基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的秦七風(fēng)濕方干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎活性成分及作用機(jī)制預(yù)測△

蘇潔，周瑞*，王梅，張海潮，劉妍如，劉紅波，宋忠興，楊莎，唐志書

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）為常見的關(guān)節(jié)類疾病，臨床一般表現(xiàn)為膝、髖等大關(guān)節(jié)的疼痛、單側(cè)關(guān)節(jié)僵硬，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、脫位，影響患者日常生活[1]。OA 屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，為五體痹之一。風(fēng)寒濕邪內(nèi)侵人體筋骨關(guān)節(jié)，致經(jīng)脈氣血閉阻，肢體沉重、拘攣屈曲，關(guān)節(jié)劇痛?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》記載“腎主骨”[2]10、“腎生骨髓”[2]43，《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞》記載“腦為髓之?！薄八韬Ｓ杏?，則輕勁多力，自過其度；髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒?！盵3]100腎充養(yǎng)骨骼，腎充則髓實(shí)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》逆調(diào)論中記載：“病名曰骨痹，是人當(dāng)攣節(jié)也?！盵2]56以腎虛髓涸，致筋燥失養(yǎng)，攣縮而急。故在祛除風(fēng)寒濕邪之時(shí)，當(dāng)補(bǔ)益肝腎，以達(dá)到扶正祛邪之效。秦七風(fēng)濕方（Qinqi Rheumatism Formula，QRF）為陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊秀清教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，該方源于秦嶺特色藥材陜西“太白七藥”，由珠子參（扣子七）、秦艽、山茱萸組成，方中君藥珠子參，有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血之效，文獻(xiàn)報(bào)道其具有鎮(zhèn)痛、抗炎[4]及免疫調(diào)節(jié)[5]等藥理活性。臣藥秦艽善治風(fēng)濕痹痛、半身不遂等證，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、清濕熱等功效，增強(qiáng)君藥祛瘀止痛之效。山茱萸以果肉入藥，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，臨床多用于補(bǔ)益肝腎、收澀固脫，文獻(xiàn)記載其具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌等多種藥理活性[6]，在QRF 中為佐使藥，補(bǔ)益肺腎之氣，調(diào)和君藥珠子參的寒性，同時(shí)引藥下行入腎經(jīng)。三藥配伍共行通痹止痛、清濕熱、補(bǔ)益肝腎之效，配伍得當(dāng)，溫而不燥，補(bǔ)而不過。

OA高發(fā)于老年人群，在治療過程中，使用消炎藥、止痛藥的不良反應(yīng)較嚴(yán)重，而進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)需要承擔(dān)較高風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找合適的藥物進(jìn)行緩解及干預(yù)治療十分必要。在臨床中QRF 已被證實(shí)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）所表現(xiàn)的關(guān)節(jié)肌肉疼痛、屈伸不利等癥狀有明顯改善作用，且QRF 全方在通痹止痛基礎(chǔ)上，更有補(bǔ)益腎氣、扶正祛邪之效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，QRF 能夠顯著抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 分泌炎癥細(xì)胞因子一氧化氮（NO）[7]，在昆明種小鼠體內(nèi)有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，具有抑制免疫功能的作用[8]，同時(shí)初步發(fā)現(xiàn)其對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用[9]。以上研究表明，QRF 具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，因此推測QRF 可能對(duì)OA 有干預(yù)作用。目前關(guān)于QRF 干預(yù)OA 的臨床研究和實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少，本課題基于系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，建立QRF干預(yù)OA 的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)QRF 作用于OA 的活性成分及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析，并通過分子對(duì)接及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。OA 在臨床中常表現(xiàn)為滑膜炎癥，患者滑膜組織中存在大量活化的巨噬細(xì)胞，提示巨噬細(xì)胞可能在OA 的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[10]。因此，本課題組通過LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型，研究QRF 的體外抗炎活性，為QRF 干預(yù)OA 的臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試藥

珠子參（批號(hào)：20191105）、秦艽（批號(hào)：20200511）和山茱萸（批號(hào)：20200321）飲片均購于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定，分別為五加科植物珠子參Panax japonicusC.A.Mey.var.major（Burk）C.Y.Wu et K.M.Feng.的干燥根莖、龍膽科植物秦艽Gentiana macrophyllaPall.的干燥根、山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉；胎牛血清（FBS，批號(hào)：1924622）、青?鏈霉素（批號(hào)：0010419）、RPMI 1640 培養(yǎng)液（批號(hào)：2038151）均購于Biological Industries 公司；CCK?8試劑（批號(hào)：SB793，Dojindo Laboratories 公司）；LPS（批號(hào)：L4391，Sigma公司）；腫瘤壞死因子?α（TNF?α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號(hào)：M170228?102a，欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 儀器

