吡非尼酮通過(guò)抑制TGF-β1 通路和炎癥反應(yīng)預(yù)防大鼠尿道損傷后的纖維化及狹窄

尿道狹窄是泌尿外科常見(jiàn)的男性尿道疾病，作為最大的發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)尿道狹窄的發(fā)生率顯著高于其他國(guó)家，且由于該病具有高復(fù)發(fā)率特點(diǎn)，反復(fù)多次手術(shù)顯著增加了患者的身心以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尿道狹窄的病因包括外傷性、醫(yī)源性以及慢性炎癥等。其中，創(chuàng)傷是最常見(jiàn)的因素，部位以球部尿道居多，約占50%以上。近年來(lái)，隨著尿道本身和經(jīng)尿道手術(shù)方式的廣泛應(yīng)用，醫(yī)源性損傷導(dǎo)致的尿道狹窄患者數(shù)量顯著增加。然而，任何部位的尿道狹窄，無(wú)論其致傷原因或損傷程度如何，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，均可能伴隨纖維化過(guò)程，導(dǎo)致瘢痕形成，最終發(fā)生尿道狹窄。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直探索如何減少損傷后尿道狹窄的方法，不斷改進(jìn)手術(shù)方式，但仍未有效降低術(shù)后狹窄的發(fā)生率。如何減少尿道狹窄的發(fā)生率及狹窄程度已成為下尿路重建領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。吡非尼酮是目前獲批用于特發(fā)性肺纖維化治療的廣譜抗纖維化小分子藥物，但是否能夠緩解尿道狹窄的發(fā)生尚不清楚，鑒于過(guò)度纖維化導(dǎo)致瘢痕狹窄的理論基礎(chǔ)，本研究探討吡非尼酮對(duì)于大鼠尿道損傷后狹窄形成的預(yù)防作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買SD雄性大鼠30 只，8～10 周齡，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)室溫20～24 ℃，12 h晝夜交替，自由飲食。飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組（10只/組）。陰性對(duì)照組：大鼠不予尿道損傷處理，腹腔注射與吡非尼酮組等量的溶劑；陽(yáng)性對(duì)照組：大鼠尿道損傷，腹腔注射與吡非尼酮組等量的溶劑；吡非尼酮組：建立大鼠尿道損傷模型后，按100 mg·kg·d腹腔注射吡非尼酮。記錄所有大鼠生活狀態(tài)和體質(zhì)量變化，尿道損傷模型建立當(dāng)日記為第0天，術(shù)后第14天行逆行尿道造影、留取尿道損傷組織并處死大鼠。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例，通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批（倫動(dòng)科批字[2021]第070號(hào)）。

1.2 尿道損傷模型的建立

10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于操作臺(tái)，剔除尿道周圍皮膚毛發(fā)，顯露尿道外口，碘伏局部消毒。組織剪自尿道外口向根部將陰莖包皮在腹側(cè)縱行剪開(kāi)，輕輕提起陰莖，分離包皮及周圍組織。用24G靜脈留置針去除針芯后經(jīng)尿道外口置入尿道，在留置針引導(dǎo)下用刀片縱行切開(kāi)后尿道海綿體及尿道，長(zhǎng)約0.5 cm。4-0可吸收線縫合尿道海綿體及皮膚組織。

1.3 逆行尿道造影

大鼠麻醉成功后，固定于數(shù)字胃腸機(jī)檢查床上。實(shí)驗(yàn)人員穿好防護(hù)服，經(jīng)尿道外口將24G去針芯靜脈留置針置于前尿道。在X線實(shí)時(shí)觀察下一手固定尿道和留置針管，一手經(jīng)留置針管向膀胱內(nèi)緩慢推入造影劑碘伏醇注射液，當(dāng)尿道和膀胱顯影后X線攝片，通過(guò)顯影觀察整個(gè)尿道腔的狹窄情況。

1.4 組織病理學(xué)染色及評(píng)分

手術(shù)后第14天逆行尿道造影結(jié)束后通過(guò)過(guò)量麻醉處死大鼠，迅速用組織剪剪開(kāi)陰莖包皮，剝離尿道周圍組織，找到并切除損傷尿道組織，陰性對(duì)照組直接剪取正常后尿道組織。多聚甲醛固定尿道組織、石蠟包埋、切片。H&E染色觀察組織形態(tài)，Masson染色檢測(cè)膠原纖維數(shù)量，免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)組織a-SMA 和TGF-β1 的蛋白表達(dá)。Masson 染色采 用Image J 軟件進(jìn)行半定量分析藍(lán)染區(qū)域占比；western blot結(jié)果根據(jù)條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科人員進(jìn)行半定量分析，評(píng)分根據(jù)5個(gè)不同部位高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比：＜5%為0分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡譃閮烧呦喑怂?，為0～12分。

