CACNA1H基因敲除對小鼠孤獨(dú)癥樣行為及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

焦 翠，王儉妹，況海霞，武志紅△，柳 濤,2△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1. 兒科，2. 醫(yī)學(xué)科研中心，南昌 330006)

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)是一種較常見的影響患者一生的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，核心癥狀是社交溝通和互動不足，重復(fù)刻板行為和/或興趣狹窄。ASD在全球范圍內(nèi)普遍流行且發(fā)病率逐年上升，美國疾病預(yù)防控制中心的數(shù)據(jù)顯示其患病率約為1/59[1]，已成為全球性的難題之一。目前，ASD的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，因此缺乏特效治療且預(yù)后差，多需終生照顧，對患者家庭及社會帶來沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

ASD的發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、免疫、環(huán)境及神經(jīng)生物學(xué)等多個(gè)方面，其中遺傳因素被認(rèn)為是最主要的[2]。約30%的ASD病例被發(fā)現(xiàn)與基因的新發(fā)突變有關(guān)，已知與ASD高度相關(guān)的基因有53種，如GIGYF1、KDM6B和PTEN等[3]。CACNA1H基因位于16p13.3，其編碼的T型鈣通道3.2亞型(Cav3.2)對神經(jīng)興奮性、信息傳遞、細(xì)胞增殖分化和神經(jīng)發(fā)生等的調(diào)控極為重要[4-5]，該基因突變可影響Cav3.2功能，導(dǎo)致原發(fā)性癲癇[6]、ASD[7]和精神分裂癥[4]等神經(jīng)精神性疾病的發(fā)生。2006年，美國哈佛大學(xué)的一項(xiàng)研究對461例ASD患者進(jìn)行了CACNA1H基因組靶向測序，發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)存在錯義突變[7]。2019年的一項(xiàng)研究亦報(bào)道了1例CACNA1H基因突變的患者存在ASD和全面發(fā)育障礙[8]。既往研究結(jié)果雖已提示CACNA1H與ASD存在一定的相關(guān)性，但缺乏生物學(xué)證據(jù)和動物模型的驗(yàn)證。

樹突棘是神經(jīng)元間行使功能和信息傳遞的關(guān)鍵部位，樹突棘的形態(tài)異常在ASD病理過程中扮演著重要角色，因此，本研究利用CACNA1H基因敲除(knockout, KO)小鼠(CACNA1H-/-)及綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)記腦神經(jīng)元的Thy1-GFP-O小鼠，通過多種行為學(xué)和神經(jīng)形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法，研究CACNA1H缺失對小鼠ASD樣行為及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響，以期為ASD臨床治療和藥物開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級3～4周齡的CACNA1HKO小鼠(C57BL/6，親代購于美國Jackson公司)25只(實(shí)驗(yàn)組)，野生型(wild type，WT)小鼠(C57BL/6，親代購于上海南模生物公司)26只(對照組)，雌雄不限(雌 ∶雄≈1 ∶1)，KO小鼠在本課題組已發(fā)表的研究中多次應(yīng)用[9]。SPF級Thy1-GFP-O轉(zhuǎn)基因小鼠系南昌大學(xué)生命科學(xué)院梅林教授實(shí)驗(yàn)室贈送。動物房維持12 h/12 h晝夜循環(huán)(7:00～19:00)，室溫23～25 ℃，濕度50%，小鼠自由獲取食物和飲水。實(shí)驗(yàn)動物操作嚴(yán)格遵守《南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理辦法》，本研究通過南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審查(2017009)。

1.2 動物行為學(xué)測試

1.2.1三箱實(shí)驗(yàn) 是反映動物社交行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[10]，可測試小鼠本能的社交互動及對新社交對象識別的能力。箱體大小為60 cm×40 cm×25 cm，中間由兩塊隔板將其均分成三格。兩隔板上各開一個(gè)6 cm×6 cm的門，任小鼠自由進(jìn)出。左右箱中各放入一個(gè)金屬籠，用于放置陌生小鼠。測試方法參照文獻(xiàn)[11]：攝像頭置于盒子正上方，測試由適應(yīng)階段、社交互動階段和對新社交對象的識別階段組成，每階段為10 min，均安排在上午(8:00～12:00)進(jìn)行，每次測試前均預(yù)先適應(yīng)30 min(以下同)。實(shí)驗(yàn)鼠在箱內(nèi)自由適應(yīng)10 min后，在一側(cè)金屬籠中放入一只同性別且對于實(shí)驗(yàn)鼠是陌生的小鼠(stranger 1，S1)，另一側(cè)金屬籠不放任何物品(object，O)，觀察10 min，隨后在另一側(cè)金屬籠中放入一只同性別的、新的陌生小鼠(stranger 2，S2)，之前的S1不取出，繼續(xù)觀察10 min。每組測試結(jié)束后，用酒精擦洗盒子后再進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)鼠的檢測(下同)。對照組取9只、實(shí)驗(yàn)組取7只小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。探索偏好指數(shù)的計(jì)算：IndexS1-O=(S1-O)/(S1+O)；IndexS2-S1=(S2-S1)/(S2+S1)。