Multiskan GO 型全波長酶標(biāo)儀、I50i/240i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Legend Micro 17R型高速冷凍微量離心機(jī)、ECO 0.9型超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 QRF化學(xué)成分及成分靶點(diǎn)收集

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、SymMap（https://www.symmap.org/）及中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）[11?13]及相關(guān)文獻(xiàn)收集珠子參、山茱萸、秦艽3 味中藥所含的活性成分及成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范、校正靶點(diǎn)簡稱。

2.2 OA相關(guān)靶點(diǎn)收集及成分?疾病靶點(diǎn)交集

以“骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis）”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）及DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中對(duì)疾病進(jìn)行搜索，得到與OA 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行校正并去除重復(fù)靶點(diǎn)，即得OA 相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。運(yùn)用在線作圖網(wǎng)站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，收集成分可能作用于疾病的靶點(diǎn)。

2.3 蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及生物學(xué)功能與代謝通路的富集分析

在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫（https://String?db.org/）中將成分、疾病的共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析構(gòu)建，將種屬選項(xiàng)選擇“智人（homo sapiens）”，Clusters 選擇“kmeans clustering”選項(xiàng)，設(shè)置3 個(gè)集群，其他參數(shù)保持默認(rèn)值，將PPI 結(jié)果以.png 格式導(dǎo)出保存。在STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫中對(duì)所得的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行分析，通過基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫分別對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）富集分析，通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的代謝通路富集分析。使用在線作圖網(wǎng)站微生信輸出結(jié)果。

2.4 藥物?成分?靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

根據(jù)KEGG 代謝通路的富集結(jié)果，進(jìn)一步將富集得到的通路與3 味藥物、關(guān)聯(lián)成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建QRF 的藥物?成分?靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)。

2.5 分子對(duì)接虛擬篩選

2.5.1 蛋白受體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備 通過UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出的核心靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do）中下載蛋白質(zhì)大分子的.pdb 格式文件。在UCSF Chimera 1.15rc軟件中去除大分子蛋白結(jié)構(gòu)中的晶體結(jié)構(gòu)及水分子等小分子物質(zhì)，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、能量最小化處理后，保存為.mol2格式。

2.5.2 活性成分配體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備 通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測活性成分及陽性對(duì)照藥物塞來昔布（Celebrex）的CAS 號(hào)，在SciFinder?Explore 數(shù)據(jù)庫（https://scifinder.cas.org/scifinder/view/scifinder/scifinder Explore.jsf）的Substance Identifier 項(xiàng)下檢索活性成分，并保存其二維化學(xué)結(jié)構(gòu)的.mol 格式。通過ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件規(guī)整二維化合物結(jié)構(gòu)式，保存為.cdx 格式，通過Chem3D 19.0 軟件進(jìn)行能量最小化處理，保存小分子配體為.mol2格式。

2.5.3 成分靶點(diǎn)對(duì)接 在UCSF Chimera 1.15rc 軟件中打開大分子靶點(diǎn)蛋白與小分子配體的.mol2 格式，通過軟件中的AutoDock Vina 板塊，設(shè)置受體、配體分子及對(duì)接盒子大小，設(shè)定Number of binding modes=9、Exhaustiveness of search=8、Maximum energy difference=3，進(jìn)行分子對(duì)接虛擬篩選，導(dǎo)出對(duì)接的最優(yōu)構(gòu)象親和力分值結(jié)果。

2.6 QRF的體外炎癥活性驗(yàn)證

2.6.1 QRF 水提物的制備 按照1.0∶1.5∶1.5 稱取珠子參、秦艽和山茱萸，加16 倍量水煎煮3 次，每次2 h，合并濾液，得QRF水提液，用時(shí)稀釋至對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度。

2.6.2 QRF對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 RAW264.7細(xì)胞用含10% FBS 及1%青?鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板中，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 之后，棄去上清液，設(shè)對(duì)照組（完 全培養(yǎng)基）及QRF（20、50、100、200、500、1000、2000 μg·mL-1，以生藥量計(jì)）組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK?8試劑10 μL，1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測其吸光度。

