褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜抗氧化酶系統(tǒng)的影響

王 譯，韓瑩琰，郝敬虹，劉超杰，范雙喜

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

生菜，又名葉用萵苣(LactucasativaL.)，喜冷涼環(huán)境，生長(zhǎng)最適溫度為15～20 ℃，超過(guò)30 ℃則會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)不良，且極易抽薹[1]。高溫脅迫會(huì)使生菜產(chǎn)量下降、商品性降低，不耐熱品種反應(yīng)更加明顯[2]。

近年來(lái)，全球氣候變暖對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響也越來(lái)越大[3]。高溫會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，從而造成氧化損傷[4]，當(dāng)植物體內(nèi)活性氧活性氧的清除不能與產(chǎn)生的速率達(dá)到統(tǒng)一，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到傷害。在高溫環(huán)境下，過(guò)量的活性氧使膜脂過(guò)氧化，在膜脂氧化時(shí)會(huì)產(chǎn)生丙二醛(MDA)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。逆境下植物細(xì)胞質(zhì)膜透性以及其過(guò)氧化產(chǎn)物含量是評(píng)價(jià)植物抗逆性的重要指標(biāo)。在受到高溫脅迫時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生一系列的熱激反應(yīng)，激活抗氧化酶防御系統(tǒng)進(jìn)行自我保護(hù)[5]。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是組成該系統(tǒng)的重要酶。這些酶可以清除細(xì)胞產(chǎn)生的自由基，將活性氧控制在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，維持植物的正常生理活動(dòng)。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT)廣泛存在于植物體內(nèi)，對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面有重要的作用。褪黑素在植物抵御干旱脅迫、鹽脅迫、溫度和氧化脅迫等不良影響中體現(xiàn)出重要作用[6]。在植物對(duì)抗氧化脅迫時(shí)尤為突出[7]。前人的研究表明，在高溫脅迫條件下，外源褪黑素能夠提高抗氧化酶系統(tǒng)中部分酶的活性，降低植物體內(nèi)由于環(huán)境脅迫產(chǎn)生的活性氧含量，減輕細(xì)胞膜的損傷，緩解高溫對(duì)植物的不利影響[8,9]。目前，褪黑素調(diào)節(jié)玉米、大豆代謝方面的研究相對(duì)深入，但高溫脅迫下外源褪黑素對(duì)生菜幼苗的作用效果尚不明確。

本試驗(yàn)以熱敏感生菜品種‘北散生3號(hào)’為材料，采用水培方式，通過(guò)葉面噴施50 μmol/L褪黑素，探明高溫環(huán)境下外源褪黑素調(diào)節(jié)生菜抗氧化酶系統(tǒng)的生理機(jī)制，為進(jìn)一步研究外源褪黑素緩解高溫脅迫對(duì)生菜造成的不利影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)生菜為北京農(nóng)學(xué)院課題組提供的熱敏感品種‘北散生3號(hào)’。

1.1 基礎(chǔ)試驗(yàn)

選取顆粒大小一致、無(wú)病害的生菜種子。蒸餾水浸種4 h，在培養(yǎng)皿中平鋪用蒸餾水浸潤(rùn)的濾紙，把生菜種子均勻分布在濾紙上。放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，設(shè)置晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h，相對(duì)濕度為70%～75%。每2 d補(bǔ)充去離子水，觀察種子發(fā)芽情況。將發(fā)芽后的生菜種子移植到水培育苗盤(pán)中，繼續(xù)在上述光培養(yǎng)箱中培育。生菜幼苗培育至3葉1心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)狀況一致的植株，移栽到11孔水培箱中，置于計(jì)算機(jī)智能溫室中繼續(xù)培育，設(shè)置光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，光照強(qiáng)度控制為200 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為70%～75%。待幼苗長(zhǎng)至5葉1心時(shí)開(kāi)始處理。將其轉(zhuǎn)移至?xí)円箿囟仍O(shè)置為30 ℃/25 ℃的溫室進(jìn)行處理。

實(shí)驗(yàn)室前期相關(guān)試驗(yàn)得出高溫脅迫下生菜幼苗生長(zhǎng)最適褪黑素質(zhì)量濃度為50 μmol/L 。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置3個(gè)處理：(1)CK，正常溫度，噴施去離子水；(2)H，高溫環(huán)境，噴施去離子水；(3)H+MT，高溫環(huán)境，噴施50 μmol/L褪黑素。

每天8:30使用小型噴霧器噴施去離子水和50 μmol/L褪黑素溶液，在葉面和葉背均勻噴施，以噴施液體全部潤(rùn)濕葉面，但不下滴為基準(zhǔn)。試驗(yàn)共進(jìn)行8 d，第8天收獲生菜并測(cè)量其形態(tài)指標(biāo)和水分生理指標(biāo)，并在處理的0、2、4、6和8 d傍晚18:00采集主要功能葉測(cè)定其他指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

選取生長(zhǎng)一致的植株測(cè)量株高，地上部分和地下部分的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，并計(jì)算相對(duì)含水量。

葉綠素含量測(cè)定采用95%乙醇浸提法[10]，測(cè)定丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸法[11]，測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性采用過(guò)氧化氫紫外分光光度法[12]；測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法[12]；測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性用 NBT(氮藍(lán)四唑)光化學(xué)還原法[12]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 24(IBM，美國(guó))進(jìn)行差異顯著性分析(LSD，P<0.05)。圖表均使用Excel 2019(Microsoft，美國(guó))制作完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)高溫下生菜幼苗生長(zhǎng)的影響

