酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶研究進(jìn)展

潘 超，高慶超，梁 穎，3，張志勇，3，李亞輝，3*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

香氣是評(píng)價(jià)葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。萜烯類(lèi)化合物，尤其是單萜烯，是構(gòu)成不同品種葡萄典型香氣的重要化合物[2]。葡萄酒中的萜烯類(lèi)化合物大多以糖苷的形式存在，降解之后可釋放出揮發(fā)性香氣物質(zhì)，因此糖苷被稱為香氣前體物[3]。糖苷的降解主要通過(guò)酸解或酶解實(shí)現(xiàn)，實(shí)際生產(chǎn)中一般采用酶解的方法來(lái)降解糖苷[4]。

糖苷酶是降解糖苷物質(zhì)的主要酶類(lèi)，對(duì)葡萄酒香氣的改善具有十分重要的作用[1]。糖苷酶廣泛存在于各種微生物中，在葡萄酒發(fā)酵中，酵母菌的糖苷酶含量少、活性低，因此大部分糖苷仍留在葡萄酒中[5]。研究表明，酒類(lèi)酒球菌（Oenococcus oeni）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和片球菌（Pediococcus claussen）等乳酸菌都具有較高的糖苷酶活性[6]。雙糖苷首先在α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶或β-D-芹菜糖苷酶作用下產(chǎn)生單糖苷，然后單糖苷在β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）EC 3.2.1.21作用下降解產(chǎn)生香氣物質(zhì)和葡萄糖；而單糖苷直接在β-葡萄糖苷酶作用下降解釋放出香氣物質(zhì)和葡萄糖[7-8]。因此β-葡萄糖苷酶是降解糖苷產(chǎn)生香氣物質(zhì)的關(guān)鍵酶[9-11]。

葡萄酒釀造主要包括由酵母菌完成的乙醇發(fā)酵和由乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）完成的蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）[12-13]。蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵是葡萄酒釀造中繼乙醇發(fā)酵后重要的二次發(fā)酵，在葡萄酒釀造中具有降低酸度、提高生物穩(wěn)定性和增加葡萄酒香氣、改善葡萄酒風(fēng)味等作用，是葡萄酒生產(chǎn)中的重要步驟[1，14]。酒類(lèi)酒球菌是蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵的主要啟動(dòng)者和執(zhí)行者[3]。

酒類(lèi)酒球菌是葡萄酒釀造中的重要乳酸菌，β-葡萄糖苷酶是結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)糖苷降解的關(guān)鍵酶，由于兩者在葡萄酒釀造中的重要作用，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)酒類(lèi)酒球菌的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了研究。國(guó)外許多研究機(jī)構(gòu)致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物學(xué)研究，從基礎(chǔ)領(lǐng)域研究酶的催化機(jī)制及表達(dá)調(diào)控機(jī)制[15-17]；國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)β-葡萄糖苷酶的研究逐漸成為熱點(diǎn)，已由過(guò)去的研究β-葡萄糖苷酶的簡(jiǎn)單提取到現(xiàn)在的酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化以及粗酶液的純化，β-葡萄糖苷酶基因的克隆表達(dá)也已得到實(shí)現(xiàn)[18]。

本文簡(jiǎn)單介紹了β-葡萄糖苷酶的定義、分類(lèi)、作用機(jī)制和測(cè)定方法，闡述了酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活，探討了pH值、發(fā)酵溫度、乙醇濃度、糖含量和二氧化硫含量對(duì)酶活的影響，并在分子生物學(xué)水平上研究了酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶基因，并對(duì)酒類(lèi)酒球菌葡萄糖苷酶未來(lái)的研究熱點(diǎn)和研究方向進(jìn)行了展望。

1 β-葡萄糖苷酶

1.1 β-葡萄糖苷酶定義和分類(lèi)

糖苷酶是自然界中最豐富的酶類(lèi)之一，糖苷酶是一類(lèi)以內(nèi)切或外切方式水解各種含糖化合物中的糖苷鍵生成單糖、寡糖或糖復(fù)合物的酶[15]。β-葡萄糖苷酶是一種重要的糖苷酶。1837年，LIEBIGH和WOHLER在苦杏仁中首次發(fā)現(xiàn)，因此又被稱為苦杏仁苷酶、龍膽二糖酶、纖維二糖酶和β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纖維素分解酶系中的重要組成成分，屬于纖維素酶類(lèi)，是能夠催化水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)配基的一種酶[15]。

