重組G3P[13]型A群豬輪狀病毒全基因組測序分析

王一丹，向 華，張 斌,向 萌，任玉鵬*，邱文英，付利芝

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都 610041；2.華派生物工程集團有限公司，四川成都 610000；3.重慶畜牧科學院，重慶 402460)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PoRV)屬呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，以引起豬的劇烈腹瀉和脫水等為特征，不同年齡段的豬均易感，特別是對1周齡內仔豬的致死率可達100%[1]。PoRV持續(xù)感染還可影響豬群的飼料轉化率及生產力，導致較大經(jīng)濟損失。近年來，PoRV在我國華東、華中、華南、華北及西南等多個地區(qū)都有流行的報道。常新見等[2]對2017年-2018年采自江蘇、浙江、上海、安徽和山東等省(市)的201份腹瀉豬糞便樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)PoRV在這些地區(qū)總體陽性率為25.9%。趙津等[3]對2014年-2015年云南地區(qū)因腹瀉死亡仔豬樣本的PCR檢測結果顯示，PoRV陽性率顯著高于豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)和豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)。這表明，當前PoRV在國內流行趨勢正逐步上升，已成為阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

常見的PoRV主要包括A、B、C和E群等4個血清群。在我國，PoRV感染豬群多以A群為主。PoRV基因組為分節(jié)段的11個dsRNA，分別編碼6個結構蛋白(VP1～VP4,VP6,VP7)和6個非結構蛋白(NSP1～NSP6)。其中，VP7和VP4蛋白在病毒與宿主細胞受體結合過程中發(fā)揮重要作用，可誘導機體產生中和抗體，同時還分別決定PoRV的 G 型和 P 型，研究表明[4]，G9、G5、G5、G3為主要基因型，常與P[13]、P[6]、P[23]等組合。VP1～VP3蛋白主要參與PoRV的基因轉錄和復制；VP6 蛋白是內衣殼蛋白，也具有較強的免疫原性；NSP1～NSP6非結構蛋白則與RVA的復制、轉錄和出芽等過程密切相關[5,6]。近年來，輪狀病毒跨種間傳播的現(xiàn)象也受到廣泛關注。研究表明，包括PoRV在內的多種動物源輪狀病毒都存在直接感染人的風險。輪狀病毒還可以某一種動物源輪狀病毒或多種動物源毒株為骨架，與人源輪狀病毒發(fā)生基因重配而導致人的感染，輪狀病毒感染通常誘發(fā)哮喘和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，兒童的臨床表現(xiàn)為腸胃炎、腸胃外多器官損傷和其他綜合癥，嬰幼兒一旦發(fā)生腹瀉，很容易脫水和電解質紊亂，嚴重影響患兒的身體健康，甚至出現(xiàn)死亡[7]。因此，對PoRV流行情況的持續(xù)監(jiān)測和對其基因組特征及遺傳變異規(guī)律的研究，一方面可為PoRV的防控提供參考，另一方面也具有公共衛(wèi)生學意義。