1.2.2曠場實(shí)驗(yàn) 用于觀察實(shí)驗(yàn)動物的焦慮情緒和重復(fù)刻板行為[12]。開闊曠場大小為50 cm×50 cm×25 cm，設(shè)定中心區(qū)域至邊緣為10 cm，攝像頭位于盒子正上方。測試時(shí)將實(shí)驗(yàn)鼠放在曠場中央，任其自由活動20 min。對照組取17只、實(shí)驗(yàn)組取18只小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)[因部分小鼠未記錄到20 min，自梳理行為(小鼠兩個(gè)前肢撫摸或刮擦面部、頭部或身體以及舔身體的行為)僅分析對照組15只、實(shí)驗(yàn)組12只]。觀察指標(biāo)為小鼠前10 min內(nèi)在曠場中心活動的時(shí)間、10～20 min內(nèi)自梳理行為的時(shí)間，以上兩種行為學(xué)檢測項(xiàng)目間隔1～2天進(jìn)行。

1.3 體質(zhì)量、腦質(zhì)量及腦體積測量

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，選取兩組中同窩出生的小鼠，稱取其體質(zhì)量，予腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉，用30 mL、4 ℃生理鹽水心臟灌流，斷頭取腦。濾紙上吸干后天平稱取腦組織質(zhì)量，然后放入裝有4 ℃生理鹽水的小量筒中，以液面刻度變化反映腦體積大小。

1.4 神經(jīng)元數(shù)目觀察

將上述腦組織放入10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液中固定并脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制備3 μm冠狀切片(前囟-1.64～-2.12 mm)。采用尼氏染色(Nissl staining，A、B液購于北京Solarbio公司)，染色時(shí)將切片浸入裝有cresyl violet stain試劑(A液)的染缸中，56 ℃溫箱浸染1 h，然后用去離子水沖洗數(shù)次，隨后置于Nissl differentiation液(B液)中分化數(shù)秒至2 min(背景接近于無色)，最后無水乙醇迅速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。對照組取8只、實(shí)驗(yàn)組取6只小鼠的腦組織標(biāo)本，從每個(gè)標(biāo)本中隨機(jī)選取≥3張切片于圖像導(dǎo)航掃描儀(購于日本Olympus公司)40倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)海馬CA1～CA4區(qū)及齒狀回區(qū)神經(jīng)元數(shù)目，結(jié)果以神經(jīng)元相對數(shù)量(與WT均值相比)表示。

1.5 海馬神經(jīng)元樹突棘觀察

1.5.1構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠 將成年CACNA1H雜合子小鼠與Thy1-GFP-O小鼠雜交2代以上，將獲得的子代基因型為CACNA1H-/--Thy1+(KO-GFP)的小鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，將CACNA1H+/+-Thy1+(WT-GFP)小鼠設(shè)為對照組，每組各5只。

1.5.2海馬神經(jīng)元樹突棘密度及成熟度觀察 將KO-GFP和WT-GFP小鼠麻醉后以30 mL生理鹽水和30 mL 4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛心臟灌流，取腦組織置入4%多聚甲醛中固定6 h。在振動切片機(jī)(VT1000S，購于德國Leica 公司)上制備325 μm腦冠狀切片。切片經(jīng)4%多聚甲醛固定2 h后，PBS洗3次，每次10 min。用抗熒光衰減封片劑(購于北京Solarbio公司)封片。應(yīng)用共聚焦顯微鏡(購于德國Zeiss公司)拍攝63×Zoom1.5 Z-stack疊加下海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元的二級樹突，樹突棘密度以每10 μm的樹突棘數(shù)目表示。平均每只小鼠納入計(jì)數(shù)的神經(jīng)元≥8個(gè)，每個(gè)神經(jīng)元隨機(jī)選取一段長20～50 μm的樹突進(jìn)行分析。成熟度為每段樹突上成熟型樹突棘個(gè)數(shù)與總樹突棘的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