在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（carbohydrate-active enzymes database，CAZy）中，β-葡萄糖苷酶被歸類(lèi)為糖苷水解酶家族[19-20]，其主要功能為降解糖苷鍵。依據(jù)氨基酸序列的同源性和結(jié)構(gòu)的相似性，已知的β-葡萄糖苷酶被分為GH1、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116等6個(gè)家族，微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶主要屬于GH1和GH3，真菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶主要屬于GH3家族[15]。

1.2 β-葡萄糖苷酶作用機(jī)制

葡萄與葡萄酒中的糖苷一般分為單糖苷和雙糖苷，極少見(jiàn)三糖苷[9]。單糖苷風(fēng)味前體物酶解，主要是在β-葡萄糖苷酶作用下，移除β-D-葡萄糖后釋放出具有揮發(fā)性香氣物質(zhì)[21]。雙糖苷的酶解可分為一步酶解法和兩步酶解法（見(jiàn)圖1）[22]。一步酶解法中，雙糖苷在β-葡萄糖苷酶作用下直接生產(chǎn)二糖和揮發(fā)性香氣物質(zhì)；兩步酶解法中，首先末端糖與β-D-葡萄糖之間的糖苷鍵在α-阿拉伯糖苷酶、β-洋芹糖苷酶或β-鼠李糖苷酶的作用下裂解，釋放出相應(yīng)的單糖和β-葡萄糖單糖苷，然后單糖苷再在β-葡萄糖苷酶作用下降解產(chǎn)生β-D-葡萄糖和揮發(fā)性香氣物質(zhì)。β-葡萄糖苷酶是糖苷水解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)香氣物質(zhì)的釋放起著重要作用。

圖1 雙糖苷酶解示意圖Fig.1 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis of diglycoside

1.3 β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定方法

測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活的方法主要有分光光度法、熒光法、京尼平苷顯色法和比色法等[23-24]。

分光光度法是以水楊苷作為底物，將水楊苷裂解為水楊醇和葡萄糖，然后利用分光光度計(jì)對(duì)水楊醇和葡萄糖進(jìn)行比色測(cè)定。此方法反應(yīng)容易遭受干擾，檢測(cè)的靈敏度也不是很高，因此不是目前測(cè)定葡萄糖苷酶的常用方法[25]。

熒光法是用4-甲基傘形酮葡萄糖苷作為底物，經(jīng)酶解后產(chǎn)生4-甲基傘形酮，通過(guò)測(cè)定酶解出的4-甲基傘形酮的熒光吸光度來(lái)計(jì)算酶的活性。該方法靈敏度高且速度快，但由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、重現(xiàn)性低，且成本昂貴，因此應(yīng)用較少[26]。

京尼平苷顯色法是對(duì)京尼平苷水解后產(chǎn)生的京尼平與氨基酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)色進(jìn)行測(cè)定的一種方法。此方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，但其靈敏度較低，且耗時(shí)比較長(zhǎng)[27-28]。

比色法是目前應(yīng)用最為普遍的方法，它以對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-glycosides，pNPG）為底物，底物水解后釋放出的對(duì)硝基苯酚在波長(zhǎng)400～420 nm可見(jiàn)光范圍內(nèi)有特征吸收峰，可直接進(jìn)行比色測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單、快速，靈敏度高，且重現(xiàn)性好。