當(dāng)時(shí)，灌著石油的內(nèi)燃機(jī)在戰(zhàn)爭(zhēng)中又開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，空中打擊戰(zhàn)。1914年第一次世界大戰(zhàn)爆發(fā)時(shí)，航空工業(yè)初見(jiàn)雛形，僅有1000人；而5個(gè)月后的1915年1月，英國(guó)也才制造出250架飛機(jī)，其中60架還屬試產(chǎn)機(jī)型。為了迎合戰(zhàn)爭(zhēng)需要，飛機(jī)立即被應(yīng)用于軍事領(lǐng)域。

為探討吡非尼酮抑制尿道損傷后狹窄形成的可能機(jī)制，分別通過(guò)免疫組織化學(xué)染色（圖6A～D）和Western blot檢測(cè)（圖6E、G）與纖維化密切相關(guān)的TGF-β1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吡非尼酮組尿道周圍組織中TGF-β1表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組（＜0.05，＜0.01），吡非尼酮可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)抑制組織纖維化過(guò)程。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)組織TNF-α、IL-6、IL-1β的基因表達(dá)

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間計(jì)量資料采用檢驗(yàn)比較，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了驗(yàn)證吡非尼酮對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNF-a、IL-6、IL-1β 的mRNA表達(dá)量（圖7）。結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照組尿道組織炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)顯著增高（＜0.01），而吡非尼酮組的表達(dá)量顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（＜0.05），與陰性對(duì)照組無(wú)顯著不同。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用TRIzol提取陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和吡非尼酮組尿道海綿體組織的總RNA，以各組總RNA為模板，用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，利用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒在反應(yīng)體系（20 μL）下進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)樣品以GAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2）法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。

體育小鎮(zhèn)投資門檻較高，對(duì)于一般企業(yè)來(lái)說(shuō)沒(méi)有相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)能力來(lái)承擔(dān)建設(shè)費(fèi)用，所以小鎮(zhèn)的投資者多為產(chǎn)業(yè)龍頭企業(yè)，如萬(wàn)科建造的冰雪小鎮(zhèn)、恒大建造的足球小鎮(zhèn)等。面對(duì)這樣的市場(chǎng)環(huán)境狀況，培育多元市場(chǎng)主體、優(yōu)化資源配置是在全國(guó)范圍內(nèi)建造體育小鎮(zhèn)的關(guān)鍵所在。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后情況

術(shù)后14 d通過(guò)逆行尿道造影和H&E染色觀察3組大鼠尿道狹窄程度。結(jié)果顯示，所有存活大鼠均成功形成尿道狹窄。逆行尿道造影可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組尿道較陰性對(duì)照組正常尿道管腔明顯變細(xì)，吡非尼酮組大鼠尿道較陽(yáng)性對(duì)照組大鼠好轉(zhuǎn)（圖3）。HE染色進(jìn)一步證實(shí)陽(yáng)性對(duì)照組尿道上皮細(xì)胞增生明顯，管腔顯著狹窄，周圍組織炎性細(xì)胞增多，細(xì)胞排列紊亂。吡非尼酮組尿道管腔較對(duì)照組變大，伴輕度上皮細(xì)胞增生，管周組織僅見(jiàn)少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列尚規(guī)則（圖4）。

2.2 吡非尼酮對(duì)大鼠尿道損傷后狹窄形成的影響

陽(yáng)性對(duì)照組和吡非尼酮組大鼠均成功構(gòu)建尿道損傷模型，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠于術(shù)后第3天死亡1只，考慮尿道梗阻導(dǎo)致死亡，吡非尼酮組大鼠術(shù)后第7天死亡1只，考慮感染引起，其余大鼠均未死亡，術(shù)后14 d尿道外口皮膚切口已完全愈合（圖1）。陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異，吡非尼酮組大鼠術(shù)后體質(zhì)量增長(zhǎng)速度低于其他2組，尤其在術(shù)后10 d以后更加明顯（＜0.05，圖2）。

