伊枯草菌素A高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及發(fā)酵工藝研究

曹小潔，萬銀平，趙長樂，張慧莉

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

目前，我國對(duì)病原真菌的防治主要是化學(xué)農(nóng)藥[1-2]，但使用化學(xué)農(nóng)藥容易造成環(huán)境污染，所以需要尋找一種對(duì)環(huán)境安全且防治效果顯著的替代品[3]。芽孢桿菌（Bacillus）生長過程中，能夠合成脂肽類抗生素[4]、細(xì)菌素[5]和抑菌蛋白[6]等，其中，脂肽類抗生素主要有伊枯草菌素（iturin）[7]、芬芥素（fengycin）[8]和表面活性素（surfactin）[9]等，其對(duì)于常見的植物病原真菌具有良好的抑菌活性，可作為傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的替代品[10-11]。

iturins家族的化合物對(duì)許多具有致病性的酵母菌和霉菌有強(qiáng)烈抑制能力。Iturin A是一種β-氨基脂肪酸連成環(huán)的脂肽類抗生素，屬于iturin家族，其具有抑制某些病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumsp.）[12]、炭疽病菌（Colletotrichumspp.）[13]和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[14]等生長的特性，在生物防治上具有潛在的開發(fā)價(jià)值。陳華等[15]采用電噴霧電離-質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）法鑒定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JA產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為脂肽類抗生素iturin A，其對(duì)植物病原菌具有抗性作用；劉京蘭等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）不僅對(duì)水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）具有強(qiáng)烈的抑制作用，還對(duì)小麥赤霉病和小麥白粉病等植物病害也具有防治作用，鑒定其產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)主要也是iturin A。

iturin A及其同系物的發(fā)酵工藝控制難度大，制約著工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用[18]，因此，高產(chǎn)菌株的選育和優(yōu)良的培養(yǎng)基成分對(duì)iturin A產(chǎn)量的提高具有重大意義[19-20]。本研究首先以大麗輪枝菌V991為病原指示菌，采用平板對(duì)峙法初篩獲得具有抗菌能力的菌株，然后通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法定量篩選獲得iturin A高產(chǎn)菌株，并對(duì)其16S rDNA基因序列進(jìn)行分析，鑒定其種屬。最后對(duì)菌株產(chǎn)iturin A發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行研究，為工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)iturin A、廉價(jià)發(fā)酵原料的利用和生防菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、SF5、ND：分離自石河子土壤中，保存于石河子大學(xué)生命科學(xué)412實(shí)驗(yàn)室；大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）V991：石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院101實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、瓊脂18 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將馬鈴薯200 g切塊后煮沸20 min，濾液定容至1 L，添加葡萄糖20 g，瓊脂18 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。PDA液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

初始Landy發(fā)酵培養(yǎng)基[21]：葡萄糖20 g/L、L-谷氨酸鈉2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L，微量元素：FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

iturin A標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：美國Sigma公司；葡萄糖（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司；甘油（分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化工有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；液體樣本甘油酶法測定試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1200高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ZHWY-111B恒溫培養(yǎng)振蕩器（搖床）：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BWS-10恒溫水槽與水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XEVO TQ-S三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、X3R高速冷凍離心機(jī)Fro Fle X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌株的初篩

指示菌的制備：將大麗輪枝菌V991接種于PDA液體培養(yǎng)基，28℃、200r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d，無菌紗布過濾除去病原菌菌絲，將濾液孢子濃度稀釋至106～107CFU/mL，備用。

供試菌株的活化：將供試菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、SF5和ND接種于LB培養(yǎng)基平板，37 ℃活化16 h，備用。

抑菌活性的測定：取200 μL大麗輪枝菌V991孢子懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，分別挑取單菌落接種于平板中，每板接種4株待測菌株。記錄是否有抑菌圈的產(chǎn)生，并測定抑菌圈直徑。

1.3.2 高產(chǎn)iturin A菌株的篩選

將初篩得到的拮抗菌株的單菌落分別接種于含有30mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h制成種子液。按10%（V/V）的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至含有30 mL的初始Landy發(fā)酵培養(yǎng)基，在32 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵4 d。取發(fā)酵液1 mL，加入3 mL無水甲醇，漩渦振蕩10 min，10 000 r/min離心15 min后取上清[22]，采用HPLC法測定發(fā)酵液中iturin A的含量[23]，篩選高產(chǎn)iturin A的菌株。

1.3.3 高產(chǎn)iturin A菌株的鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取高產(chǎn)iturin A菌株的基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[24]，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，引物27F（5 μmol/L）1 μL，1492R（5 μmol/L）1 μL，雙蒸水（ddH2O）12 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸75 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電檢測，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株產(chǎn)iturin A發(fā)酵工藝的研究