本研究對來自四川綿陽某豬場的60份腹瀉豬肛門拭子進行了RT-PCR檢測，以判定引發(fā)疫情的主要病因。同時參考GenBank上已登錄的PoRV基因組序列設計引物，擴增陽性樣本中PoRV毒株全基因序列，通過生物信息學軟件對各基因節(jié)段同源性分析，以確定其基因型。進一步進行遺傳變異性分析、系統(tǒng)進化分析和基因重組分析，以期豐富PoRV的流行病學及基因組學相關研究資料，同時為PoRV防控措施制定和跨物種傳播相關研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 腹瀉豬肛拭子樣本于2020年9～12月采自四川綿陽某豬場，共計60份。其中母豬樣本10份，仔豬樣本50份(哺乳仔豬35份,保育豬15份)，所有樣本均為肛拭子，按1∶5(m/v)加入無菌PBS并振蕩混勻，反復凍融3次后置于-80℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 Trizol核酸提取試劑，美國Thermo Fisher Science公司產品；DL 2 000、DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T Simple Vector，寶生物工程 (大連)股份有限公司產品；2×TaqAdvanced PCR Master Mix，成都市蓉為基因生物科技有限公司產品；E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit，美國OMEGA生物技術公司產品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Doc2000)，美國Bio-Rad公司產品；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 PoRV、PEDV、TGEV和PDCoV檢測引物均參考文獻合成[8，9]。PoRV全基因組擴增時，先根據(jù)GenBank上已登錄PoRV毒株(KC113253.1、KC113252.1、KC113251.1、MK227968.1、X69487.1、MF462326.1、U08431.1、GU199517.1、KM393175.1、MH308729.1、MH308731.1)分別對VP6和VP7基因片段保守區(qū)域設計引物并克隆測序，經(jīng)Blast比對找出同源性最高的毒株序列RVA/Pig/China/LNCY/2016 (MF462326.1)，并以此為主要參考毒株對其他基因節(jié)段設計引物分別見表1。所有引物均由(上海)股份生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 核酸提取及反轉錄 用TRIzol法提取樣本中總RNA，按照PrimeScript ? Reverse Transcriptase試劑盒說明書反轉錄成cDNA，反應程序：37℃ 15 min，85℃ 15 s，將cDNA置于-20℃保存。

1.2.3 臨床樣本的RT-PCR檢測 按照試驗1.2.1中合成引物相應的PCR反應體系及程序[8,9]，用已提取的各臨床樣本的cDNA作模板，檢測PoRV、PEDV、TGEV和PDCoV等4種腹瀉病原。取擴增產物各5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結果。

1.2.4 PoRV全基因序列克隆 用18對引物分別對PoRV 11個dsRNA節(jié)段進行擴增，反應體系為：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃延伸時間按1 kb/min設定，循環(huán)35次；72℃ 8 min；4℃保存。對PCR擴增產物進行電泳并用OMEGA凝膠回收試劑盒回收純化。將產物連接至PMD19-T載體，并進行轉化克隆。將陽性克隆送至生工生物工程 (上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5 PoRV全基因生物信息學分析 用Blast和Megalign軟件對本次擴增的PoRV毒株全基因組序列與NCBI上參考毒株的基因組和氨基酸同源性進行比較分析；用MEGA7對 PoRV 基因序列進行系統(tǒng)遺傳進化分析；利用RDP4和SimPlot對該毒株進行基因重組分析。

2 結果

2.1 臨床樣本檢測及全基因擴增結果

對60份臨床樣本PCR檢測結果顯示，PoRV和PDCoV總體陽性率分別為56.7% (34/60)、13.3% (8/60)，但PEDV和TGEV均未檢出，表明本次豬腹瀉疫情主要由上述兩種病毒共同引發(fā)，且以PoRV為主。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不論是PoRV或PDCoV在哺乳仔豬來源樣本中檢出率均顯著高于保育仔豬(P<0.05)，提示兩種病毒均對哺乳仔豬易感性更高。此外，部分樣本中，PoRV和PDCoV還存在混合感染情況，混合感染率為10%(6/60)，這可能是導致本次疫情中仔豬發(fā)病率和死亡率較高的主要原因之一。

2.2 PoRV全基因組擴增結果

用所有引物對PoRV各基因片段的擴增均能獲得與預期大小相符的條帶(圖1)。將PCR產物經(jīng)測序拼接為全基因序列，用輪狀病毒在線分型工具 (RotaC2.0automated genotyping tool)對PoRV 11個dsRNA基因型進行鑒定。結果顯示，SCMY-1株基因組合型為G3-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1 -T1-E1-H1。根據(jù)其VP4和VP7基因型，將該株輪狀病毒命名為RVA/pig/CHN/SCMY-1/2020/G3P[13] (以下簡稱SCMY-1株)。