如表1所示，高溫脅迫下生菜幼苗株高明顯高于對(duì)照，噴施MT株高有所降低但效果不顯著。高溫脅迫使生菜幼苗的植株含水量顯著降低， MT處理后生菜幼苗含水量均顯著高于高溫處理。高溫脅迫下噴施褪黑素對(duì)生菜幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量沒(méi)有顯著影響。以上數(shù)據(jù)表明，噴施外源MT可以緩解高溫脅迫造成的植株相對(duì)含水量降低，但對(duì)株高增長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

表1 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of exogenous MT on growth of lettuce under high temperature stress

2.2 外源MT對(duì)高溫脅迫下生菜葉綠素含量的影響

如圖1所示，高溫環(huán)境下生菜葉片中葉綠素含量與對(duì)照相比出現(xiàn)明顯變化，且葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量變化趨勢(shì)一致。脅迫至4 d，葉片中的葉綠素含量開(kāi)始出現(xiàn)變化，表現(xiàn)為含量上升。并隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，生菜植株葉片中的葉綠素含量逐漸積累。脅迫至8d生菜葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量分別是對(duì)照的1.53倍、1.81倍、1.60倍。高溫噴施褪黑素后葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量有所降低，但是沒(méi)有改變?nèi)~綠素含量的積累趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明，外源褪黑素對(duì)高溫環(huán)境下生菜葉片中的葉綠素含量無(wú)顯著影響。

圖1 外源MT對(duì)高溫脅迫下生菜葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of exogenous MT in chlorophyll content of lettuce under high temperature stress

2.3 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響

如圖2所示，高溫脅迫下生菜幼苗葉片中丙二醛含量顯著高于對(duì)照，并隨著脅迫天數(shù)的增加逐漸積累，6 d時(shí)與對(duì)照相比最為明顯，是對(duì)照的1.48倍。高溫脅迫下噴施褪黑素，丙二醛含量從4 d開(kāi)始與高溫出現(xiàn)差異，4 d、6 d、8 d的丙二醛含量較高溫脅迫分別下降了11.28%、6.66%、8.44%。以上結(jié)果表明，高溫脅迫下噴施褪黑素能夠減少生菜幼苗中丙二醛的積累。

圖2 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of exogenous MT on the MDA content in lettuce under high temperature stress

2.4 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜葉片抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，在持續(xù)8 d的高溫脅迫中，CAT、SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，POD活性逐漸升高。高溫脅迫至8 d，CAT、POD、SOD活性都顯著低于對(duì)照，且降低程度由高到低依次為CAT、SOD、POD。高溫脅迫下噴施褪黑素顯著提高CAT、SOD活性，6 d、8 d活性升高最為顯著。8 d時(shí)噴施褪黑素的CAT、SOD活性分別是高溫的2.41倍、3.60倍。外源褪黑素對(duì)POD活性的影響8 d出現(xiàn)變化，與高溫相比POD提高了17.0%。以上結(jié)果表明，外源噴施褪黑素能夠顯著緩解高溫脅迫對(duì)CAT、SOD活性的影響，在8 d的處理時(shí)間內(nèi)對(duì)POD活性有所提升但效果不明顯。

圖3 外源褪黑素對(duì)高溫脅迫下生菜幼苗的抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous MT on antioxidant enzyme system of lettuce under high temperature stress

3 討 論

高溫脅迫嚴(yán)重影響著植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育[13]。本試驗(yàn)中，高溫環(huán)境對(duì)生菜幼苗的生長(zhǎng)有顯著的影響，表現(xiàn)為葉片皺縮、徒長(zhǎng)抽薹，相對(duì)含水量顯著降低。高溫噴施褪黑素減輕了抽薹現(xiàn)象，其鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、相對(duì)含水量也有所恢復(fù)，外源噴施褪黑素能夠緩解生菜幼苗不良的生長(zhǎng)狀況。

植物的光合作用對(duì)溫度較為敏感，葉綠素作為光合作用中的重要色素，其含量變化能夠反映出植物的抗逆能力。有研究表明高溫脅迫會(huì)使葉綠素的含量顯著減少，一般認(rèn)為其原因是葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致光合色素合成受到影響[14]。而本試驗(yàn)則不同，高溫脅迫下生菜幼苗葉片中的葉綠素含量顯著升高。有前人的研究表明，干旱脅迫使梔子花葉片的相對(duì)含水量降低，葉片生長(zhǎng)受阻，葉面積減小，從而造成單位面積葉片的葉綠素含量升高[15]。本試驗(yàn)中，高溫脅迫對(duì)植株的影響出現(xiàn)與干旱脅迫類(lèi)似的狀況，葉片相對(duì)含水量減少，葉片皺縮，最終表現(xiàn)為葉綠素含量升高。

植物細(xì)胞膜是抵抗高溫脅迫的重要結(jié)構(gòu)，其熱穩(wěn)定性與植物體的耐熱性有直接聯(lián)系。高溫脅迫對(duì)植物細(xì)胞的影響反映在很多方面，其中細(xì)胞膜受損是主要現(xiàn)象之一[16]。在本試驗(yàn)中，高溫脅迫使生菜幼苗體內(nèi)丙二醛含量增加并逐漸積累。外源噴施褪黑素4 d后，丙二醛含量開(kāi)始降低，說(shuō)明外源褪黑素所具有的抗氧化能力，能夠幫助生菜幼苗清除活性氧，保護(hù)膜脂不被氧化，從而降低丙二醛的含量，減輕對(duì)植物的毒害。

綜上所述，高溫環(huán)境下外源噴施褪黑素通過(guò)參與調(diào)控抗氧化系統(tǒng)，提高CAT、SOD、POD的活性，從而減少M(fèi)DA積累，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，并減輕高溫脅迫對(duì)生菜幼苗的損害，提高生菜耐熱性。