行為學(xué)視頻采集軟件為Logitech Webcam，分析軟件為MATLAB R2016b(MathWorks)，尼氏染色結(jié)果分析軟件為Image-Pro Plus 6.0，樹突棘結(jié)果分析軟件為ZEN 2010及ImageJ，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0，作圖軟件采用GraphPad Prism 7.0和Adobe Illustrator CS5。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error, SE)表示，小鼠在三箱實(shí)驗(yàn)中不同箱中的時(shí)間比較采用Two-way方差分析，采用Tukey事后檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，其余實(shí)驗(yàn)均采用雙側(cè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CACNA1H KO小鼠社交行為學(xué)特點(diǎn)

如圖1和表1所示，在社交互動階段中，WT與KO小鼠在S1箱中的活動時(shí)間均比在O箱中長(Two-way ANOVA：F1,14=95.086，P<0.05；Tukey’s Post-Hoc test：PWT<0.05，PKO<0.05)，WT和KO小鼠對S1探索的偏好指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.044，P>0.05)。在對新社交對象的識別階段中，WT小鼠在S2箱中的活動時(shí)間比在S1箱中長，KO小鼠在S2和S1箱中的停留時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Two-way ANOVA：F1,14=18.062，P<0.05；Tukey’s Post-Hoc test：PWT<0.05，PKO>0.05)，且此階段KO小鼠對S2探索的偏好指數(shù)顯著低于WT小鼠(t=2.390，P<0.05)。

2.2 CACNA1H KO小鼠焦慮情緒及重復(fù)刻板行為學(xué)特點(diǎn)

曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠在中心區(qū)域活動的時(shí)間更少(t=2.503，P<0.05，圖2A、B，表2)，且在曠場中自梳理時(shí)間更長(t=-2.299，P<0.05，圖2C，表2)。

2.3 CACNA1H KO小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量與體質(zhì)量比、腦體積及海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)

如圖3A～D及表3所示，與WT小鼠相比，KO小鼠體質(zhì)量(t=-0.274，P>0.05)、腦質(zhì)量與體質(zhì)量比(t=0.356，P>0.05)以及腦體積(t=-0.660，P>0.05)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A and D, representative heat maps of mice movements in the sociability test session and the social novelty recognition test session in the three-chamber test, respectively; B and E, averaged time (s) spend in each chamber of WT (n=9) and KO (n=7) mice; C and F, averaged preference index from exploration time of WT (n=9) and KO (n=7) mice. KO, knockout; WT, wild type; O, object; S1, stranger 1; S2, stranger 2； M, middle. * P<0.05.圖1 CACNA1H基因敲除對小鼠社交行為的影響Figure 1 Effects of CACNA1H gene knockout on social behavior in mice

表1 WT與KO小鼠的三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of three-chamber test of WT and KO mice

A, representative track and heat maps of mice movements in the open field test; B, the time spend in the center was decreased in KO mice (n=18) compared to that of the WT mice (n=17); C, the grooming time was significantly increased in KO mice (n=12) compared to that of the WT mice (n=15). Abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.圖2 CACNA1H基因敲除對小鼠焦慮及自梳理行為的影響Figure 2 Effects of CACNA1H gene knockout on anxiety and self-grooming behavior in mice

表2 WT與KO小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of open field test of WT and KO mice

表3 WT與KO小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量/體質(zhì)量和腦體積測量Table 3 Body weight, brain weight/body weight, and brain size of WT and KO mice

尼氏染色計(jì)數(shù)結(jié)果表明，敲除CACNA1H可導(dǎo)致小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(t=2.323，P<0.05)，CA1～CA4區(qū)細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CA1：t=0.555，P>0.05；CA2：t=1.437，P>0.05；CA3：t=1.176，P>0.05；CA4：t=1.669，P>0.05)，見圖3E、F及表4。

2.4 CACNA1H KO小鼠齒狀回區(qū)樹突棘的變化

樹突棘通常分為偽足型、細(xì)長型、分叉型、蘑菇型和短粗型，前兩種為未成熟型，后三者為成熟型[13](圖4A)。兩組小鼠齒狀回區(qū)神經(jīng)元的樹突棘密度和成熟度的變化相比較(圖4B)，KO-GFP小鼠的樹突棘數(shù)目高于WT-GFP小鼠[(10.03±0.69)/(10 μm)vs.(8.32±0.20)/(10 μm),t=-2.374，P<0.05，圖4C]；兩組小鼠樹突棘成熟度比例(WT-GFP：34.40%±1.03%；KO-GFP：39.60%±2.48%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.935，P>0.05，圖4D)。

