甲醛對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)的影響

高文婷,姜雪霞,譚 清,劉希沖,李明虹,李星道,郭戍辰,白劍英

(山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:jybai66@aliyun.com)

甲醛(formaldehyde,FA)是一種無(wú)色、有強(qiáng)烈刺激性氣味的醛類(lèi)化合物,易溶于水及多種有機(jī)溶劑。甲醛性質(zhì)不穩(wěn)定,可通過(guò)與蛋白質(zhì)、核酸和不飽和脂肪酸等生物大分子結(jié)合產(chǎn)生毒性作用[1]。甲醛廣泛應(yīng)用于建筑絕緣材料、木材、膠合板[2],因此是室內(nèi)常見(jiàn)污染物。此外由日漸發(fā)達(dá)的交通運(yùn)輸引發(fā)的光化學(xué)煙霧中也有一定的甲醛生成。這些均導(dǎo)致人群經(jīng)呼吸道的甲醛暴露非常普遍。某些食品中甲醛的違規(guī)添加還可導(dǎo)致人群的消化道接觸。甲醛進(jìn)入機(jī)體后需在肝臟進(jìn)行代謝解毒。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明低濃度短時(shí)間的甲醛單獨(dú)暴露對(duì)ICR小鼠具有肝臟毒性[3]。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示甲醛暴露會(huì)干擾肝細(xì)胞甘油三酯和膽固醇代謝平衡[4,5]。甘油三酯性質(zhì)穩(wěn)定,不會(huì)直接對(duì)肝細(xì)胞造成損傷,而膽固醇有直接的肝細(xì)胞毒性[6]。肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝的主要場(chǎng)所,在肝臟內(nèi)膽固醇可轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外,肝臟也可直接將膽固醇排入腸內(nèi)隨腸道排出體外。據(jù)報(bào)道甲醛可使肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成增加,使肝細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量增加[5]。異常的膽固醇水平可對(duì)肝細(xì)胞造成直接損傷。甲醛染毒后肝細(xì)胞內(nèi)增加的膽固醇是會(huì)排出細(xì)胞,還是以膽固醇的形式積聚在細(xì)胞內(nèi)。甲醛造成肝臟損傷的機(jī)制仍然不清楚,是否可以猜想甲醛通過(guò)影響肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)量膽固醇的排出而造成肝損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察甲醛染毒后HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)水平的變化,了解甲醛是否會(huì)影響肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排,探討甲醛引起肝臟損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所干細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要儀器

Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司),Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad公司),UV-2450型紫外分光光度儀(上海納锘儀器有限公司),line gene 9600型熒光定量PCR儀(杭州BIOER科技有限公司),HFsafe-1200型生物安全柜(Heal Force公司)。

1.3 主要試劑

甲醛染毒液的配制:9.5 μl甲醛原液加入到10 ml培養(yǎng)基中,得到濃度為12.5 mmol/L的甲醛溶液,按梯度稀釋的方法配制所需濃度的染毒液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基中,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測(cè)甲醛染毒HepG2細(xì)胞的活性

分別以濃度0.02,0.10,0.50 mmol/L FA溶液為處理劑,陰性對(duì)照為完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組為0.50 μg/ml布雷德菌素A(Brefeldin A,BFA)以及1 mmol/L油酸(oleic acid,OA)處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h。染毒結(jié)束后,吸去培養(yǎng)基,加入10 μl MTT染液及90 μl新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去培養(yǎng)基,加入100 μl二甲基亞砜溶解液,搖床振蕩10 min,在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 HepG2細(xì)胞膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

分別以濃度0.05,0.10,0.20 mmol/L FA為處理劑,陰性對(duì)照為完全培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組為0.50 μg/ml BFA以及1 mmol/L OA處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h。采用qRT-PCR法測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G5(ATP-binding cassette transporter G5,ABCG5)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G8(ATP-binding cassette transporter G8,ABCG8)mRNA的表達(dá)水平。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用UV-2450紫外分光光度儀檢測(cè)RNA的純度。用兩步反轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行cDNA的合成。基因引物序列見(jiàn)表1,β-actin為內(nèi)參。兩步法PCR擴(kuò)增程序,第一步,預(yù)變性,95 ℃,30 s循環(huán)1次。第二步,變性95 ℃,10 s,退火延伸60 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 膽固醇外排相關(guān)基因序列

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)甲醛染毒HepG2細(xì)胞的活性

與陰性對(duì)照相比,0.02 mmol/L FA和0.10 mmol/L FA染毒24,48 h未觀察到細(xì)胞活性的明顯降低(P>0.05);0.50 mmol/L FA染毒24,48 h均可明顯降低HepG2細(xì)胞活性(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均可降低HepG2細(xì)胞活性(P<0.05);1.00 mmol/L OA對(duì)HepG2細(xì)胞活性未產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05,見(jiàn)表2)。

表2 不同濃度FA對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響

2.2 FA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因ABCA1和ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

FA染毒HepG2細(xì)胞24,48 h,膽固醇外排相關(guān)基因ABCA1 mRNA、ABCG1 mRNA表達(dá)水平結(jié)果見(jiàn)表3。與陰性對(duì)照相比,0.20 mmol/L FA染毒24,48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

與陰性對(duì)照相比,0.05,0.10,0.20 mmol/L FA染毒24 h均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.20 mmol/L FA染毒48 h使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);1.00 mmol/L OA染毒48 h使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

表3 FA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 FA對(duì)HepG2內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)水平的影響