2.3 吡非尼酮對(duì)膠原表達(dá)的影響

尿道損傷后瘢痕狹窄是常見(jiàn)的尿道疾病，但因術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，使其成為棘手的臨床問(wèn)題。如何減少術(shù)后組織纖維化是預(yù)防狹窄的關(guān)鍵性問(wèn)題。近年來(lái)，藥物應(yīng)用在預(yù)防尿道狹窄方面的探索逐漸增加。許寧等通過(guò)從尿道疤痕組織中提取成纖維細(xì)胞探討法舒地爾對(duì)瘢痕形成的影響和機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)法舒地爾通過(guò)Rho/ROCK通路抑制成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原蛋白合成功能，從而減少尿道損傷后狹窄的發(fā)生。mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白表達(dá)，作用可能與mTORC1/4E-BP1 和TGF-β/Smad 信號(hào)通路相關(guān)。Sangkum等通過(guò)TGF-β1注射誘導(dǎo)的尿道纖維化模型發(fā)現(xiàn)局部注射脂肪組織衍生干細(xì)胞（ADSCs）的尿道纖維化大鼠尿道組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)明顯減少，表明局部注射ADSC有可能成為預(yù)防尿道疤痕形成及提高尿道狹窄治療成功率的輔助治療手段。除此之外，劉曉鶴及其團(tuán)隊(duì)初步證明A型肉毒桿菌毒素（BTX-A)對(duì)預(yù)防兔前尿道急性熱損傷后的狹窄有顯著效果，以上研究為臨床藥物預(yù)防和治療尿道狹窄提供了依據(jù)。本研究探討了抗纖維化藥物吡非尼酮對(duì)尿道損傷后狹窄形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡非尼酮可有效抑制尿道損傷后的纖維化，可能成為預(yù)防尿道狹窄的選擇藥物。

2.4 吡非尼酮對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響

1、灌溉渠道監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：江華水庫(kù)周邊為林地分布，溝渠分布較少，灌區(qū)的寧遠(yuǎn)縣內(nèi)耕地分布較多的地方溝渠分布較多，道縣、江永的耕地區(qū)有部分溝渠分布。由于擴(kuò)建后監(jiān)測(cè)采用的影像為2017年度9-11月，灌區(qū)的渠道建設(shè)工程到監(jiān)測(cè)時(shí)間還未全部完成，本監(jiān)測(cè)僅提取了影像上可明顯識(shí)別的灌溉渠道進(jìn)行分析。根據(jù)灌區(qū)規(guī)劃數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，工程將新建干渠以上渠道240公里、支渠170公里，擴(kuò)建后的灌區(qū)將成為湖南省最大的灌區(qū)，擴(kuò)建最大的效益就是灌溉效益。

2.5 吡非尼酮對(duì)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子表達(dá)的影響

在MLAA-22酶切位點(diǎn)分析結(jié)果提示：MLAA-22存在大量的Proteinase K的酶切位點(diǎn)，蛋白激酶催化蛋白質(zhì)磷酸化從而改變其活性，蛋白激酶是細(xì)胞信號(hào)通道中起化學(xué)修飾作用的成員，參與多種細(xì)胞功能諸如

3 討論

在各組尿道組織H&E染色觀察組織形態(tài)（圖5A～C）基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)Masson染色觀察尿道周圍組織膠原纖維數(shù)量（圖5D～F、J）以及通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織中a-SMA的表達(dá)（圖5G～I(xiàn)、K）。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠尿道海綿體組織內(nèi)可見(jiàn)明顯藍(lán)染的膠原纖維增生，而吡非尼酮組膠原纖維含量較少，膠原排列較陽(yáng)性對(duì)照組更加規(guī)則有序。同時(shí)，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照組a-SMA表達(dá)顯著高于陰性對(duì)照組和吡非尼酮組（＜0.05，＜0.01）。除此之外，Western blot結(jié)果與免疫組化一致（圖6E～F）。