表2 臨床樣本檢測結果Table 2 The detection results of clinical samples

M.DNA標準DL 2000；1～4.VP1基因(311 bp、1 328 bp、801 bp、1 003 bp)；5～6.VP2基因(1 150 bp、1 571 bp)；7～9.VP3基因(1 399 bp、792 bp、421 bp)；10～11.VP4基因(873 bp)；12.VP6基因(1 514 bp)；13.VP7基因(1 333 bp)；14.NSP1基因(958 bp)；15.NSP2基因(1 462 bp)；16.NSP3基因(1 013 bp)；17.NSP4基因(709 bp)；18.NSP5基因(630 bp)M.DNA Marker DL 2000；1-4.VP1 gene(311 bp,1 328 bp,801 bp,1 003 bp)；5-6.VP2 gene(1 150 bp,1 571 bp)；7-9.VP3 gene(1 399 bp,792 bp,421 bp)；10-11.VP4 gene(873 bp)；12.VP6 gene(1 514 bp)；13.VP7 gene(1 333 bp)；14.NSP1 gene(958 bp)；15.NSP2 gene(1 462 bp)；16.NSP3 gene(1 013 bp)；17.NSP4 gene(709 bp)；18.NSP5 gene(630 bp)圖1 PoRV SCMY-1株全基因組分段擴增結果Fig.1 The amplification of complete of PoRV SCMY-1 strain

2.3 PoRV SCMY-1株基因組同源性分析

對PoRV SCMY-1株11個基因節(jié)段進行Blast比對結果顯示，各基因同源性在93.62%～99.04%之間(表3)。其中，VP6、NSP3和NSP5基因與其他豬源輪狀病毒最高同源性分別可達到98.65%、99.04%和98.82%，是所有基因節(jié)段中相對保守的區(qū)域。而VP4基因變異性較大，最高同源性僅為93.62%，與RVA/Pig-wt/TWN/106-P-002-1-00952017株序列最相似。此外，SCMY-1株中有4個基因節(jié)段與非本動物源基因序列更接近，其中VP2、NSP2和NSP4基因分別與3株人源輪狀病毒RVA/Human-wt/LKA/R1207/2009、RVA/Human-wt/ZAF/UFS-NGS-MRC-DPRU2291/2009和RVA/Human /CU331-NR/08最接近，而VP3基因與熊貓源 RVA/Giant panda/CH-1相似性最高，表明引發(fā)本次疫情的豬輪狀病毒可能與其他動物源輪狀病毒發(fā)生重組或重配現(xiàn)象。

表3 PoRV基因同源性分析Table 3 Homology analysis of PoRV genome

2.4 PoRV SCMY-1株遺傳進化分析

根據(jù) PoRV SCMY-1株VP2基因構建的遺傳進化樹結果顯示，SCMY-1株與RVA/Human-wt/LKA/R1207/2009株毒株單獨聚為一個小支，表明二者間可能存在密切的演化關聯(lián)。此外，從整體上看，大部分豬輪狀病毒和人輪狀病毒各聚為一個大支，但也有少數(shù)人源毒株 (如RVA/Human-wt/COD/KisB332/2008株、RVA/Human-wt/BEL/12R022/2012和 RVA/Human-wt/BEL/BE2001/2009等)處于豬輪狀病毒大分支中，表明近年流行的PoRV和人源輪狀病毒在VP2基因節(jié)段發(fā)生基因重組或重配的可能性較大。同樣，根據(jù)NSP2和NSP4基因構建的遺傳進化樹結果顯示，NSP2與3株(RVA/Human-wt/ZAF/UFS-NGS-MRC-DPRU 2291/2009、RVA/Human-wt/ZAF/MRC-DPRU 2140/2005 和 RVA/Human-wt/ZWE/MRC0 DRRU1850/2011)人源毒株距離接近，其中與RVA/Human-wt/ZAF/UFS-NGS-MRC-DPRU2291/2009單獨聚為一個小支；NSP4與3株人源輪狀病毒遺傳距離較近(RVA/Human/CU331-NR/08、RVA/Human-wt/ZAF/MRC-DRRU1281/2005和 RVA/Human-wt/GHA/DC949/2010)，其中與RVA/Human/CU331-NR/08株單獨聚為一支。上述結果提示，PoRV SCMY-1株很可能以豬源輪狀病毒為骨架，在部分基因節(jié)段與人源輪狀病毒發(fā)生基因重組或重配后形成的新毒株，且存在從豬到人跨種傳播的風險。

