一起大熊貓感染犬瘟熱的診斷

張丹輝，馬軍權(quán)，沈潔娜，劉寶

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.秦嶺大熊貓研究中心(陜西省珍稀野生動物救護基地)，陜西周至 710402)

犬瘟熱(Canine distemper)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種急性、烈性傳染病，俗稱犬瘟。主要臨床癥狀為胃腸炎、肺炎、雙相熱和嚴重的神經(jīng)癥狀。本病對犬的致死率高達60%以上，嚴重危害犬類、大熊貓[1]、小熊貓等動物的健康。人類和其他動物對此病無易感性，但會通過接觸傳播病毒。

本病主要通過飛沫和接觸途徑傳播，在發(fā)病早期階段，患病動物眼、鼻腔漿液性分泌物中含有大量的犬瘟熱病毒，同時尿液和糞便中也含有病毒[2-3]，容易通過污染物傳播。在許多動物園，大熊貓繁育基地也出現(xiàn)了犬瘟熱病毒的感染，危害極大。犬瘟熱病毒為泛嗜性病毒，對上皮細胞和淋巴細胞有特殊親和力，因而病變的分布非常廣泛。大熊貓感染犬瘟熱病毒后會出現(xiàn)不同程度的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其中神經(jīng)系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)最為明顯。犬瘟熱的臨床癥狀復雜，表現(xiàn)多樣，容易與細小病毒病、流感、胃腸炎等混淆。

2015年，原陜西省珍稀野生動物搶救飼養(yǎng)研究中心圈養(yǎng)的大熊貓突發(fā)犬瘟熱疫情，6只大熊貓感染，其中5只臨床發(fā)病個體死亡。本試驗通過臨床癥狀分析[4]、快速檢測卡檢測、病理剖檢[5-6]，并結(jié)合犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測，綜合診斷分析患病大熊貓感染了犬瘟熱病毒[7]。犬瘟熱不僅嚴重威脅著圈養(yǎng)大熊貓種群的健康，同時也易引發(fā)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學問題[8-9]。通過此次對大熊貓犬瘟熱的診斷分析，為以后大熊貓犬瘟熱的診斷提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 無菌棉簽采集大熊貓眼部和口鼻分泌物16份，患病大熊貓6份，健康大熊貓10份。患病大熊貓編號1～6，健康大熊貓編號7～16。采集大熊貓的血液樣品放入2 mL離心管中，每管中加300 μL DMEM(加雙抗，雙抗?jié)舛葹? 000 IU/500 mL～10 000 IU/500 mL)，渦旋振蕩30 s，4℃、8 000 r/min離心5 min。將大熊貓抗凝全血樣品取500 μL加等量的Solution R1，振蕩混合30 s，室溫靜置1 min，放入1.5 mL離心管中。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，賽默飛世爾中國有限公司產(chǎn)品；犬瘟熱病毒通用型實時熒光定量PCR檢測試劑盒，上海雅吉生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、Trizol，Takara公司產(chǎn)品；犬瘟熱病毒檢測試紙，韓國安捷公司產(chǎn)品；異丙醇、750 mL/L乙醇等常用分子試劑，天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 移液器(Eppendorf Reference? 2)，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；超速離心機(Eppendorf 5420)，艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR儀(伯樂T100)，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；核酸蛋白質(zhì)檢測儀 (DU800)，美國BECKMAN公司產(chǎn)品；純水儀(ELIX5)，美國Millipore公司產(chǎn)品；超低溫冰箱(MDF-U5412)，日本SANYO公司產(chǎn)品；渦旋混合器(DH-300)，杭州瑞誠儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(FormaTM3103913)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；冰箱(BCD-521WDPW)，海爾集團產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(HH-W420)，常州市億能實驗儀器廠產(chǎn)品；生物安全柜(SX-BHC)，蘇州蘇信環(huán)境科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 快速檢測試紙測試 分別用無菌棉簽收集1～16號大熊貓眼部周圍分泌物，口鼻分泌物，在稀釋液中稀釋后，在被檢物窗口上滴2～3滴，過5 min～10 min后判斷檢測結(jié)果。