至今為止，尿道損傷狹窄模型的建立較為多樣但并無(wú)統(tǒng)一方法。陳琦等應(yīng)用F10小兒電切鏡配合2 mm環(huán)形電極于尿道5～7點(diǎn)處切除2 mm×3 mm的全層尿道建立犬尿道狹窄模型，術(shù)后1月所有動(dòng)物尿道損傷部位均顯示瘢痕組織形成。與此相似，國(guó)內(nèi)外專家應(yīng)用外科電刀和導(dǎo)絲制作電極電凝灼燒尿道建立損傷狹窄模型。另外，一些研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)尿道內(nèi)或尿道外植入并引爆自制爆炸裝置模擬尿道球部創(chuàng)傷后尿道狹窄模型。除此之外，可以通過(guò)簡(jiǎn)單切開(kāi)縫合尿道的方式模擬尿道損傷后狹窄。對(duì)于狹窄模型建立成功的鑒定，多采用尿道造影或彩超及尿道鏡等評(píng)估尿道內(nèi)徑，同時(shí)通過(guò)Masson及a-SMA染色等病理學(xué)檢測(cè)組織膠原沉積狀態(tài)。本研究基于尿道周圍海綿體纖維化是尿道狹窄形成的重要原因這一理論基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)中并未直接切開(kāi)尿道，而在靜脈留置針針管作為尿管引導(dǎo)下，縱行切開(kāi)并縫合尿道海綿體建立尿道狹窄，該方法可無(wú)需留置導(dǎo)尿管，減少操作，降低模型建立的難度，通過(guò)尿道造影和組織病理學(xué)證實(shí)該方法可建立損傷后狹窄，可作為有效的方法推廣應(yīng)用。

吡非尼酮是一種抗纖維化藥物，因可有效抑制肝和肺等組織纖維化，已被FDA批準(zhǔn)的用于治療特發(fā)性肺纖維化（IPF）。除可緩解肺纖維化外，研究表明吡非尼酮局部治療可有效減輕青光眼排水裝置植入后纖維化，近期研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮可顯著降低兔耳瘢痕增生指數(shù)，減少瘢痕高度，促進(jìn)膠原組織有序排列，表明可抑制瘢痕的形成。然而，吡非尼酮防治組織纖維化的機(jī)制并未明確。Jin等研究表明吡非尼酮主要通過(guò)抑制TGF-β1和CTHRC1緩解成纖維細(xì)胞活性，減少膠原沉積和肺纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮可抑制損傷后的炎癥反應(yīng)，從而抑制后續(xù)的纖維化過(guò)程。Medina等觀察吡非尼酮軟膏對(duì)深度燒傷小鼠創(chuàng)面炎癥反應(yīng)和纖維化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著減少創(chuàng)面愈合過(guò)程中性粒細(xì)胞數(shù)量及抑制相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，同時(shí)減少a-SMA表達(dá)。此外，研究顯示吡非尼酮也可抑制間質(zhì)性肺炎和IPF患者肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)。在本研究中，我們通過(guò)Masson染色和a-SMA檢測(cè)證明吡非尼酮可緩解尿道組織纖維化和膠原沉積，western blot發(fā)現(xiàn)吡非尼酮抑制損傷組織a-SMA和TGF-β1表達(dá)，同時(shí)qRT-PCR 檢測(cè)了吡非尼酮能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)。這些結(jié)果為吡非尼酮在預(yù)防尿道損傷后狹窄及作用機(jī)制的研究提供了依據(jù)。

目前研究尚未明確吡非尼酮抑制纖維化的具體分子機(jī)制，但大多認(rèn)為TGF-β1可能是吡非尼酮作用的關(guān)鍵分子，而TGF-β1已被證實(shí)是組織纖維化重要的驅(qū)動(dòng)因子，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，后者能夠分泌a-SMA，參與細(xì)胞外基質(zhì)的收縮與重塑，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡非尼酮抑制了組織TGF-β1表達(dá)，這可能是抑制纖維化的潛在機(jī)制之一。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮組大鼠尿道組織炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說(shuō)明吡非尼酮可緩解炎癥反應(yīng)，這也可能參與了纖維化抑制作用。本研究尚存在一些不足，在應(yīng)用吡非尼酮的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)于大鼠體質(zhì)量存在影響，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究明確。同時(shí)，本研究并未檢測(cè)吡非尼酮對(duì)于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行深入探討。

3)L=7 m時(shí)，射流到達(dá)工作面端頭發(fā)生偏轉(zhuǎn)時(shí)的速度較小，渦流強(qiáng)度較小，渦流區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，但是其核心區(qū)域卻在減小，回旋風(fēng)量較大偏轉(zhuǎn)角度也進(jìn)一步擴(kuò)大，回風(fēng)流緩慢向風(fēng)筒側(cè)巷壁運(yùn)移。

綜上所述，本研究首次證實(shí)吡非尼酮對(duì)尿道損傷后纖維化及狹窄的預(yù)防作用，并闡述可能與吡非尼酮抑制TGF-β1通路和炎癥反應(yīng)相關(guān)，結(jié)果提示吡非尼酮可能成為預(yù)防尿道狹窄新的藥物選擇，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義。