發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化：額外添加NaCl[25]和酵母浸粉[16]有可能會(huì)提升iturin A的產(chǎn)量，因此在初始Landy發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，依次考察碳源種類（葡萄糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、D-木糖、甘露醇、甘油和蔗糖）（添加量2%）、氮源種類（大豆蛋白胨、花生餅粉、生黃豆粉、豆粕粉、玉米蛋白粉和棉籽粉）（添加量8%）、碳源添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%）、氮源添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、NaCl添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、酵母浸粉添加量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%）、KCl添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）及L-谷氨酸鈉添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)iturin A的影響。初始發(fā)酵條件為初始pH值6，32 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵4 d。

發(fā)酵條件的優(yōu)化：采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，考察裝液量（12%、16%、20%、24%）、初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（3%、5%、10%、15%）、培養(yǎng)溫度（25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃）對(duì)菌株產(chǎn)iturin A的影響。

最佳發(fā)酵時(shí)間的確定：高產(chǎn)菌株在最適的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件下生產(chǎn)iturin A，每24 h取樣檢測發(fā)酵液中pH、iturin A含量和甘油殘余量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用MicrosoftExcel2010、Origin2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 高產(chǎn)iturin A菌株的篩選

2.1.1 拮抗菌株的初篩

8株供試菌株對(duì)大麗輪枝菌V991的抑菌效果見圖1，抑菌圈直徑見表1。由圖1及表1可知，6株供試菌株能產(chǎn)生抑菌圈，分別為菌株Y1、Y4、Y6、Y7、SF5和ND，抑菌圈直徑分別為1.11 cm、1.09 cm、1.13 cm、1.19 cm、1.31 cm和1.23 cm。其中，菌株SF5的抑菌圈直徑最大，其次是菌株ND。

圖1 8株供試菌株對(duì)大麗輪枝菌V991的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of 8 tested strains on Verticillium dahliae V991

表1 8株供試菌株對(duì)大麗輪枝菌V991的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of 8 tested strains against Verticillium dahliae V991

2.1.2 高產(chǎn)iturin A菌株的篩選

6株拮抗菌株的iturin A產(chǎn)量見圖2。由圖2可知，菌株Y1、Y4、Y6、Y7、SF5和ND的iturinA產(chǎn)量分別為0.22g/L、0.19g/L、0.25 g/L、0.32 g/L、0.03 g/L、0.35 g/L，其中菌株ND的iturin A產(chǎn)量最高，其次為菌株Y7。初篩中菌株SF5的抑菌圈直徑最大，但iturin A產(chǎn)量最低，分析原因可能是菌株SF5中對(duì)大麗輪枝菌V991產(chǎn)生抑菌活性的是iturin家族中的其他脂肽類物質(zhì)。因此，選取菌株ND作為高產(chǎn)iturin A的菌株。

圖2 高產(chǎn)iturin A菌株的篩選Fig.2 Screening of high yield iturin A-producing strains

2.2 高產(chǎn)iturin A菌株ND的鑒定

基于16S rDNA基因序列菌株ND的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株ND與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株ND的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ND based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株ND產(chǎn)iturin A發(fā)酵工藝研究

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分

碳、氮源種類對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響見圖4。由圖4可知，甘油、豆粕粉分別作為碳、氮源時(shí)，iturin A的產(chǎn)量最高，分別為0.39 g/L、2.49 g/L。分析原因可能由于豆粕粉是遲效氮源，菌體利用豆粕作為氮源時(shí)，生長速率較低，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物iturin A的合成[26]。因此，選擇甘油和豆粕粉作為貝萊斯芽孢桿菌ND產(chǎn)iturinA的最優(yōu)碳、氮源。

圖4 碳源種類（a）和氮源種類（b）對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響Fig.4 Effects of types of carbon source (a) and nitrogen source (b)on iturin A produced by strain ND

甘油和豆粕粉添加量對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響見圖5。由圖5可知，隨著甘油添加量的升高，iturin A產(chǎn)量呈先降低后升高再降低的趨勢，分析原因可能是當(dāng)甘油添加量為2%～4%時(shí)，利于菌體的生長，營養(yǎng)成分用于菌體生長進(jìn)而減少iturin A的合成[26]；次級(jí)代謝是微生物以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些無明確功能的物質(zhì)，當(dāng)甘油添加量增加至7%時(shí)，菌體初級(jí)代謝產(chǎn)物增加，導(dǎo)致后期菌體能夠進(jìn)行次級(jí)代謝，使iturin A產(chǎn)量達(dá)到最高，為2.71 g/L[27]。由圖5亦可知，隨著豆粕粉添加量的升高，iturin A產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是高濃度豆粕粉導(dǎo)致培養(yǎng)基水分驟減，不利于氧氣的傳遞，導(dǎo)致菌體的呼吸速率減慢，限制了iturin A產(chǎn)量的進(jìn)一步提高[26]。當(dāng)豆粕粉添加量為12%時(shí)，iturin A產(chǎn)量最高，為3.24 g/L。因此，確定甘油和豆粕粉的最優(yōu)添加量分別為7%、12%。