2.6.3 QRF對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF?α的影響 將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h之后，棄上清液，設(shè)置對(duì)照組（完全培養(yǎng)基）、模型組（LPS 1 μg·mL-1）、QRF（20、50、100、200 μg·mL-1，以生藥量計(jì)）組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔[14]。作用20 h 后取細(xì)胞上清液，按TNF?αELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測TNF?α釋放量。

2.6.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)以（）表示。若符合正態(tài)性分布和方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）；若為非正態(tài)分布或方差不齊，兩組之間比較采用Mann?Whitney U 檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal?Wallis H檢驗(yàn)。至少進(jìn)行3次以上平行實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 QRF活性成分的收集

經(jīng)TCMSP、SymMap、ETCM 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)[15?20]篩選，剔除無靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)的成分及藥物中含量少且非主要活性部位的成分，篩出珠子參活性成分33個(gè)、山茱萸中活性成分12個(gè)、秦艽中活性成分11個(gè)。

通過數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)篩選出3 種藥物主要活性成分共50 個(gè)，結(jié)果見表1。其中齊墩果酸為3 種藥物共有的成分，谷甾醇、獐牙菜苷元為山茱萸、秦艽共有成分，豆甾醇為珠子參、山茱萸共有成分，胡蘿卜苷為珠子參、秦艽共有成分。

表1 QRF主要活性成分

3.2 藥物成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)及OA靶點(diǎn)的收集

共篩選得到珠子參靶點(diǎn)247 個(gè)、山茱萸靶點(diǎn)206個(gè)、秦艽靶點(diǎn)169個(gè)，去重后共計(jì)成分靶點(diǎn)330個(gè)。在GeneCards、Therapeutic Target Database、DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索分別得到OA 相關(guān)靶點(diǎn)466、20、82個(gè)，去重后共得到556 個(gè)靶點(diǎn)。通過韋恩圖對(duì)收集到的成分與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集（圖1），得到可能為QRF 中活性成分作用于OA的靶點(diǎn)26個(gè)。

圖1 QRF成分靶點(diǎn)與OA靶點(diǎn)交集韋恩圖

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將26個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。白細(xì)胞介素?6（IL?6）與其他蛋白的關(guān)聯(lián)程度最高，TNF、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、IL?1β等蛋白次之，說明這些蛋白參與調(diào)控的功能較為顯著。

圖2 QRF作用于OA靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.4 GO分析及KEGG通路富集分析

運(yùn)用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫對(duì)26 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析，共得到GO 條目762 個(gè)（P＜0.05），其中BP 條目672 個(gè)，CC 條目30 個(gè)，MF 條目60 個(gè)，分別占88%、4%、8%。3 個(gè)類別GO 分析P值較小的前10 個(gè)結(jié)果見圖3。由GO 分析結(jié)果可知，QRF 中的活性成分作用于OA 的靶點(diǎn)主要分布在細(xì)胞外空間（extracellular space）、細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）、核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB）抑制蛋白（I?κB）/NF?κB 復(fù)合體（I?κB/NF?κB complex）等部位，MF 主要涉及過渡金屬離子結(jié)合（transition metal ion binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶活性（prostaglandin?endoperoxide synthase activity）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）等，且與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（cytokine?mediated signaling pathway）、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)（response to cytokine）、細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)（cellular response to cytokine stimulus）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）等BP密切相關(guān)。

圖3 QRF干預(yù)OA靶點(diǎn)的GO富集分析

KEGG 代謝通路富集共篩選得到102 條信號(hào)通路（P＜0.05），涉及IL?17 信號(hào)通路（hsa04657）、TNF信號(hào)通路（hsa04668）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（hsa05323）、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路（hsa04620）、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）分化（hsa04659）、破骨細(xì)胞分化（hsa04380）等，這些通路可能為QRF 干預(yù)OA 的關(guān)鍵通路。P值較小的前10 條代謝通路對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息見表2。

表2 代謝通路對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息(前10條)

3.5 藥物?成分?靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將KEGG 通路富集分析結(jié)果的前10 條代謝通路匹配的靶點(diǎn)進(jìn)行整合，共得到通路關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)14 個(gè)，通過2.1 項(xiàng)下的成分靶點(diǎn)整理得到14 個(gè)靶點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)的藥物活性成分，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建QRF藥物?成分?靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖4 QRF干預(yù)OA的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

