針刺對急性期腦出血大鼠M1型小膠質(zhì)細胞的影響

曹洪濤，于學平，戴曉紅，滕 偉，匡炳霖，于薇薇，李明月，鄒 偉△

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2．黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是卒中患者預后最差的疾病之一，全球范圍內(nèi)發(fā)病率約為24.6/100 000，且發(fā)病早期死亡率極高，幸存者多遺留有運動、感覺、語言等不同類別、不同程度的功能障礙，支持性護理是目前治療本病的主要方法[1-3]。ICH發(fā)生后的最初幾個小時由于血腫或水腫壓迫造成原發(fā)性腦損傷，引起占位效應和顱內(nèi)壓升高，從而導致腦疝和死亡。繼發(fā)性腦損傷是由小膠質(zhì)細胞激活引起的，小膠質(zhì)細胞會驅(qū)動促炎、氧化和細胞毒性級聯(lián)反應，導致細胞死亡和功能障礙[4]。小膠質(zhì)細胞作為關鍵的先天免疫細胞，在應對急性腦損傷時，激活后的小膠質(zhì)細胞可以動態(tài)地和暫時地改變它們的表型，發(fā)展成經(jīng)典激活(M1型，產(chǎn)生促炎介質(zhì))或替代激活(M2型，產(chǎn)生抗炎介質(zhì))表型，被認為是對ICH等各種急性腦損傷做出反應的第一個非神經(jīng)元細胞[4-6]。最初發(fā)生腦出血等急性腦損傷時，M1型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在損傷區(qū)域占據(jù)主導地位，并產(chǎn)生大量IL-1β等促炎因子，促進炎癥反應加劇腦損傷[7]。

筆者先前研究表明，針刺百會透曲鬢穴可以抑制Mincle、Syk、CARD9的免疫反應和蛋白表達，降低腦組織中促炎因子IL-1β的含量，減輕腦出血后炎性損傷，改善腦出血后的神經(jīng)功能障礙[8]。但從針刺能否抑制激活后M1型小膠質(zhì)細胞方面探討針刺對腦出血腦保護作用的研究較少。本實驗以M1型小膠質(zhì)細胞標記物(CD86、iNOS)及炎癥因子(IL-1β)作為觀察指標，觀察針刺對腦出血大鼠M1型小膠質(zhì)細胞及炎癥的影響，探討本法治療腦出血的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究選取的147只體質(zhì)量為(280±20)g、年齡為7～8周的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,均購買于黑龍江中醫(yī)藥大學[證書編號：SCXK(黑龍江)2017-004]，所有大鼠可自由獲得潔凈水源和標準食物，并在溫度(20±2)℃和濕度(50±5)%可控的動物房中進行12 h光照/黑暗周期飼養(yǎng)。所有動物實驗均已獲得黑龍江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準(批準號：2020-09-24-01)。并依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的動物護理和使用指南進行。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 儀器 立體定位儀(ST-5ND-C，中國成都儀器廠)；臺式牙鉆機(307-6型，中國上海齒科醫(yī)械廠)；電泳儀(DYY-7C，北京六一儀器廠)；石蠟包埋機(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司)。

1.2.2 試劑 CD86多克隆抗體(bs-1035R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國)；iNOS多克隆抗體[ab49999，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，中國]；白介素1β(IL-1β) ELISA檢測試劑盒(WLE03，沈陽萬類生物科技有限公司，中國)。

1.3 實驗設計和分組

隨機將147只大鼠分為假手術(shù)組、模型組及針刺組，每組49只，將所有組分為4個亞組，6 h組(n=10)、1 d組(n=10)、3 d組(n=19)和7 d組(n=10)，分別在治療后6 h、1 d、3 d和7 d時，各亞組均取10只大鼠評定各組大鼠改良的神經(jīng)功能缺損評分，然后處死大鼠，取腦組織樣本進行HE染色，評價針刺對腦組織病理損傷及神經(jīng)功能的影響；3 d時各組大鼠相關治療結(jié)束后，空白組、模型組及針刺組均取9只大鼠腦組織樣本，進行Western blot檢測(每組3只)、免疫熒光染色(每組3只)及ELISA試劑盒檢測(每組3只)，評價針刺對M1型小膠質(zhì)細胞標記物的影響。

1.4 造模方法

將小鼠通過腹膜內(nèi)注射2 %戊巴比妥鈉(40 mg / kg)麻醉后，固定在立體定位儀中。用牙鉆(前囟點后0.2 mm，右側(cè)3.5 mm)鉆一個毛刺孔(直徑1 mm)，直到到達腦膜。從大鼠尾靜脈采集50 μL自體血，然后將微量注射器在立體定位儀上固定，將針頭沿鉆孔進針約6 mm，以20 μL/min速度注射到尾狀核，5 min后緩慢取出微量注射器。然后用牙科水泥封住穿刺口，縫合皮膚，最后對傷口進行包扎和消毒。假手術(shù)組進行腦出血模型制備的各項手術(shù)操作，但不注血。造模完成后，待大鼠清醒，依據(jù) Berderson 評分法[9]對造模后大鼠進行評分。評分1～3分的大鼠被作為腦出血成功模型，納入實驗。