2 酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活

蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵可以顯著提升葡萄酒的香氣特征，提高葡萄酒的品質(zhì)，酒類(lèi)酒球菌是進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵的主要微生物，多數(shù)研究結(jié)果顯示酒類(lèi)酒球菌具有糖苷酶活性[29]。GUILLOUX-BENATIER M等[30]首次在人工合成的培養(yǎng)基中檢測(cè)到了葡萄酒釀造乳酸菌（主要是酒類(lèi)酒球菌）的β-葡萄糖苷酶活性；VIVAS N等[31]研究發(fā)現(xiàn)酒類(lèi)酒球菌能夠從二甲花翠素-3-葡萄糖苷中釋放二甲花翠素，進(jìn)一步證明了酒類(lèi)酒球菌具有β-葡萄糖苷酶活性；MCMAHON H等[32]篩選了7株酒類(lèi)酒球菌商業(yè)菌株，在合成底物培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到β-葡萄糖苷酶活性，因此認(rèn)為培養(yǎng)基的組成可能是誘導(dǎo)葡萄糖苷酶活性的重要因素。GRIMALDI A等[33]用合成底物pNPG檢測(cè)了12株商業(yè)酒類(lèi)酒球菌的β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)11株酒類(lèi)酒球菌的完整細(xì)胞和上清液中均不同程度的存在β-葡萄糖苷酶活性，并且在不同生長(zhǎng)階段均存在酶活，此外，還檢測(cè)到了β-木糖苷酶活和α-阿拉伯糖苷酶活。GRIMALDI A等[34]還對(duì)其他22株商業(yè)酒類(lèi)酒球菌菌株進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均存在β-葡萄糖苷酶活，但不同菌株之間酶活存在一定差異。LóPEZ-SEIJAS J等[35]在研究的所有酒類(lèi)酒球菌中都檢測(cè)到了β-糖苷酶活，并表明有助于改善和提高區(qū)分阿爾巴尼奧葡萄酒的芳香成分。LI Y等[36]用合成底物和天然底物分別評(píng)價(jià)了酒類(lèi)酒球菌SD-2a和31MBR完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶活性，并對(duì)其部分特性進(jìn)行了研究。為更好地探明酒酒球菌SD-2a的增香能力，LI Y等[37]還分別測(cè)定了SD-2a不同部位和不同生長(zhǎng)時(shí)期的β-葡萄糖苷酶活，證明了酒類(lèi)酒球菌SD-2a潛在的增香潛力。SAGUIR F M等[38]研究表明，從阿根廷葡萄酒中分離出的大多數(shù)酒類(lèi)酒球菌在蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵初期都可以檢測(cè)到葡萄糖苷酶活性。MATURANO C等[39]研究了3株本地酒類(lèi)酒球菌菌株，發(fā)現(xiàn)均具有β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-鼠李糖吡喃糖苷酶活性；陳其玲等[40]從酒類(lèi)酒球菌自身耐酸能力的視角去分析評(píng)估菌株糖苷酶活性；FIA G等[41]采用熒光法測(cè)定了31株酒類(lèi)酒球菌的β-葡萄糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)在MRS培養(yǎng)液中β-葡萄糖苷酶在完整細(xì)胞和上清液中的活性水平和分布具有強(qiáng)的菌株依賴性。關(guān)于β-葡萄糖苷酶在酒類(lèi)酒球菌中的位置，MANSFIELD A K等[29]研究發(fā)現(xiàn)，酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞外酶；而PéREZ-MARTíN F等[42]研究發(fā)現(xiàn)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶；其他研究也發(fā)現(xiàn)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，且完整細(xì)胞也具有一定酶活[16，43-44]。這些研究表明了β-葡萄糖苷酶在酒類(lèi)酒球菌中普遍存在，主要為胞內(nèi)酶，酶活在不同菌株間有一定差異。

3 影響酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的因素

在蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵中影響酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的因素主要有pH值、發(fā)酵溫度、乙醇濃度、糖含量和SO2含量等。

3.1 pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適pH值為5.0。MESAS J M等[43]在MRS培養(yǎng)基中觀察不同pH下酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)最適pH值在5.0左右；楊芮等[45]在MRS培養(yǎng)基中研究了10株酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活性隨pH值變化，酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活呈鐘罩形曲線，大部分菌株在pH值5.0時(shí)酶活最高；王玲等[46]在酸性番茄培養(yǎng)基（acidic tomato broth，ATB）中研究了pH值對(duì)兩株酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活酶活影響，發(fā)現(xiàn)最適pH值也在5.0左右。β-葡萄糖苷酶分子上帶有許多酸性、堿性氨基酸殘基，pH值能影響這些氨基酸殘基的解離狀態(tài)，可能改變酶的空間結(jié)構(gòu)，或影響與底物的結(jié)合和進(jìn)一步催化反應(yīng)，進(jìn)而影響酶的活性。