1.2.2 病理組織切片、剖檢 對死亡大熊貓進行體表檢查，觀察其皮膚被毛、天然孔、可視黏膜等狀況，記錄拍照。病理剖檢死亡大熊貓，依次觀察腹腔、盆腔、胸腔、口腔、顱腔和腦及各器官病變拍照并取材，選取有典型病變的部位采集1cm3～2cm3的小塊，放置于40 g/L甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 犬瘟熱病毒實時熒光檢測 在非麻醉狀態(tài)下，從大熊貓前臂腕關(guān)節(jié)處靜脈無菌采集外周血，提取RNA。按照犬瘟熱病毒通用型實時熒光定量PCR檢測試劑盒使用方法進行檢測。由Primer5.0設計應用針對犬瘟熱病毒N基因的引物。上游引物CDVF-477：5′-GTGACTGCTCCTGATACTGC-3′；下游引物CDVR-477：5′-ACCAACTCCCATAGCATAAC-3′，并由博仕基因合成。PCR反應條件為：反轉(zhuǎn)錄，42℃ 10 min；預變性，95℃ 3 min；預擴增95℃ 5 s，55℃ 40 s，5個循環(huán)；PCR擴增95℃ 5 s，55℃ 40 s，40個循環(huán)(此階段結(jié)束采集熒光信號)。

2 結(jié)果

2.1 犬瘟熱快速檢測試紙

采集健康大熊貓10只和患病大熊貓6只眼角、口鼻分泌物，經(jīng)過犬瘟熱(CDV)快速檢測試紙檢測，6只患病大熊貓結(jié)果均為陽性，10只健康大熊貓檢測結(jié)果均為陰性，初步判斷患病大熊貓感染犬瘟熱病毒。

2.2 大體病理學變化

病死大熊貓剖檢后可見掌面開裂，肉墊增厚(圖1A)；鼻子過度角質(zhì)化，鼻鏡干裂增厚(圖1B)；皮下淋巴結(jié)腫大(圖1C)；膽囊萎縮，膽汁黏稠(圖1D)；腸系膜淋巴結(jié)水腫。脾臟腫大呈深褐色，切面質(zhì)脆，滲出泡沫樣褐色液體(圖1F)；肺臟淤血、出血和切面呈大理石樣花紋，肺臟間質(zhì)增寬，可見針尖大小出血點。氣管和肺泡腔內(nèi)有泡沫狀黏液滲出(圖1E)；脾頭部位腫大，切面外翻，脾頭邊緣可見小的梗死灶(圖1F)；肝臟、心臟腫大，心血管梗死(圖1G)；腸道黏膜脫落嚴重、出血；腦血管和腦硬膜充血水腫，一側(cè)腦組織明顯淤血和出血點，腦室輕度積液(圖1H)。

A.掌面開裂，肉墊增厚；B.鼻鏡干裂；C.皮下淋巴結(jié)腫大；D.膽囊萎縮，膽汁黏稠；E.肺臟淤血、出血；F.脾臟腫大，有梗死灶；G.心臟腫大，血管梗死；H.腦組織淤血，有出血點。A.The palmar surface is cracked and the claw pad is thickened；B.Cracked nose；C.Subcutaneous lymphadenopathy；D.Gallbladder atrophy,thick bile；E.Lung congestion with bleeding spots；F.Splenomegaly with infarct；G.Heart enlargement,vascular infarction；H.Congestion of brain tissue with bleeding spots.圖1 病死大熊貓大體病理學變化Fig.1 General pathological lesions of the dead giant panda

2.3 病理組織學變化

肺臟小血管和肺泡壁毛細血管淤血，肺泡腔內(nèi)漿液滲出(圖2B)，細支氣管上皮脫落(圖2D)；大腦皮層神經(jīng)細胞可見白質(zhì)空泡化，核內(nèi)可見嗜酸性包涵體，小膠質(zhì)細胞增生(圖2E1、圖2E2和圖2F)；脾臟淋巴細胞明顯減少(圖2G和圖2H)。