1.5 干預方法

1.5.1 假手術(shù)組 進行腦出血模型制備的各項手術(shù)操作，但不注血。

1.5.2 模型組 僅進行腦出血模型制作，不做任何干預治療。

1.5.3 針刺組 造模成功后12 h，對大鼠進行針刺治療。針刺部位參照《實驗針灸學》[10]選取大鼠百會穴(頂骨正中)及大鼠曲鬢穴(患側(cè))(右眶外緣與右外耳門連線的后2/3)。操作方法：選用規(guī)格為0.30 mm×25 mm的一次性使用針灸針(華佗；蘇州)從百會穴透刺至患側(cè)曲鬢穴，然后選用經(jīng)過至少24 h訓練的針灸醫(yī)師將針以(190±10)r/min 的速度進行左右交替旋轉(zhuǎn)，持續(xù)刺激5 min后休息5 min，連續(xù)治療3次。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 神經(jīng)行為學評價 選用改良的神經(jīng)功能缺損評分[11](modified Neurological Severity Score，mNSS)評價各組大鼠神經(jīng)功能。

1.6.2 HE染色 灌注后，切取大鼠出血部位中心位置前后2 mm的腦組織，包埋，切取4 μm厚的組織切片，HE染色，高倍鏡觀察病理損傷。

1.6.3 Westernblot檢測腦組織CD86、iNOS蛋白表達 取凍存于-80 ℃冰箱的各組腦組織，將腦組織勻漿離心后分離上清取上清液，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。20 μL處理后的蛋白樣品加入電泳槽中進行電泳，轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂奶粉封閉，相應條帶分別加入一抗CD86(1∶1 000)、iNOS(1∶500)，4 ℃孵育過夜。漂洗好PVDF膜后加入二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育45 min。洗滌后緩慢搖動洗滌5 min×6次，濾紙吸干水分后，靜置反應5 min，最后將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

1.6.4 免疫熒光 腦組織取出后，放入10 %的多聚甲醛并置入4 ℃冰箱中固定24 h后，包埋，切片，脫蠟，水化后，PBS洗5 min×3次。切片放入含有檸檬酸PH6.0修復液的修復盒，中火5 min煮沸，?；鸨? min，低火10 min。冷卻后PBS洗5 min×3次，加入一抗CD86(1∶200)、iNOS(1∶2 000)，4 ℃避光過夜。室溫放置復溫30 min，PBS洗5 min 3次，滴加熒光二抗，二者均用PBS 1∶200稀釋，室溫避光孵育60 min。PBS洗5 min 3次，滴加DAPI，復染核8 min。PBS洗5 min 3次，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察和計數(shù)。

1.6.5 ELISA檢測 取大鼠腦組織勻漿上清進行ELISA檢測，具體步驟嚴格按照試劑盒操作說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠mNSS評分比較

造模前所有大鼠mNSS評分均為0分。假手術(shù)組術(shù)后均未見明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。模型組與針刺組大鼠于造模后6 h時均表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，1 d、3 d及7 d時均有神經(jīng)缺損癥狀；針刺組與模型組比較，各時間大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.2 3組大鼠HE染色結(jié)果

6 h、1 d、3 d和7 d時，假手術(shù)組大鼠基底節(jié)區(qū)可見腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，少量炎性細胞浸潤，無出血點。模型組大鼠在造模6 h后可見大量血細胞溢出，神經(jīng)纖維腫脹，神經(jīng)元數(shù)量減少;1 d時大量血細胞溢出，炎性細胞增多；術(shù)后3 d時：腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變嚴重，大量炎性細胞浸潤，大量血細胞溢出；術(shù)后7 d時，出血范圍及炎性細胞減少。與模型組相比，針刺組各時間點出血灶范圍縮小，炎性細胞相對降低，腦組織病理結(jié)構(gòu)破壞程度降低。見圖1。

表1 3組大鼠mNSS評分比較

圖1 3組大鼠HE染色結(jié)果

2.3 3 d時3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

假手術(shù)組可見CD86蛋白弱陽性表達；模型組CD86蛋白表達明顯增高。與模型組比較，針刺組CD86蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 3 d時3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

表2 3 d時3組大鼠腦組織CD86蛋白比較

2.4 3 d時3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

假手術(shù)組可見iNOS蛋白少量表達；模型組iNOS蛋白表達明顯增高。與模型組比較，針刺組iNOS蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 3 d時3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

表3 3 d時3組大鼠腦組織iNOS蛋白比較

2.5 3 d時3組大鼠CD86、iNOS免疫熒光雙染結(jié)果

免疫熒光雙染示3組大鼠均有CD86、iNOS共表達陽性細胞；與假手術(shù)組比較，針刺組、模型組CD86、iNOS共表達陽性細胞明顯增多；與模型組比較，針刺組CD86、iNOS共表達陽性細胞數(shù)明顯減少。見圖4。

