冷凍脫脂HPLC測(cè)定食用植物油中4種多環(huán)芳烴

潘曉玉，趙逸涵，王宗義，劉方征，高婧怡，趙修平，王雨萱，何世慧

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206 )

PAHs的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[9]等。其中HPLC、GC-MS較為普及，GC-MS/MS的選擇性則更優(yōu)。但無(wú)論何種檢測(cè)方法，就食用植物油而言，脫除油脂的干擾都是檢測(cè)PAHs的關(guān)鍵。固相萃取柱[10]、分子印跡色譜柱[11]和凝膠滲透色譜[12]等技術(shù)，都有較好的除脂效果，但成本相對(duì)高或依賴(lài)專(zhuān)用設(shè)備。冷凍除脂是一種成本低、操作簡(jiǎn)單的方法[13]，對(duì)簡(jiǎn)化食用植物油樣品處理，是較為實(shí)用的方法之一。該研究通過(guò)優(yōu)化冷凍除脂方法，結(jié)合HPLC分離和熒光檢測(cè)器(FLD)的高靈敏性，建立了食用植物油中PAH4的檢測(cè)新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和材料

LC-20AD 液相色譜儀、RF-10AXL 熒光檢測(cè)器(日本島津公司)；PAH專(zhuān)用色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó) Waters 公司)；5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；BCD-272WDGD 冰箱(中國(guó)海爾公司)；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；MS 3 basic 渦旋混勻器(德國(guó)IKA公司)；0.22 μm尼龍微孔濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取0.5 g (精確至 0.01 g)食用油樣品于50 mL離心管中，加入16 mL乙腈-水(15∶1)，2 000 r/min渦旋5 min，4 000 r/min 離心5 min，于冰箱中冷凍(-20 ℃)2 h，使下部油脂層凝固，迅速將乙腈提取液傾倒至雞心瓶中，下層油脂重復(fù)以上步驟，再次提取1次，合并提取液至雞心瓶中，40 ℃旋蒸至干，加入1 mL乙腈渦旋復(fù)溶，吸取復(fù)溶后溶液過(guò)0.22 μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將2 000 mg/L多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用二氯甲烷稀釋?zhuān)玫?00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋獲得1 mg/L的多環(huán)芳烴中間工作溶液，于棕色貯液瓶中-20 ℃貯藏(用前放置到室溫)。用乙腈稀釋中間工作溶液，得到1、5、10、20、50和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.2.3 儀器分析條件 色譜柱：Waters PAH C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：超純水(A)-乙腈(B)；流速1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序：0.01～5.00 min: A保持50%，B保持50%; 5.00～20.00 min: A從50%下降到0%，B從50%上升到100%；20.00～28.00 min:A保持0%，B保持100%；28～32 min:A從0%上升到50%，B從100%下降到50%；32～36 min:A保持50%，B保持50%。熒光檢測(cè)參數(shù)：BaA的保留時(shí)間為22.079 min，激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為385 nm；CHr的保留時(shí)間為22.799 min，激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為385 nm；BbF的保留時(shí)間為24.417 min，激發(fā)波長(zhǎng)為256 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為446 nm；BaP的保留時(shí)間為26.279 min，激發(fā)波長(zhǎng)為292 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為410 nm。

1.2.4 方法學(xué)考察 按1.2.1的樣品處理方法大豆油進(jìn)行樣品處理，上機(jī)檢測(cè)觀測(cè)目標(biāo)物色譜峰的干擾情況，對(duì)選擇性進(jìn)行評(píng)價(jià)；通過(guò)校正曲線方程的R2值，評(píng)價(jià)方法的線性；樣品基質(zhì)中，以目標(biāo)物色譜峰3倍信噪比和10倍信噪比分別計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)；參照樣品中目標(biāo)物的實(shí)際濃度進(jìn)行3水平6重復(fù)的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，對(duì)準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中最低加標(biāo)水平大于目標(biāo)物實(shí)際含量水平的二分之一。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍除脂條件的優(yōu)化

