Cas9基因編輯技術(shù)對巴馬小型豬生命體征的影響

葉露薇，尹立雪，華進聯(lián)，趙 帥，趙鳳有，付 培，邢向陽，崔 威

(1.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科，四川成都 610072；2.超聲心臟電生理學(xué)與生物力學(xué)四川省重點實驗室，四川成都 610072；3.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院，健康管理中心/健康管理研究所，四川成都 610072；4.成都中科奧格生物科技有限公司，四川成都 610072；5.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院和陜西省干細(xì)胞工程與技術(shù)中心，陜西楊凌 712100)

供體短缺一直是嚴(yán)重阻礙臨床器官移植的發(fā)展的主要原因，隨著器官移植技術(shù)的日益成熟，供體短缺變得日益嚴(yán)峻[1-2]。以基因編輯豬為供體的異種移植是解決這一難題的有效途徑之一[3]。巴馬豬與人在體型大小、重要臟器組織解剖結(jié)構(gòu)和病理、生理發(fā)展過程等方面具高度相似性，且資源豐富，克服了靈長類動物異種帶來的倫理、病毒性傳染病等問題，被選定為較為適合的異種移植供體。同時也是理想的實驗動物模型，在探索人的生命活動規(guī)律以及研究人類疾病的病因、病機、治療、預(yù)防、藥物篩選等方面均有獨特的優(yōu)勢[3-5]。過去，由于基因改造困難，限制了豬在農(nóng)業(yè)育種和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。如今，借助基因編輯的新革命性技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)以及體細(xì)胞核移植技術(shù)，可以前所未有地精確修飾豬基因組，大大拓展了豬作為模型動物的應(yīng)用范圍[6]。體細(xì)胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)與CRISPR/Cas9結(jié)合使用可對豬的基因進行遺傳修飾，SCNT可產(chǎn)生第一代的非嵌合動物[7-9]，可以產(chǎn)生與內(nèi)源性遺傳突變相關(guān)的表型。但這項技術(shù)仍存在脫靶效應(yīng)、影響表觀重編程等缺陷，有可能影響動物的正常生長發(fā)育[10]，從而影響基因編輯豬的廣泛應(yīng)用和深入研究。本研究擬證實基因編輯技術(shù)對巴馬豬基本生命體征和重要器官的組織學(xué)變化的影響，為基因編輯巴馬豬的進一步研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型巴馬豬，雄性13頭，雌性7頭；健康Cas9基因編輯巴馬豬，雄性12頭，雌性12頭，由成都中科奧格生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 異氟烷(Lunan better pharmaceutical Co,Ltd.)、復(fù)方氯胺酮(0.1 g/2 mL)，江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；鹽酸賽拉嗪注射液(2 mL/0.2 g),吉林省華牧動物保健品有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 喉鏡(Ⅰ型插口)，上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術(shù)器械廠產(chǎn)品；呼吸麻醉機(MODEL3000，Matrx)、心電監(jiān)護儀(ePM12)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品；恒溫手術(shù)床(V-TOP，SHOR-LINE)，無錫市恒達氣動塑料廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物的麻醉 按0.05 mL/kg計算用量，以1∶3的比例抽取復(fù)方氯胺酮注射液和鹽酸賽拉嗪注射液，由耳緣靜脈注射，進行誘導(dǎo)麻醉。用豬專用喉鏡引導(dǎo)，插入氣管插管后進行呼吸麻醉，異氟烷1%，氧氣流量50 L/min，潮氣量600 mL維持麻醉狀態(tài)。

1.2.2 生命體征數(shù)據(jù)的收集 用電子稱測量誘導(dǎo)麻醉后的豬的體重，用卷尺測體長(從兩耳根中點聯(lián)線的中部起,用卷尺沿背脊量到尾根的第一自然輪紋為止)。仰臥放于恒溫手術(shù)床上，綁定好后，在呼吸麻醉狀態(tài)下平穩(wěn)0.5 h后，記錄監(jiān)測的心率、呼吸、收縮壓、舒張壓和平均動脈壓，用水銀體溫計插入實驗豬肛門內(nèi)測量體溫。

2 結(jié)果

2.1 生命體征測定的結(jié)果

在麻醉狀態(tài)下，排除月齡差異后，Cas9基因編輯巴馬豬和野生型巴馬豬在體重、體長、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、平均脈壓差、體溫方面無明顯差異(P>0.05)，Cas9基因編輯巴馬豬和野生型巴馬豬的心率存在性別差異(P<0.05)，同性別間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，測定結(jié)果見表1。