其中珠子參中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd，山茱萸中熊果酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷，秦艽中的馬錢苷酸、龍膽堿等多個(gè)成分的度（degree）值較高，提示這些活性成分可能參與了QRF調(diào)控干預(yù)OA的過程。

3.6 分子對(duì)接虛擬篩選

AutoDock Vina 對(duì)接后的score 表示配體受體對(duì)接的最佳構(gòu)象打分值，數(shù)值越小說明配體與受體結(jié)合的親和力越大，構(gòu)象越穩(wěn)定。一般認(rèn)為score＜-7，配體受體具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測的靶點(diǎn)蛋白受體及活性成分的小分子配體結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理后，在Chimera 的AutoDock Vina 板塊進(jìn)行虛擬對(duì)接，結(jié)果見表3。以陽性對(duì)照藥物塞來昔布對(duì)比評(píng)價(jià)預(yù)測的其他主要活性成分與目標(biāo)靶點(diǎn)的結(jié)合能力。由分子對(duì)接結(jié)果可知，人參皂苷Rg1與TNF 親和力強(qiáng)于塞來昔布，熊果酸、人參皂苷Rb1與IL?1β，熊果酸與IL?6 親和力強(qiáng)于塞來昔布，人參皂苷Re 與IL?1β、IL?6 對(duì)接構(gòu)象的親和力與塞來昔布相當(dāng)。熊果酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、馬錢苷酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷與PTGS2 均有較強(qiáng)的結(jié)合活性，但弱于塞來昔布。

表3 QRF干預(yù)OA的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接得分及關(guān)聯(lián)藥物分析

上述靶點(diǎn)與部分活性成分的分子對(duì)接構(gòu)象結(jié)果見圖5。大部分活性成分與受體主要以氫鍵形式結(jié)合，其中人參皂苷Rg1上羥基與TNF 蛋白上的GLU248、GLN369為氫鍵的結(jié)合位點(diǎn)，羰基與LYS238結(jié)合形成氫鍵。人參皂苷Rb1與IL?1β受體結(jié)合，配體上羥基與LEU134 為氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。熊果酸與IL?6 受體上ASN33結(jié)合形成氫鍵。人參皂苷Rg1與PTGS2上氫鍵結(jié)合位點(diǎn)為THR28、ARG29、SER95、ILE93、SER90、GLN339。

圖5 QRF干預(yù)OA的活性成分與靶點(diǎn)對(duì)接相互作用分析

3.7 體外抗炎活性驗(yàn)證結(jié)果

QRF 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表4，與對(duì)照組相比，QRF 在1000 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞存活率降低，在20～500 μg·mL-1可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，說明QRF 質(zhì)量濃度在500 μg·mL-1以下對(duì)RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。因此，選取QRF質(zhì)量濃度為20、50、100、200 μg·mL-1進(jìn)行LPS誘導(dǎo)炎癥模型實(shí)驗(yàn)。

表4 QRF對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響（,n=5）

表4 QRF對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響（,n=5）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

QRF 的體外抗炎作用結(jié)果見表5。模型組細(xì)胞TNF?α的釋放量顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。與模型組相比，QRF 各給藥組對(duì)細(xì)胞TNF?α釋放量呈劑量依賴性降低，其中以QRF 200 μg·mL-1組最為顯著（P＜0.01）。由此可見，QRF 可抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子TNF?α的釋放。