FA染毒HepG2細(xì)胞24,48 h,膽固醇外排相關(guān)基因ABCG5 mRNA、ABCG8 mRNA的表達(dá)水平結(jié)果見(jiàn)表4。與陰性對(duì)照相比,0.20 mmol/L FA染毒24,48 h均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);1.00 mmol/L OA染毒48 h使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

與陰性對(duì)照相比,0.20 mmol/L FA染毒24 h可使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.10,0.20 mmol/L FA染毒48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

表4 甲醛對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

甲醛是一種廣泛存在的環(huán)境污染物,具有刺激作用、致畸作用、致敏作用,與白血病、鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān),被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類(lèi)致癌物[7]。膽固醇是細(xì)胞膜的重要組成部分,脊椎動(dòng)物的所有真核細(xì)胞都可以合成膽固醇。為了維持膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài),細(xì)胞通過(guò)重新合成或攝取脂蛋白而獲得的膽固醇量必須與通過(guò)降解或排泄而損失的膽固醇量相平衡。膽固醇通過(guò)ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette transporter,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中排出,分別是ABCG5/ABCG8和ABCA1/ABCG1[8]。ABCG5、ABCG8和ABCA1、ABCG1這4種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞、腸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有表達(dá),可以調(diào)控膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝的主要場(chǎng)所,膽固醇代謝紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),如非酒精性脂肪性肝炎[9]。HepG2細(xì)胞源于人肝臟胚胎瘤細(xì)胞,它保留了正常肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性,擁有較完整的代謝酶系[10],所以我們以HepG2細(xì)胞為模型,采用不同濃度的FA對(duì)其進(jìn)行染毒,觀察FA是否影響肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)水平。

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),甲醛對(duì)HepG2細(xì)胞活性存在抑制作用,隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞活性呈逐漸降低趨勢(shì)。0.50 mmol/L的甲醛對(duì)HepG2細(xì)胞具有直接的損傷效應(yīng),可引起細(xì)胞活性降低50%以上。由于高劑量組損傷作用過(guò)大,在接下來(lái)的甲醛慢性毒性作用的機(jī)制研究中,采用了較低的染毒劑量(0.05,0.10,0.20 mmol/L),即將高劑量組調(diào)整為0.20 mmol/L,該劑量約為我國(guó)現(xiàn)行生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中甲醛濃度的10倍[11]。

ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。ABCA1/ABCG1、ABCG5/ABCG8作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員,均包含標(biāo)志性ATP結(jié)合域,以ATP作為能量供應(yīng)體對(duì)各種物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)控靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄激活因子肝X受體α(LXRα)可通過(guò)激活A(yù)BC超家族中ABCA1/G1和ABCG5/G8等的表達(dá)調(diào)節(jié)糖脂代謝和維持膽固醇穩(wěn)態(tài),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過(guò)量膽固醇的排出[12]。降脂藥可通過(guò)使小鼠肝臟中的ABCA1/ABCG1的基因和蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)肝細(xì)胞中膽固醇的排出,從而緩解高脂血癥小鼠的肝臟中膽固醇等脂質(zhì)沉積[13]。邵波等[11]報(bào)道蛹蟲(chóng)草的主要活性成分蛹蟲(chóng)草多糖通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)-LXRα-ABCA1/ABCG1通路,促進(jìn)了體內(nèi)過(guò)量膽固醇經(jīng)肝細(xì)胞外排。在本實(shí)驗(yàn)中0.20 mmol/L FA染毒24 h和48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。染毒24 h,0.05,0.10,0.20 mmol/L FA均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);染毒48 h,0.20 mmol/L FA使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證明,甲醛染毒可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCA1/ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加,甲醛染毒后不會(huì)抑制肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)。

ABCG5/ABCG8異源二聚體是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族的兩個(gè)成員,是維持細(xì)胞膽固醇水平所必需的。ABCG5和ABCG8,當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí),是無(wú)功能的半轉(zhuǎn)運(yùn)體,它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中異二聚化形成異二聚體后獲得固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能。肝臟中ABCG5/ABCG8介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁的排泄[14]。研究表明在人正常肝細(xì)胞(HL 7702)中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)過(guò)表達(dá)可增加ABCG5/ABCG8的表達(dá),介導(dǎo)肝細(xì)胞中的膽固醇外排,從而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[15]。ABCG5和ABCG8在小鼠中的過(guò)度表達(dá)會(huì)使膽汁中的膽固醇水平增加5倍以上,從而降低小鼠肝臟中的膽固醇[16]。在本實(shí)驗(yàn)中,染毒24,48 h,0.20 mmol/L FA均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加。0.20 mmol/L FA染毒24 h和0.10,0.20 mmol/L FA染毒48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加。實(shí)驗(yàn)證明,甲醛染毒可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5/ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加,甲醛染毒后不會(huì)抑制肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述,高濃度甲醛可明顯抑制HepG2細(xì)胞的活性,對(duì)肝細(xì)胞有一定的損傷作用。甲醛未抑制膽固醇外排相關(guān)ABCA1 mRNA、ABCG1 mRNA、ABCG5 mRNA、ABCG8 mRNA的表達(dá),因此膽固醇外排減少不是甲醛引起肝臟損傷的原因。可能正是細(xì)胞內(nèi)升高的膽固醇水平誘導(dǎo)了外排相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排,以減輕其危害。有關(guān)甲醛引起肝細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇升高,以及甲醛對(duì)肝細(xì)胞的慢性損傷作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。