對PoRV SCMY-1株VP4基因和VP7基因構建的進化樹結果表明，VP4基因與RVA Pig-wt USA MN9.65b 2008、RVA Pig-wt TWN3-18 2015 G9P13和RVA Pig-wt BEL 12R041 2012 G9P13三個毒株同處一個小分支，與美國毒株的遺傳距離最近，推測SCMY-1株最早由美國流行毒株演化而來。此外，根據(jù)PoRV VP7基因可將G3型輪狀病毒分為G3a/b兩個亞型。本次遺傳進化分析結果顯示，SCMY-1株屬于G3a亞型，與2016年Jing等[10]在遼寧省分離鑒定的RVA/Pig/China/LNCY/2016株遺傳進化距離最近。上述結果還提示，PoRV 可能在國際和國內生豬貿易過程中被廣泛傳播。

2.5 PoRV G3型和P[13]型毒株間氨基酸序列比較

用MegAlign對SCMY-1株的VP4和VP7基因推導氨基酸序列與NCBI上所有已登錄PoRV G3型和P[13]型毒株比對發(fā)現(xiàn)，本次流行毒株的VP4、VP7蛋白氨基酸同源性分別為77.76%～94.95%和93.23%～98.77%。與NCBI上已登錄的毒株相比，SCMY-1株的VP4、VP7蛋白氨基酸都存在多個獨有位點的突變。其中，VP4蛋白有42個氨基酸位點的變異，包括13個獨有位點的變異(I22V、N49S、P113S、Q114P、V129T、N149H、X155D、R249K、S564T、V697A、E701X、D734G、K740R)。VP7蛋白相對保守，僅有2個獨立氨基酸位點的變異(I41V、N49T)。VP4和VP7蛋白氨基酸位點的變異可能會影響 PoRV 的毒力及抗原性。

2.6 PoRV SCMY-1株重組分析

對PoRV SCMY-1株11個基因節(jié)段進行重組分析，僅在VP3基因發(fā)現(xiàn)了重組現(xiàn)象，預測重組值為0.601，親本株為RVA/Pig-tc/CHN/SCLS-3/2018/G3P[13]株和RVA/Pig-wt/TWN/2-1/2015 /G9P19株。SCMY-1株及其親本株VP3基因重組斷點分別位于1048bp和1223bp處。對預測出的重組A、B、C區(qū)域分別構建進化樹。結果顯示，在兩個重組斷點前后均表現(xiàn)出不一致的遺傳進化關系，進一步證實了SCMY-1株的VP3基因發(fā)生了基因重組現(xiàn)象。此外，對其他基因節(jié)段的重組分析結果并未發(fā)現(xiàn)明顯的重組現(xiàn)象，這與根據(jù)此前同源性分析和遺傳進化分析結果所預期的不一致，如SCMY-1株 VP2、NSP2和NPS4分別與多個人源輪狀病毒株同源性最高，且在進化樹也處于同一分支。但上述基因均未預測到重組斷點。推測SCMY-1株可能是以豬源輪狀病毒為骨架，與其他人源輪狀病毒在部分基因節(jié)段發(fā)生了基因重配。