表4 WT與KO小鼠海馬區(qū)尼氏染色神經(jīng)元相對數(shù)Table 4 Relative number of neurons in the hippocampus of WT and KO mice counted by Nissl staining

3 討論

電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channel, VGCC)對調(diào)控細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，如基因表達(dá)、激素和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等過程具有重要作用[4]。目前包括CACNA1H基因在內(nèi)的所有編碼VGCC的基因均被發(fā)現(xiàn)是ASD的風(fēng)險(xiǎn)基因，其中部分VGCC亞型突變的動物模型已證實(shí)具有ASD表型，如Bader等[14]觀察到TS2-neo(Cav1.2編碼基因CACNA1C突變)小鼠具有明顯的社交功能受損、重復(fù)刻板行為、焦慮及記憶受損等ASD樣行為改變。人類基因組測序結(jié)果揭示，CACNA1H是ASD的風(fēng)險(xiǎn)基因，且電生理實(shí)驗(yàn)已證實(shí)體外培養(yǎng)的CACNA1H突變細(xì)胞的Cav3.2電流密度降低、電壓依賴性門控特性改變，從而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性降低[7-8,15-18]，表明ASD可能與CACNA1H突變導(dǎo)致Cav3.2功能低下有關(guān)。本研究在動物模型中發(fā)現(xiàn)幼年CACNA1HKO小鼠具有ASD的核心癥狀，可能與其海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少及樹突棘密度增加有關(guān)。

以往研究表明，CACNA1HKO小鼠具有異常的神經(jīng)行為表型。Gangarossa等[19]的研究顯示，8～12周齡CACNA1HKO小鼠的自發(fā)運(yùn)動功能與WT小鼠無顯著不同，但KO小鼠在曠場中心運(yùn)動的時(shí)間顯著低于同齡WT小鼠，這表明與WT小鼠相比，KO小鼠更焦慮。本研究使用3～4周齡不限雌雄的CACNA1HKO小鼠，曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Gangarossa等[19]的研究一致，表明敲除CACNA1H后，無論是幼年還是成年時(shí)期，與WT小鼠相比，KO小鼠均存在焦慮傾向，但具體所涉及的腦區(qū)及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1可在功能上特異性與哺乳動物Cav3.2耦聯(lián)，激活該受體可抑制Cav3.2而導(dǎo)致焦慮的發(fā)生[20]，這可能是CACNA1HKO小鼠具有焦慮傾向的機(jī)制之一。Henbid等[21]給具有CACNA1H錯義突變的遺傳缺失型癲癇大鼠腹腔注射Cav3拮抗劑(Z944)，發(fā)現(xiàn)該藥可逆轉(zhuǎn)其社交缺陷，表明Cav3.2有可能成為改善ASD患者社交障礙的治療新靶點(diǎn)。

A, representative brain morphology of WT and KO mice; B, the body weight of WT (n=9) and KO (n=7) mice; C, the ratio between body weight and brain weight of WT (n=9) and KO (n=7) mice; D, the brain size of WT (n=9) and KO (n=7) mice; E, representative Nissl staining figures of hippocampal sections from WT and KO mice (the white squares represent the areas for analysis); F, relative number of neurons in each subregion of the hippocampus in WT (n=8) and KO (n=6) mice, the number in the histogram represents the number of slices. DG, dentate gyrus; other abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.圖3 CACNA1H基因敲除對小鼠大腦形態(tài)及海馬神經(jīng)元數(shù)目的影響Figure 3 Effects of CACNA1H gene knockout on brain morphology and the number of neurons of the hippocampus in mice

A, classification of dendritic spines; B, photomicrographs showing representation of dendritic spines in hippocampal dentate gyrus neurons of WT-GFP and KO-GFP mice; C, CACNA1H gene knockout significantly increased the density of dendritic spines in KO mice (WT-GFP n=5, KO-GFP n=5); D, percentage of mature spines in WT-GFP (n=5) and KO-GFP (n=5) mice. The number in the histogram represents the number of segments of dendrite. GFP, green fluorescent protein; other abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.圖4 CACNA1H基因敲除對小鼠樹突棘的影響Figure 4 Effects of CACNA1H gene knockout on dendritic spines in mice