表5 QRF對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α分泌量的影響（,n=3）

表5 QRF對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α分泌量的影響（,n=3）

注：與對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

4 討論

OA為退行性關(guān)節(jié)疾病，不同于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性狼瘡，OA不影響身體的其他器官。年齡、外傷、肥胖、發(fā)炎、勞損、遺傳、骨質(zhì)疏松及皮質(zhì)類固醇藥物治療致骨頭壞死等多種因素均可誘發(fā)OA。臨床中對(duì)于OA 的干預(yù)方式包括減輕體質(zhì)量、鍛煉、服用止痛藥或消炎藥、膝關(guān)節(jié)注射皮質(zhì)類固醇或透明質(zhì)酸、替代療法（外用辣椒素軟膏、針灸、補(bǔ)充劑包括葡萄糖胺和軟骨素）、外用支架及手術(shù)等[21]。使用的止痛藥及消炎藥多應(yīng)用非甾體類抗炎藥物、阿片類鎮(zhèn)痛藥物、對(duì)乙酰氨基酚與阿片類復(fù)方制劑等[22?23]，但非甾體類抗炎藥物、阿片類藥物不良反應(yīng)較明顯[23?24]，且使用時(shí)對(duì)患者的限制條件較多。中醫(yī)藥不良反應(yīng)相對(duì)較小，通過藥物中的多種活性成分作用于多靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，在OA 的治療過程中發(fā)揮了重要作用[25?26]。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測得出QRF 可能通過人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、熊果酸、獐牙菜苷元、山茱萸苷、馬錢苷酸、龍膽堿等活性成分，作用于IL?6、TNF、IL?1β、PTGS2等靶點(diǎn)，調(diào)控IL?17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Th17 分化、Toll 樣受體信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)OA的干預(yù)。

研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞存在的前提下，IL?6 和可溶性IL?6 受體結(jié)合，增加破骨細(xì)胞形成、分化，從而刺激骨吸收[27]。IL?1 是與軟骨破壞息息相關(guān)的細(xì)胞因子，可促進(jìn)金屬蛋白酶（MMPs）的生成，抑制金屬蛋白酶組織抑制因子?1（TIMP?1），使TIMP?1 與MMPs 處于失衡狀態(tài)，從而引起軟骨分解；另一方面，IL?1 又可刺激滑膜細(xì)胞生成、釋放脂質(zhì)類代謝物質(zhì)前列腺素E2（PGE2），引發(fā)滑膜炎癥，PGE2 反作用于IL?1，強(qiáng)化其對(duì)軟骨的分解。IL?1α和IL?1β是IL?1 的2 種不同的分子形式。在正常人軟骨細(xì)胞中，IL?1 僅存在于上層軟骨的個(gè)別細(xì)胞中，但是在OA 患者上層軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均可見強(qiáng)陽性的IL?1α和IL?1β。IL?1β刺激軟骨細(xì)胞釋放MMP?1、MMP?3 及MMP?13，這3 種蛋白酶是軟骨破壞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是與軟骨破壞息息相關(guān)的細(xì)胞因子[28]。已有研究在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中檢測到TNF?α，患者體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子，導(dǎo)致血中TNF?α、IL?6 增加，激活炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出發(fā)熱、疼痛等一系列炎癥反應(yīng)癥狀[29]。PTGS參與花生四烯酸代謝途徑。PTGS2作為前列腺素G/H合酶家族中的1 種誘導(dǎo)型同工酶，參與炎癥反應(yīng)及前列腺素類的生物合成。以上文獻(xiàn)研究表明，IL?6、IL?1β、TNF?α、PTGS2 在炎癥、軟骨關(guān)節(jié)的病理生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

IL?17 是炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，與靶細(xì)胞上受體相結(jié)合，通過NF?κB途徑，誘導(dǎo)IL?1β、IL?6、TNF?α等促炎因子的產(chǎn)生，上調(diào)NO、MMPs等水平，引發(fā)自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)等[30]。而IL?17 細(xì)胞因子為Th17 的主要效應(yīng)因子，在人體自身免疫及機(jī)體抵御病原體等各種免疫反應(yīng)中起重要作用[31]。TNF 在OA 患者的滑液、滑膜及軟骨中含量均顯著升高，TNF 可抑制軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白的合成，刺激MMP?1、MMP?3 和MMP?13 的釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL?6等活性因子[32]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）通路的活化可能參與骨破壞過程，文獻(xiàn)報(bào)道，RA 患者的免疫系統(tǒng)異常激活，體內(nèi)促炎因子、趨化因子水平升高，作用于滑膜成纖維細(xì)胞及成骨細(xì)胞，產(chǎn)生大量破骨細(xì)胞分化因子，影響破骨細(xì)胞的正常骨吸收；同時(shí)促炎因子升高致使滑膜成纖維細(xì)胞所釋放的MMP?1、MMP?3 等高表達(dá)，造成關(guān)節(jié)破壞[33]。有研究表明，TLR 依賴性途徑可激活NF?κB 和下游轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生各種破壞性介質(zhì)及自身抗體，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)功能性疼痛，結(jié)構(gòu)性的軟骨、骨畸形等一系列變化，TLR 可能是OA 與疼痛間的模式識(shí)別受體[34]。破骨細(xì)胞的生成與NF?κB 受體激活子配體（RANKL）相關(guān)，炎癥性關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的RANKL 及TNF?α、IL?1 類促炎因子，刺激破骨細(xì)胞生成，致使關(guān)節(jié)部位骨丟失，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)部位僵硬、關(guān)節(jié)變形，進(jìn)而發(fā)展為OA[35]。本研究預(yù)測出與炎癥、關(guān)節(jié)疾病、破骨細(xì)胞分化相關(guān)的多條信號(hào)通路，可為QRF 干預(yù)OA 的相關(guān)研究提供參考。