2.6 3 d時3組大鼠IL-1β ELISA檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織IL-1β表達較低；與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組腦組織IL-1β表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組腦組織IL-1β表達明顯降低(P<0.01)。見表4。

圖4 3 d時3組大鼠CD86、iNOS免疫熒光雙染結(jié)果

表4 3 d時3組大鼠IL-1β ELISA檢測結(jié)果比較

3 討論

腦出血在中醫(yī)學屬“中風病”范疇，針刺治療本病療效確切，其中頭針治療本病效果更為顯著[12]。百會位居巔頂，屬督脈，各經(jīng)脈氣會集之所，通經(jīng)舒絡。曲鬢穴為足太陽、足少陽交會穴，其通經(jīng)舒絡、調(diào)達氣血，具有振頹療癱的作用。早在古籍《普濟方》中就有“凡忽中風，言語謇澀，半身不遂……穴百會，耳前發(fā)際曲鬢穴”的記載?，F(xiàn)代臨床研究證明，針刺百會透曲鬢穴能夠提高治療腦出血的臨床療效，降低患者神經(jīng)功能缺損程度[13]；動物研究證實針刺百會透曲鬢穴能夠減輕腦出血后炎性損傷，改善腦出血后的神經(jīng)功能障礙[8，12]，說明頭針在抑制炎癥、減輕神經(jīng)功能障礙方面具有重要作用。

小膠質(zhì)細胞是大腦的主要吞噬細胞，ICH后被腦損傷迅速激活，發(fā)展成經(jīng)典激活(M1型，促炎)或替代激活(M2型，抗炎)表型，在 ICH 中具有雙重作用[14]?；罨男∧z質(zhì)細胞可通過吞噬血腫以及細胞碎片，進而維持受損組織穩(wěn)態(tài)，促進神經(jīng)功能恢復。但在此過程中，活化的小膠質(zhì)細胞也會產(chǎn)生多種有害細胞因子，如促炎因子(IL-1β)等，增加腦出血后腦損傷[15-16]。雖然在ICH急性期整體 M1和 M2標記物水平都增加，但流式細胞術(shù)表明小膠質(zhì)細胞主要發(fā)展為M1表型[17-18]，其已被證明會產(chǎn)生促炎因子，且激活后M1型小膠質(zhì)細胞的數(shù)量與神經(jīng)功能損傷相關[19]。Wang等[20]實驗結(jié)果表明增強小膠質(zhì)細胞驅(qū)動的炎癥反應，加劇小鼠腦出血后的腦損傷。抑制ICH后激活的M1型小膠質(zhì)細胞，有助于減輕炎癥誘導的繼發(fā)性腦損傷，起到腦保護作用[4]。同時，小膠質(zhì)細胞與炎性反應相關炎性因子具有密切聯(lián)系。炎性反應作為ICH重要的病理機制，多項研究證實炎癥因子IL-1β與ICH后繼發(fā)性腦損傷關系密切[21-22]。

本實驗采用mNSS評分法觀察到模型組與針刺組大鼠于造模后6 h時均表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，1 d、3 d及7 d時均有神經(jīng)缺損癥狀；針刺組與模型組比較，各時間大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低，說明針刺可以降低ICH大鼠神經(jīng)功能評分，有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組大鼠在造模6 h后可見大量血細胞溢出，神經(jīng)纖維腫脹，神經(jīng)元數(shù)量減少;1 d時大量血細胞溢出，炎性細胞增多；術(shù)后3 d時：腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變嚴重，大量炎性細胞浸潤，大量血細胞溢出;術(shù)后7 d時，出血范圍及炎性細胞減少。與模型組相比，針刺組各時間點上述病理情況均有所減輕，表明針刺能夠減輕腦出血大鼠的腦組織炎性損傷。經(jīng)Westernblot檢測可見，模型組CD86、iNOS蛋白表達明顯增高。與模型組相比，針刺組CD86、iNOS蛋白表達明顯降低，說明針刺能夠抑制CD86、iNOS蛋白表達。經(jīng)免疫熒光雙染示3組大鼠均有CD86、iNOS共表達陽性細胞；與模型組比較，針刺組CD86、iNOS共表達陽性細胞數(shù)明顯減少。同時，ELISA試劑盒檢測IL-1β可見模型組、針刺組腦組織IL-1β表達明顯升高,與模型組比較針刺組腦組織IL-1β表達明顯降低，說明針刺能夠有效降低ICH大鼠腦組織炎癥因子IL-1β表達。

綜上，針刺百會透曲鬢穴可能通過抑制M1型小膠質(zhì)細胞，降低炎癥因子IL-1β表達，減輕ICH后炎癥損傷，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮腦保護作用。但針刺如何抑制M1型小膠質(zhì)細胞活化，及是否通過促進M1型小膠質(zhì)細胞向M2型極化，進而降低炎癥因子IL-1β表達，尚需進一步論證，以期為臨床治療本病提供新思路。