A、B、C.小血管和肺泡壁毛細血管淤血，肺泡腔內(nèi)漿液滲出；D.細支氣管上皮脫落；E1.白質(zhì)空泡化；E2.小膠質(zhì)細胞增生；F.核內(nèi)嗜酸性包涵體；G、H.淋巴細胞明顯減少。A,B,C.Congestion of small blood vessels and capillaries in the alveolar wall,exudation of serous fluid in the alveolar cavity;D.Bronchiolar epithelial shedding;E1.White matter vacuolation;E2.microglia proliferation;F.Nucleus eosinophilic inclusion bodies;G,H.Lymph The cells are significantly reduced.圖2 病死大熊貓病理組織學觀察Fig.2 Histopathological observation of dead giant pandas

2.4 犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR檢測

經(jīng)犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR檢測，樣本檢測結(jié)果1～6號和陽性對照(cycle threshold)Ct值小于37，結(jié)果表明1～6號大熊貓犬瘟熱病毒核酸陽性，7～16號樣本檢測均為陰性。其中，實時熒光定量PCR檢測中Ct值≥37，判定為陰性，undetermined判定為陰性。

表1 檢測結(jié)果Table 1 Test results

3 討論

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的犬科、鼬科、大熊貓科等多種動物急性接觸性傳染病。大熊貓也可感染此病，犬瘟熱對大熊貓遷地保護工作的危害極大，是引起大熊貓死亡的頭號殺手[10]。

大熊貓犬瘟熱可引起大熊貓鼻鏡干裂，排出膿性鼻液。食欲減退或廢絕，嘔吐。發(fā)病后期大熊貓突發(fā)全身劇烈抽搐、震顫，牙齒咬合困難，口吐白沫，肌肉陣攣等癥狀。大體病理學變化可見大熊貓肺泡毛細血管淤血，細支氣管上皮脫落；脾臟淋巴細胞數(shù)量減少，大腦皮層神經(jīng)細胞可見嗜酸性包涵體，符合犬瘟熱病毒的臨床癥狀及病理學特征。通過犬瘟熱快速檢測卡和犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR檢測后，可以確定為犬瘟熱病毒感染。

發(fā)生犬瘟熱后，中心迅速采取了隔離措施，將健康的大熊貓進行分散轉(zhuǎn)移，一人一大熊貓進行隔離飼養(yǎng)，并進行犬瘟熱疫苗接種，疫苗為基因重組苗(Purevax?Ferret Distempe)；另一方面成立救治組，對患病大熊貓進行救治，但效果不佳，最終感染的6只大熊貓5只死亡，1只轉(zhuǎn)陰康復。犬瘟熱發(fā)病具有明顯的季節(jié)性，特別是冬春時節(jié)易發(fā)。在患病大熊貓活動場發(fā)現(xiàn)有死亡的野貓，分析本次大熊貓發(fā)病的原因是由于野貓攜帶犬瘟熱病毒造成大熊貓感染。

由于大熊貓本身數(shù)量稀少，且對于大熊貓相關(guān)疾病的研究較少。目前，還沒有專門針對大熊貓病毒性傳染病的疫苗。因此，還需要加大科研攻關(guān)，早日研發(fā)出適合大熊貓使用的疫苗。大熊貓犬瘟熱主要有傳染性高，傳播迅速，并發(fā)癥復雜，診治困難，死亡率高等特點。統(tǒng)計分析歷年發(fā)生大熊貓感染犬瘟熱的病例發(fā)現(xiàn)，大熊貓一旦感染犬瘟熱病毒并出現(xiàn)臨床癥狀，病死率高達95%以上，基本無從治愈。因此，做好大熊貓日常飼養(yǎng)管理工作和消毒防控措施，顯得尤為重要[11]。一方面加強大熊貓體能的鍛煉和營養(yǎng)的補充，增強大熊貓機體的抗病能力。另一方面做好消毒防控措施，定期對大熊貓飼養(yǎng)區(qū)域進行消毒殺菌；聯(lián)合地方政府對飼養(yǎng)區(qū)周邊5 km范圍內(nèi)的貓犬進行犬瘟熱和細小病毒二聯(lián)疫苗免疫，建立保護隔離帶。