表1 基因編輯型巴馬豬與野生型巴馬豬生命體征參數(shù)比較Table 1 Comparison of vital sign parameters between gene edited Bama pigs and wild-type Bama

2.2 組織學(xué)測定結(jié)果與分析

在麻醉狀態(tài)下，對比普通巴馬豬和基因編輯巴馬豬肺臟、肝臟、腎臟和心臟等重要器官的組織學(xué)上細(xì)胞形態(tài)、排列順序、血管分布情況的變化，結(jié)果顯示無顯著差異，如圖1所示。

3 討論

基因編輯技術(shù)是指對基因進行靶向修飾(敲 除、插入、替換等)而獲得新的特征或功能的技術(shù)，自2013年CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)首次應(yīng)用于哺乳動物，Cas9基因編輯技術(shù)在全球范圍得以蓬勃發(fā)展，但基因編輯技術(shù)仍然面臨脫靶、免疫原性、副作用、生物選擇性等不確定性所帶來的風(fēng)險，存在導(dǎo)致細(xì)胞和組織病變的風(fēng)險，對原有物種生命體征和重要臟器組織結(jié)構(gòu)造成不可逆的影響[4,11]。所以基因編輯對原物種基本生命體征和重要器官組織功能的影響應(yīng)該引起重視。

有研究表明，CRISPR-Cas9基因編輯大鼠等小型哺乳動物的突變可導(dǎo)致被編輯動物的血壓、血清膽固醇、心率等的變化[12-13]。尚未發(fā)現(xiàn)研究報道關(guān)于Cas9基因編輯巴馬豬降低免疫排斥反應(yīng)時，巴馬豬的生命體征和重要臟器解剖功能變化情況，本研究在麻醉狀態(tài)下，應(yīng)用五導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)護儀監(jiān)測實驗動物的生命體征，發(fā)現(xiàn)在排除月齡差異后，Cas9基因編輯巴馬豬與野生型巴馬豬在體重、身長、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、平均脈壓差、體溫方面等方面未觀察到差異，心率不受基因編輯的影響，但在不同性別間存在差異。表明基因編輯不影響巴馬豬全身骨骼、肌肉的發(fā)育，同時不影響巴馬豬的心血管循環(huán)功能和呼吸系統(tǒng)功能。在解剖野生型巴馬豬和基因編輯巴馬豬后，對比分析肺臟、心臟、肝臟、腎臟的組織切片，顯示腎臟、肝臟等重要臟器的解剖結(jié)構(gòu)和功能無明顯影響。這表明基于Cas9基因編輯改造巴馬豬，有望在不影響巴馬豬的基本生命特征和重要臟器的發(fā)育的情況下，進一步降低排異反應(yīng)是可行、安全的。

A1,A2.肺臟(ⅠC.Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞;ⅡC.Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞;PM.肺巨噬細(xì)胞);B1,B2.肝臟 (PA.門管區(qū);CV.中央靜脈;HC.肝索;HS.肝血竇)；C1,C2.腎臟 (MD.致密斑;G.血管球;BS.腎小球囊腔)；D1,D2.心臟A1,A2.Lung(ⅠC.Alveolar type I epithelial cell;ⅡC.Alveolar typeⅡepithelial cell;PM.Pulmonary macrophage);B1,B2.Liver (PA.Portal area;CV.Central veins;HC.Hepatic cord;HS.Hepatic sinusoid);C1,C2.Kidne(MD.Macula densa;G.Glomus;BS.Bowman's capsule);D1,D2.Heart圖1 普通巴馬豬(A1、B1、C1、D1)和基因編輯巴馬豬(A2、B2、C2、D2)肺臟、肝臟、腎臟和心臟組織學(xué)比較(石蠟切片，HE染色，400×)Fig.1 Histopathologic comparison of lung,liver,kidney and heart in wild-type Bama pigs (A1,B1,C1,D1)and gene-edited Bama pigs(A2,B2,C2,D2)

巴馬豬心臟解剖與生理特點與人類高度相似，如果應(yīng)用Cas9基因編輯有效降低異種移植的超急性排斥反應(yīng)(HAR)[14-15]，同時又不影響巴馬豬的基本生命特征以及重要臟器的解剖結(jié)構(gòu)和功能，那么豬-人器官移植可能在不久的將來成為一種現(xiàn)實的選擇。