此外，CACNA1HKO小鼠的識別記憶功能也是受損的[19,22]。焦慮與記憶功能受損與ASD有一定關(guān)系，但并非其核心癥狀。社交異常和重復(fù)刻板行為是ASD的核心癥狀，在動物模型中主要由三箱實(shí)驗(yàn)和自梳理行為來評估。本研究的三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KO小鼠與WT小鼠對陌生同類S1的探索興趣均明顯多于無生命物體O，但KO小鼠對新的社會刺激S2的探索興趣明顯低于對已接觸過的社會刺激S1，證明KO小鼠的社交行為存在缺陷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)KO小鼠的自梳理時(shí)間比WT小鼠顯著增多，提示KO小鼠具有顯著的重復(fù)刻板動作。與此結(jié)果不同，Gangarossa等[19]在大理石埋藏實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)Cav3.2 KO小鼠存在重復(fù)或強(qiáng)迫行為，可能與實(shí)驗(yàn)動物的年齡不同有關(guān)。目前，CACNA1H敲除導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)ASD樣表型的具體機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。

以往研究表明，ASD患者大腦質(zhì)量、體積、神經(jīng)元數(shù)目與正常對照組相比均有顯著差異[23-24]，但本研究中，與WT小鼠相比，KO小鼠的體質(zhì)量、腦質(zhì)量和腦體積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明敲除CACNA1H對幼年期小鼠腦的大體結(jié)構(gòu)無顯著影響。小鼠行為異常往往是神經(jīng)元回路失調(diào)和突觸功能障礙導(dǎo)致的[10]。與ASD發(fā)病有關(guān)的腦區(qū)包括海馬、額葉皮質(zhì)和杏仁核等。有研究顯示，CACNA1H突變可影響正常的神經(jīng)元功能，特別是神經(jīng)發(fā)生的過程[25]。例如，Cav3.2可通過激活Caspase-3調(diào)節(jié)早期胚胎腦發(fā)育過程中的神經(jīng)祖細(xì)胞的分化[5]。在ASD中已被證實(shí)存在海馬齒狀回形成缺陷以及神經(jīng)發(fā)生失調(diào)[26-27]。由于Cav3.2在海馬齒狀回區(qū)中大量表達(dá)[28]，因此敲除CACNA1H極有可能影響齒狀回區(qū)神經(jīng)元的發(fā)生。本研究證實(shí)KO小鼠海馬齒狀回區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目明顯少于WT小鼠。

樹突棘是信號傳入的主要神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，其數(shù)量、大小和形態(tài)是決定突觸傳遞強(qiáng)度和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[29]，樹突棘數(shù)目和形態(tài)的改變是ASD的重要發(fā)病機(jī)制之一[30]。Cav3.2在樹突和樹突棘大量分布[31]，說明其與樹突結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，無論是ASD患者還是ASD模型動物均出現(xiàn)大腦樹突棘密度增加，細(xì)長型/短粗型比例降低，即不成熟型居多的現(xiàn)象[29]。2018年，Huang等[32]采用高爾基染色(Golgi staining)方法發(fā)現(xiàn)了成年CACNA1HKO小鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度比WT小鼠少。Thy1-GFP-O小鼠的皮層和海馬區(qū)域有10%～20%的興奮性神經(jīng)元高表達(dá)綠色熒光蛋白，是被廣泛應(yīng)用于樹突棘形態(tài)分析的小鼠動物模型。本研究證實(shí)幼年KO小鼠海馬齒狀回區(qū)樹突棘密度增加，這一現(xiàn)象與Huang等[32]的研究不同，可能與小鼠的年齡、研究的腦區(qū)域及研究方法不同有關(guān)，但與ASD患者大腦樹突棘改變類似[29]。因在尼氏染色中發(fā)現(xiàn)KO小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯少于WT小鼠，本研究重點(diǎn)觀察了齒狀回區(qū)神經(jīng)元的樹突棘變化，其他區(qū)域的樹突棘是否有類似變化還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)KO-GFP小鼠齒狀回區(qū)成熟與不成熟樹突棘的比例無顯著變化，表明樹突棘數(shù)目的變化可能是導(dǎo)致KO小鼠ASD樣表型的主要機(jī)制。興奮性突觸功能障礙是ASD的重要發(fā)病機(jī)制之一，今后我們將進(jìn)一步對CACNA1HKO小鼠海馬等區(qū)域神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄，觀察其樹突棘密度改變是否導(dǎo)致神經(jīng)元興奮/抑制失衡等變化。

綜上所述，本研究觀察了幼年CACNA1HKO小鼠神經(jīng)行為學(xué)、海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元及樹突棘的改變，在動物模型中證實(shí)了CACNA1H基因缺失與ASD的相關(guān)性，為后期進(jìn)一步探討CACNA1H基因缺失導(dǎo)致ASD樣表現(xiàn)的分子和細(xì)胞機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)，并為ASD相關(guān)藥物開發(fā)和臨床治療提供新的思路和線索。