3.2 溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適溫度為40.0～45.0 ℃。MICHLMAYR H等[16]在MRS培養(yǎng)基中通過(guò)改變溫度來(lái)觀察酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活性變化，發(fā)現(xiàn)在45 ℃時(shí)酶活最高；楊芮等[45]研究了溫度對(duì)5株酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活的影響，商業(yè)酒類(lèi)酒球菌OENO2的酶活在44.9 ℃達(dá)到最大，其他菌株酶活在32～39.3 ℃之間達(dá)到最大，菌株OENO2的酶活在溫度高于44.9 ℃后迅速降低，其他菌株酶活在49 ℃時(shí)幾乎為零；MESAS J M等[43]觀察到，酒類(lèi)酒球菌ST81的β-葡萄糖苷酶酶活在40 ℃時(shí)最高，在20～40 ℃范圍內(nèi)酶活隨著溫度升高而升高，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，酶活隨著溫度升高而降低。人們也對(duì)蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵中酒類(lèi)酒球菌的β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株酶活不同，酶活最適溫度也因菌株不同而具有一定差異[45]。

3.3 乙醇濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～16%。FIAG等[41]在MRS培養(yǎng)基中研究了乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活有促進(jìn)作用，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)8%時(shí)，乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶具有抑制作用；LI Y等[36]研究了乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌SD-2a和31MBR完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活的影響，結(jié)果表明，SD-2a在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0～16%時(shí)具有較高酶活，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為24%時(shí)仍具有一定酶活，而菌株31MBR在乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%～24%時(shí)表現(xiàn)出較高酶活，在20%時(shí)活性最高，且體積分?jǐn)?shù)16%～20%的乙醇對(duì)菌株31MBR完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活具有一定的促進(jìn)作用，這可能是完整細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的保護(hù)作用引起的；DIEZ-OZAETA I等[47]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響較小，而體積分?jǐn)?shù)12%～14%的乙醇使酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活顯著下降。以上研究結(jié)果表明，不同濃度乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活具有不同影響，低濃度乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活具有促進(jìn)作用，高濃度乙醇則表現(xiàn)出抑制作用。低濃度乙醇的促進(jìn)作用可能是因?yàn)橐掖寄軌蚋淖兗?xì)胞膜的通透性，從而更容易獲得細(xì)胞內(nèi)的酶和底物，高濃度乙醇的抑制作用可能是因?yàn)橐掖际姑傅鞍鬃冃裕瑥亩淖兠傅慕Y(jié)構(gòu)引起的。

3.4 糖含量對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

關(guān)于糖含量對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響，王玲等[46]研究發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度（0.1 g/L）葡萄糖對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響較小，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，菌株β-葡萄糖苷酶活迅速下降，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，酶活幾乎全部被抑制；楊芮等[45]研究了葡萄糖對(duì)10株酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響，結(jié)果表明，低濃度葡萄糖對(duì)酶活影響較小，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為7.5 g/L時(shí)一些菌株的酶活被顯著抑制，高濃度質(zhì)量葡萄糖（20 g/L）時(shí)大多數(shù)菌株的酶活都被強(qiáng)烈抑制。由此可見(jiàn)，糖含量對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響存在菌株間差異。葡萄糖對(duì)β-葡萄糖苷酶活的抑制為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，由于底物和抑制劑與酶的結(jié)合位點(diǎn)不同，酶可以同時(shí)與抑制劑和底物結(jié)合，這種結(jié)合引起糖苷酶分子構(gòu)象變化，進(jìn)而抑制酶活。

3.5 二氧化硫含量對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

目前關(guān)于pH值、溫度、糖和乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響已有較多研究，而二氧化硫?qū)祁?lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響的報(bào)道目前還較少。MATURANO C等[39]研究了二氧化硫?qū)祁?lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響，結(jié)果表明，在pH3.8條件下，80 mg/L二氧化硫?qū)祁?lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活沒(méi)有影響；FIA G等[41]研究發(fā)現(xiàn)，增加游離二氧化硫質(zhì)量濃度（0.2～0.6 mg/L），可使細(xì)菌生長(zhǎng)和蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵減慢，對(duì)β-葡萄糖苷酶活也有一定抑制作用。這是因?yàn)榉肿佣趸蚩纱┻^(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜，通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而抑制β-葡萄糖苷酶活。