3 討論

根據(jù)輪狀病毒分類委員會命名規(guī)則，在G/P型雙命名法的基礎使用全基因組序列對其進行分類和命名，以 VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5為順序，相對應的基因型表示為Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx。本試驗對PoRV SCMY-1株全基因組克隆分型結果表明，其完整基因合型為G3-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。對11個基因節(jié)段的同源性分析表明，SCMY-1株的VP2、NSP2和NSP4基因分別與3個人源輪狀病毒同源性最高，分別為96.58%、97.69%和97.92%。對VP4基因遺傳進化分析表明，SCMY-1株與美國、比利時和中國臺灣地區(qū)的3個毒株同處一個小分支，與美國毒株的遺傳距離最近，推測上述毒株可能存在密切的演化關聯(lián)，PoRV 可能在國際和國內生豬貿易過程中廣泛傳播。對VP7基因遺傳進化分析結果顯示，SCMY-1株屬于G3a亞型，與2016年遼寧分離株LNCY親緣關系較近，處于同一分支，表明SCMY-1株可能來源于遼寧與四川本地毒株重組或重配。此外，本次流行的SCMY-1株VP2、NSP2、NSP4基因與多個人源毒株位于同一分支，其中NSP2與NCBI上人源毒株同源性在96%以上。這表明SCMY-1株與人源毒株存在密切的遺傳進化關系，這種分子特征可能使SCMY-1株存在跨種傳播到人的風險。這種與其他動物源輪狀病毒不同基因節(jié)段相似性較高的現(xiàn)象與PoRV各基因組遺傳變異性較大，易發(fā)生基因突變、基因重配或重組的特點有關[11]。李玉等[12]分離到一株豬源人源重配的PoRV，其VP1～VP3、NSP3基因與人源輪狀病毒的同源性達94%以上。輪狀病毒基因組高度遺傳變異的特征也是其具有較強的跨種間傳播能力的分子基礎。

對SCMY-1株11個基因節(jié)段進行重組分析，結果僅在VP3基因發(fā)生重組現(xiàn)象，其親本株為RVA/Pig-tc/CHN/SCLS-3/2018/G3P[13]株和RVA/Pig-wt/TWN/2-1/2015/G9P19株，重組斷點分別位于1 048 bp和1 223 bp處。研究表明，PoRV VP3蛋白不僅參與PoRV的基因轉錄和復制，抑制宿主細胞中部分大分子蛋白合成，同時還具有加帽酶活性，可使輪狀病毒與細胞mRNA具有相似的5′端甲基化帽子結構，從而逃避維甲酸誘導基因蛋白I樣受體的識別，起到拮抗宿主先天性免疫的作用[13]。因此，SCMY-1株與其他PoRV毒株VP3基因重組現(xiàn)象可能增強其毒力和宿主適應性。但在其他基因節(jié)段均未預測到重組事件發(fā)生。推測SCMY-1株可能以豬源輪狀病毒基因組為骨架與其他人源輪狀病毒基因節(jié)段發(fā)生基因重配而產生的新毒株。

此外，VP7和VP4是PoRV的重要抗原蛋白。VP7蛋白在病毒與細胞吸附過程中與整合素相互作用，影響病毒的侵入性。VP4蛋白可被胰酶裂解為VP8蛋白(aa1-aa231)和VP5蛋白(aa248-aa776)，VP8蛋白是血凝素抗原，能與組織血型抗原結合介導病毒的附著；VP5蛋白能增加宿主細胞膜通透性。對SCMY-1株的VP4蛋白和VP7蛋白氨基酸同源性分析結果顯示，兩個蛋白的氨基酸序列發(fā)生了多個位點的突變，且部分突變氨基酸位于已鑒定的病毒受體結合相關肽段內[14]，這可能導致輪狀病毒對宿主細胞侵染能力的變化。另外，研究表明，VP7和VP4蛋白中存在大量抗原表位，是刺激機體產生特異性抗體的重要蛋白[15]。SCMY-1株VP4蛋白有13個獨有氨基酸位點突變，VP7蛋白有2個獨有位點突變，這些氨基酸突變可能些變化可能會影響毒株的毒力和抗原性。

本研究對引發(fā)四川某豬場腹瀉疫情的PoRV SCMY-1株進行了全基因組測序分析，確定其基因合型并進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，豐富了PoRV基因組特征和遺傳變異規(guī)律的相關研究資料，為PoRV精準防控措施制定提供了參考，也為進一步探究PoRV跨物種傳播的分子機制提供了理論依據(jù)。