形成影響應該不大，所以將黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA的H283位點突變?yōu)镵或者R時極有可能形成與3WFL和3ZIZ中相似的結合狀態(tài)，相對于野生型，該處的氫鍵會增多，穩(wěn)定性會提高，這有可能就是H283K和H283R突變體相對于野生型耐熱性提高的原因。所以，本研究成果也將為改良一些與ManA結構相近的GH5家族的β-甘露聚糖酶提供借鑒。

圖6 ManA與其他GH5家族β-半乳糖苷酶的蛋白結構與序列比較Fig.6 Comparison of the protein structure and sequence of ManA with other GH5 β-mannanases

3 結論

本研究通過易錯PCR與定點突變的方法獲得了兩個黑曲霉來源β-甘露聚糖酶ManA的耐熱突變體，分別為H283R和H283K，這兩個突變體與野生型相比耐熱性得到明顯提升，而其他酶學性質(zhì)變化較小，但將H283位點突變?yōu)槠渌被釙r，酶的熱穩(wěn)定性顯著降低，說明ManA的283位組氨酸對于該酶的熱穩(wěn)定性很關鍵。通過與同源的GH5家族β-甘露聚糖酶的蛋白結構與序列進行比較，可以看到對該位點進行突變也可能適用于改良其他結構相近的GH5家族β-甘露聚糖酶的耐熱性。