3.6 各因素協(xié)同作用對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響

通常情況下，不同因素間對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活的影響還存在一定的協(xié)同作用。FIA G等[41]研究表明，在pH 3.4的葡萄酒中進(jìn)行蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵，乙醇和二氧化硫表現(xiàn)出了協(xié)同抑制作用，這是導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶活下降的根本原因；DIEZ-OZAETA I等[47]研究了pH和乙醇組合對(duì)β-葡萄糖苷酶活的影響，結(jié)果表明，pH和乙醇對(duì)酶活具有協(xié)同抑制效應(yīng)，在一定乙醇濃度下，降低pH會(huì)導(dǎo)致酶活顯著下降。

4 酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶分子生物學(xué)研究

目前國(guó)內(nèi)外主要利用基因工程和蛋白質(zhì)工程來(lái)獲取高活性的β-葡萄糖苷酶。國(guó)內(nèi)對(duì)β-葡萄糖苷酶的研究起步較晚，從酶的提取、分離、純化，已逐漸發(fā)展到對(duì)酶基因的研究，而國(guó)外對(duì)β-葡萄糖苷酶分子方面的研究已有較多報(bào)道。到目前為止，已有上百種不同來(lái)源（如動(dòng)物、植物、微生物）的β-葡萄糖苷酶基因被成功克隆和測(cè)序[48]。酒類(lèi)酒球菌PSU-1作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，其全基因組已被測(cè)序，其中也包括β-葡萄糖苷酶基因的信息[49]。通過(guò)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中查找分析得到酒類(lèi)酒球菌PSU-1共含有5個(gè)不同的β-葡萄糖苷酶基因，分別為OEOE_RS07570、OEOE_RS05830、OEOE_RS01060、OEOE_RS01630、EOE_RS01635，其中OEOE_RS07570編碼β-葡萄糖苷酶，其余4個(gè)基因編碼6-磷酸（P）-β-葡萄糖苷酶。關(guān)于酒類(lèi)酒球菌這些葡萄糖苷酶基因目前已有較多研究。

APALDO A等[17]對(duì)葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060、OEOE_RS01630和OEOE_RS01635進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并對(duì)其酶活性進(jìn)行了測(cè)定。楊世玲等[50]從酒類(lèi)酒球菌中成功克隆出了β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白疏水性較弱，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，屬于糖苷水解酶GH3。