圖5 甘油（a）和豆粕粉（b）添加量對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響Fig.5 Effects of glycerol (a) and soybean meal (b) addition on iturin A produced by strain ND

NaCl、酵母浸粉、KCl、L-谷氨酸鈉添加量對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響見圖6。

圖6 NaCl（a）、酵母浸粉（b）、KCl（c）及L-谷氨酸鈉（d）添加量對(duì)iturin A產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of NaCl (a),yeast extract powder (b),KCl (c) and L-sodium glutamate (d) addition on the yield of iturin A

由圖6可知，隨著NaCl和KCl添加量的增加，iturin A產(chǎn)量分別從3.22 g/L、3.46 g/L下降至1.74 g/L、2.88 g/L。隨著酵母浸粉和L-谷氨酸鈉添加量的增加，iturinA產(chǎn)量均呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)酵母浸粉和L-谷氨酸鈉的添加量分別為1.6%和0.1%時(shí)，iturin A產(chǎn)量最高，分別為3.41 g/L和3.52 g/L。由于NaCl和KCl的抑制作用，在后續(xù)發(fā)酵過程不添加NaCl和KCl，并確定酵母浸粉和L-谷氨酸鈉的最優(yōu)添加量分別為1.6%、0.1%。

2.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

裝液量、初始pH、接種量、溫度對(duì)菌株ND產(chǎn)iturin A的影響見圖7。

圖7 裝液量（a）、pH（b）、接種量（c）及溫度（d）對(duì)iturin A產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of liquid volume (a),pH (b),inoculum (c) and temperature (d) on iturin A yield

由圖7可知，隨著裝液量的增加，iturin A產(chǎn)量逐漸下降，分析原因可能是培養(yǎng)基成分占比的增加，會(huì)導(dǎo)致溶氧速率下降，進(jìn)而阻礙菌體的生長發(fā)育[28]。隨著初始pH值的升高，iturin A產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)，iturin A產(chǎn)量最高，為3.92 g/L，說明堿性環(huán)境利于iturin A的產(chǎn)生。隨著接種量的升高，iturin A產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)接種量為10%時(shí)，iturin A產(chǎn)量最高，達(dá)到4.08 g/L。隨著培養(yǎng)溫度的升高，iturin A產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，iturin A產(chǎn)量最高，達(dá)到4.41 g/L，分析原因可能是隨著溫度升高，水分蒸發(fā)速度過快，培養(yǎng)基變得干燥，菌體無法生長存活[29]。因此，確定最優(yōu)裝液量、接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度分別為12%、10%、8.0、28 ℃。

2.3.3 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

菌株ND發(fā)酵過程中，pH值、iturin A產(chǎn)量、甘油殘余量的變化見圖8。

圖8 pH（a）、iturin A產(chǎn)量（b）和甘油殘余量（c）隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.8 Changes of pH (a),iturin A yield (b) and glycerol residue content (c) with fermentation time

由圖8可知，菌株ND發(fā)酵過程中，pH值呈先降低后升高的趨勢，分析原因可能是由于發(fā)酵初期，細(xì)胞的生長和呼吸消耗了大量碳源產(chǎn)生有機(jī)酸，使得pH下降；當(dāng)菌體生長到一定數(shù)量，有機(jī)酸的利用速率加快，pH升高[30]。iturin A產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢，在第5天時(shí)，iturin A產(chǎn)量達(dá)到最大，為4.76 g/L，后期iturin A產(chǎn)量降低可能是由于營養(yǎng)成分不足，菌體利用菌體產(chǎn)生的次級(jí)代謝物質(zhì)維持生命活動(dòng)所致[16]。甘油殘余量呈下降的趨勢，在第3～5天時(shí)消耗程度最大，分析原因可能是在此階段為了滿足菌體的生長發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成導(dǎo)致了甘油的大量消耗[22]。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間是5 d，在此條件下的iturin A產(chǎn)量居于較高的水平[31-36]。

3 結(jié)論

本研究采用平板對(duì)峙及高效液相色譜法篩選獲得一株高產(chǎn)iturin A的菌株，編號(hào)為ND，經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。菌株ND產(chǎn)iturinA的最佳培養(yǎng)基成分為豆粕粉120 g/L、酵母浸粉16 g/L、L-谷氨酸鈉1 g/L、甘油70 mL/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L，其余微量元素不變（FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、MnSO4·H2O 5 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L）；最佳培養(yǎng)條件為裝液量12%、初始pH值8、接種量10%、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間5 d。在最優(yōu)條件下，菌株ND的iturin A產(chǎn)量為4.76 g/L，是優(yōu)化前（0.35 g/L）的13.6倍。