食用植物油經(jīng)乙腈提取后，部分油脂會(huì)溶解在乙腈中，干擾色譜分離的檢測(cè)，需要進(jìn)行脫除。研究表明，食用油加乙腈渦旋、離心后，經(jīng)超低溫冷凍使油脂固化，并立即轉(zhuǎn)移提取液，可有效去除其中的油脂，且當(dāng)提取液乙腈中加入少量水的條件下(乙腈水的體積比為15∶1)，效果更佳[14]。本試驗(yàn)使用普通冰箱，延長(zhǎng)冷凍時(shí)間至2 h，可以使脂肪全部?jī)鲎?，從而轉(zhuǎn)移全部的乙腈提取液，且試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本試驗(yàn)的冷凍脫脂處理，可用于HPLC測(cè)定。由于本試驗(yàn)使用的是熒光檢測(cè)器，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)不能發(fā)揮作用，因此，提取冷凍2次，合并提取液進(jìn)行處理，從而達(dá)到提高提取效率的目的。

2.2 方法學(xué)考察

由典型色譜圖(圖1)可見(jiàn)，采用PAH專(zhuān)用色譜柱，PAH4在大豆油樣品基質(zhì)中獲得有效分離，圖1為食用大豆油樣品未曾加標(biāo)及其加標(biāo)10 μg/kg PAH4后的色譜圖，根據(jù)圖1，表明該方法選擇性良好，可以實(shí)現(xiàn)4種物質(zhì)的分離。

A.大豆油原樣 B.加PAH4 10 μg/kg；1:BaA；2:CHr；3:BbF；4:BaP圖1 PAH4分離的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of PAH4

通過(guò)對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到校正曲線方程見(jiàn)表 1，在1～100 μg/L的考察范圍內(nèi)，PAH4線性良好，R2>0.999 7。由于樣品中4種目標(biāo)物的本底值很高，空白樣不易獲得，不能采用空白加標(biāo)的方法評(píng)價(jià)LOD、LOQ，因此采用實(shí)際樣品中分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的評(píng)估LOD和LOQ，亦列于表 1, PAH4的LOD和LOQ分別為0.06～0.32 μg/kg和0.19～1.07 μg/kg，遠(yuǎn)低于食用油中PAH4的關(guān)注濃度。

表1 方法學(xué)驗(yàn)證Tab.1 Methodological validation

2.3 回收率與精密度

由于常見(jiàn)食用植物油的樣品基質(zhì)較為相近，本試驗(yàn)以大豆油為代表進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)重復(fù)，計(jì)算方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由于食用油樣品中PAH4有較高的本底，定量限水平的加標(biāo)濃度不能獲得，故設(shè)最低加標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg/kg。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2，總體日內(nèi)回收率為77.09%～96.00%，RSD為3.65%～11.75%?；厥章蕽M足GB/T 27417—2017[15]要求，當(dāng)濃度水平范圍為小于0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍為60%～120%。

應(yīng)用本方法檢測(cè)市售稻米油、玉米油、花生油、大豆油，每種類(lèi)型各取2個(gè)不同廠家，每家樣品重復(fù)測(cè)量2次，檢測(cè)結(jié)果列于表 3。結(jié)果顯示，BaP含量在1.00～3.20 μg/kg，PAH4為1.92～20.58 μg/kg。

表3 食用油中PAH4的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Determination results of PAH4 in edible plant oils

3 討 論

該研究建立了冷凍脫脂-高效液相色譜法測(cè)定食用植物油中PAH4的新方法。該方法具有樣品處理相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低的特點(diǎn)，減少了對(duì)專(zhuān)用設(shè)備的依賴(lài)，滿足一般試驗(yàn)室檢測(cè)的需要，具有普遍適用性；冷凍脫脂盡管脫脂不是十分徹底，但能夠滿足HPLC分析的需要，通過(guò)使用并定期更換色譜分離預(yù)柱方法，能夠有效避免樣品對(duì)色譜柱的污染，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)方法的簡(jiǎn)化；該方法檢出限、準(zhǔn)確度均能夠滿足食用油中PAH4監(jiān)測(cè)的需要。實(shí)際樣品檢測(cè)顯示，中國(guó)食用植物油中PAH4污染有一定食品安全風(fēng)險(xiǎn)，值得持續(xù)關(guān)注。