楊世玲等[51]還對(duì)酒類(lèi)酒球菌的6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進(jìn)行了克隆、測(cè)序，生物信息學(xué)分析顯示其編碼的蛋白質(zhì)為可溶性酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，屬于糖苷酶GH1。LI Y等[36]對(duì)酒類(lèi)酒球菌SD-2a和31MBR的β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570進(jìn)行了克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，兩株菌株的β-葡萄糖苷酶基因高度同源（＞99%），為胞內(nèi)酶、主要存在細(xì)胞質(zhì)中。陳其玲等[40]對(duì)脅迫突變酒類(lèi)酒球菌菌株的6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示，大部分菌株的糖苷酶基因沒(méi)有發(fā)生變化。SPANO G等[52]對(duì)6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進(jìn)行了表達(dá)量分析，結(jié)果證實(shí)了溫度和乙醇脅迫對(duì)酒類(lèi)酒球菌葡萄糖苷酶活具有一定的抑制作用。WANG J F等[53]對(duì)酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570和6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進(jìn)行了表達(dá)量分析，結(jié)果表明，這兩個(gè)基因的高表達(dá)量導(dǎo)致了酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶活的升高。LI Y等[37]對(duì)酒類(lèi)酒球菌不同葡萄糖苷酶基因OEOE_RS05830、OEOE_RS07570和OEOE_RS01060的表達(dá)量進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)比酶活和不同基因表達(dá)水平，推測(cè)基因OEOE_RS01060和OEOE_RS05830可能與酒類(lèi)酒球菌完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶活相關(guān)，OEOE_RS07570與菌體破碎液的β-葡萄糖苷酶活相關(guān)。李亞輝[18]同時(shí)對(duì)酒類(lèi)酒球菌中的5個(gè)糖苷酶基因（OEOE_RS07570、OEOE_RS05830、OEOE_RS01060、OEOE_RS01630、EOE_RS01635）進(jìn)行了克隆和表達(dá)量分析，從分子水平上驗(yàn)證了“碳代謝抑制”理論，并從一定程度上揭示了基因OEOE_RS01060編碼的6-P-β-葡萄糖苷酶是酒類(lèi)酒球菌完整細(xì)胞具有β-葡萄糖苷酶活的原因。ZHANG J等[54]對(duì)酒類(lèi)酒球菌中不同葡萄糖苷酶基因進(jìn)行了同源性分析，并對(duì)基因OEOE_RS01060進(jìn)行了克隆。MICHLMAYRH等[55]在大腸桿菌中成功表達(dá)了酒類(lèi)酒球菌中的基因OEOE_RS07570，并對(duì)其活性進(jìn)行了研究。由此可見(jiàn)，目前對(duì)酒類(lèi)酒球菌葡萄糖苷酶基因的研究主要集中在OEOE_RS07570和OEOE_RS01060上，而對(duì)其他三個(gè)基因的研究還較少。6-P-β-葡萄糖苷酶的存在及其基因可以很好地解釋酒類(lèi)酒球菌細(xì)菌完整細(xì)胞具有β-葡萄糖苷酶活性的原因，但目前對(duì)其研究還較少。

葡萄糖苷酶中6-P-β-葡萄糖苷酶是細(xì)菌磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvatephospho transferase system，PEP-PTS）中的重要組成部分，其只降解磷酸化的葡萄糖苷，對(duì)非磷酸化的底物不起作用[56]。細(xì)菌完整細(xì)胞通過(guò)PEP-PTS系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)酶將底物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，并在磷酸化酶作用下將其磷酸化，然后在胞內(nèi)6-磷酸-β-葡萄糖苷酶作用下將其降解釋放出葡萄糖糖基和相對(duì)應(yīng)配體[57]。該機(jī)制首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已證明也存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌中，PEP-PTS是碳水化合物輸入的重要機(jī)制，在乳酸菌碳水化合物分解代謝中也是一個(gè)常見(jiàn)機(jī)制，但關(guān)于乳酸菌PEP-PTS中糖苷酶活性的信息還很有限。關(guān)于酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶，目前大多數(shù)研究只關(guān)注了其胞內(nèi)、胞外或是分離純化后的酶活，而對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義的完整細(xì)胞的酶活則關(guān)注的較少[26，39-42，58]。6-磷酸-β-葡萄糖苷酶及其基因可以很好地解釋為什么酒類(lèi)酒球菌細(xì)菌完整細(xì)胞具有β-葡萄糖苷酶活性，而目前對(duì)其研究還較少。

6 總結(jié)及展望

研究酒類(lèi)酒球菌β-葡萄糖苷酶對(duì)提升葡萄酒整體品質(zhì)具有重要意義。糖苷在酒類(lèi)酒球菌細(xì)胞內(nèi)的代謝是一個(gè)復(fù)雜的體系，涉及多種酶的參與，并且機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。目前關(guān)于酒類(lèi)酒球菌和酒類(lèi)酒球菌糖苷酶的研究非常有限。對(duì)酒類(lèi)酒球菌糖苷酶的研究主要集中在β-葡萄糖苷酶的活性，以及提取、分離和純化，而對(duì)酒類(lèi)酒球菌6-P-β-葡萄糖苷酶的研究還較少，而6-P-β-葡萄糖苷酶是糖代謝途徑磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，也是酒類(lèi)酒球菌完整細(xì)胞具有β-葡萄糖苷酶活的重要原因。因此，對(duì)酒類(lèi)酒球菌6-P-β-葡萄糖苷酶的酶活、提取、分離、純化，以及從分子水平上探明其誘導(dǎo)機(jī)制和表達(dá)過(guò)程將會(huì)是未來(lái)研究的重點(diǎn)和主要內(nèi)容。