珠子參的主要活性部位是珠子參總皂苷，其中人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1等多種單體化合物已被證實(shí)具有抗炎活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Re 能抑制LPS 與TLR4 結(jié)合，以及刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NF?κB的激活，抑制炎癥因子TNF?α和IL?1β等的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[36]。人參皂苷Rb1可通過抑制IL?6、IL?1β、環(huán)氧化酶?2（COX?2）、PGE2等炎癥介質(zhì)，對(duì)單碘乙酸（MIA）所致去卵巢OA 大鼠起到軟骨保護(hù)作用[37]。人參皂苷Rg1可劑量依賴性地抑制IL?1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中MMP?13、COX?2 和PGE2 的蛋白表達(dá)，并抑制Ⅱ型膠原降解，亦可減輕前交叉韌帶橫斷（ACLT）誘導(dǎo)的OA 大鼠軟骨退行性變[38]。熊果酸是山茱萸中一類三萜化合物，為山茱萸藥物中的主要抗炎活性化合物，研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可劑量依賴性抑制酵母聚糖誘導(dǎo)的小鼠急性炎癥氣囊滲出液中PGE2 的產(chǎn)生，還能防止卡拉膠對(duì)大鼠足跖水腫的影響及醋酸所致小鼠扭體現(xiàn)象，具有抗炎、鎮(zhèn)痛功能[39]。部分研究認(rèn)為，熊果酸的抗炎機(jī)制與抑制脂氧合酶和環(huán)氧合酶活性、減少花生四烯酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥因子密不可分[40]。山茱萸、秦艽中的活性成分獐牙菜苷元亦具有抗炎活性。Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)獐牙菜苷元可顯著抑制IL?1β誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PGE2的產(chǎn)生，降低MMP?1、MMP?3 和MMP?13 mRNA 的表達(dá)，同時(shí)能夠抑制IL?1β所誘導(dǎo)的NF?κB活化，推測其抗炎活性是通過抑制NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的。龍膽堿為秦艽中主要活性成分，Kwak 等[42]研究發(fā)現(xiàn)龍膽堿可抑制LPS 誘導(dǎo)的雄性SD 大鼠血清中TNF?α、IL?6水平升高，從而減輕炎癥反應(yīng)。

分子對(duì)接構(gòu)象篩選結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得到的活性成分與靶標(biāo)蛋白結(jié)合親和力較強(qiáng)，說明QRF 中活性成分對(duì)OA 的干預(yù)可能通過調(diào)控TNF?α、IL?6、IL?1β、PTGS2 等相關(guān)因子實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步通過QRF 干預(yù)炎癥模型的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)炎癥因子TNF?α有明確的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合上述相關(guān)文獻(xiàn)研究，證實(shí)這些活性化合物可以通過對(duì)體內(nèi)炎癥因子的調(diào)節(jié)，抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程。因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測QRF 干預(yù)OA 具有一定的參考價(jià)值。

本研究仍存在一些不足之處：1）受限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析時(shí)使用的數(shù)據(jù)庫的時(shí)效性及全面性，可能存在成分及疾病靶點(diǎn)更新不及時(shí)、不全面現(xiàn)象，從而使得預(yù)測結(jié)果可能存在一定的誤差。2）在臨床治療中，中藥或制劑在體內(nèi)的相互作用機(jī)制尚不明確，無法將藥物相互作用及在體內(nèi)的反應(yīng)納入研究分析。3）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)及分子對(duì)接技術(shù)用于初步的預(yù)測、篩選，其結(jié)果還需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。后續(xù)課題組將在本課題的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測得出QRF 主要可能通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)等過程，發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)OA的作用，為QRF干預(yù)OA提供理論支撐。