葡萄炭疽病病原生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測定

孔 瓊，倪 銳，陳燦靈，薛春麗，朱天貴，李正旭，袁盛勇

（1.紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661199；2.蒙自市農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，云南蒙自 661199）

葡萄（Vitis vini feraL.）為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，用途廣，是全球最廣泛栽培的水果之一，其種植面積和產(chǎn)量居世界水果生產(chǎn)前列。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國葡萄栽培面積已超過1198.5萬畝，鮮品產(chǎn)量超過1366.9萬t[1]。目前鮮食葡萄種植是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，也是很多縣市農(nóng)民發(fā)家致富的產(chǎn)業(yè)之一[2]。但隨著葡萄大面積種植和品種的單一化，病害也隨之增多，成為葡萄生產(chǎn)上的主要問題。據(jù)課題組前期于2015—2016年在云南省蒙自市草壩鎮(zhèn)進(jìn)行葡萄病蟲害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)未套袋的“紅提”和“黑蜜”果實(shí)上炭疽病較為嚴(yán)重，其發(fā)病率高達(dá)50%，該病主要降低了果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，還造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要為害果實(shí)，同時(shí)穗軸、葉片、葉柄和新梢也會(huì)感病。其中發(fā)病果實(shí)表面產(chǎn)生褐色小斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)大形成黑褐色圓形凹陷病斑，溫度高和濕度大時(shí)，凹陷病斑處溢出粉紅色黏液，最后造成果實(shí)脫落和腐爛[3-4]。前人將其病原菌鑒定為炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）2種[5]，而我國僅有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染葡萄引起炭疽病的報(bào)道[6-8]。該病在多雨和潮濕條件下發(fā)病流行，主要于葡萄著色期開始盛發(fā)，病穗率有時(shí)高達(dá)50～70%，引起嚴(yán)重減產(chǎn)[9]。本課題組前期進(jìn)行了蒙自市葡萄病蟲害的田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)葡萄炭疽病發(fā)病較為嚴(yán)重，且將病原分離鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），但目前關(guān)于云南省蒙自市葡萄炭疽病的田間發(fā)病規(guī)律、病原菌種類等相關(guān)研究均無報(bào)道。因此本文采用葡萄炭疽病病原膠孢炭疽菌為試驗(yàn)材料，對該病原進(jìn)行生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選，為云南蒙自市葡萄炭疽病的發(fā)生規(guī)律和田間防治提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

采用組織分離法對蒙自市草壩鎮(zhèn)的帶病“黑蜜”果實(shí)（圖1-A）進(jìn)行病原菌分離，參考《植物病原真菌學(xué)》張忠義等[10]進(jìn)行形態(tài)特征觀察，并對其致病性進(jìn)行了測定，最終將其病原鑒定為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz（圖1-B）。毒力測定使用了9種殺菌劑，即10 %苯醚甲環(huán)唑（北京北農(nóng)天風(fēng)農(nóng)藥有限公司）、250 g/L吡唑醚菌酯（德國巴斯夫股份有限公司）、50 %啶酰菌胺（德國巴斯夫股份有限公司）、125 g/L氟環(huán)唑（德國巴斯夫股份有限公司）、50 %福美雙（河北贊峰生物工程有限公司）、30 %己唑醇（華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司）、25 %丙環(huán)唑（上海生農(nóng)生化制品有限公司）、250 g/L戊唑醇（安道麥馬克西姆有限公司）、80 %代森錳鋅（印度科門德國際有限公司）。

圖1 葡萄炭疽病田間癥狀及病原菌形態(tài)特征

1.2 方法

1.2.1 病原生物學(xué)特性研究

1.2.1.1 溫度對病原菌菌落生長、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量及孢子致死溫度的影響

溫度梯度設(shè)為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40 ℃，將直徑為6 mm菌絲塊接種于PSA平板中央，置于上述溫度下恒溫暗培養(yǎng)。每個(gè)處理3次重復(fù)，第7 d對菌落直徑和產(chǎn)孢量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；同時(shí)將制好的孢子懸浮液置于不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)情況[11]。

孢子致死溫度的測定：取2 mL菌懸液裝入滅菌試管中，分別在40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃、48℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃下恒溫水浴加熱15 min，取出后立即在冷水中冷卻，在干凈無菌的凹面玻璃上注入1～2滴菌液，于25 ℃下保濕培養(yǎng)，24 h后在顯微鏡下觀察并對結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.2.1.2 pH對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

用0.1 mol/L HCL或NaOH分別制成pH為3、4、5、6、7、8、9和10的PSA平板，于平板中接入菌絲塊后置于恒溫培養(yǎng)箱中（1.2.1.1中篩選出測最佳溫度）進(jìn)行生長，7 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.1.3 光周期對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

將接入PSA平板中央的菌絲塊置于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下，全日照、全黑暗、光暗交替三種光周期恒溫培養(yǎng)，于第7 d測定結(jié)果。

1.2.1.4 不同碳氮源對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢量的影響

用查彼（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以等質(zhì)量的葡萄糖和淀粉等碳源取代Czapek培養(yǎng)基中蔗糖制成含碳培養(yǎng)基；同樣以等質(zhì)量的硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏替換Czapek培養(yǎng)基中硝酸鉀制成含氮培養(yǎng)基，于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下恒溫培養(yǎng)，7 d后測量結(jié)果。

1.2.1.5 濕度對孢子萌發(fā)的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上，在室溫下自然干燥，用小容器調(diào)節(jié)法，以硫酸控制相對濕度，濕度設(shè)置為55%、65%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、98%、100%[11]。置于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下暗培養(yǎng)，24 h 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.2 病原菌室內(nèi)毒力測定

將9種殺菌劑分別配制成不同濃度的含藥PSA平板，并接入直徑為6 mm菌絲塊，設(shè)不含藥為空白對照，3次重復(fù)，于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下暗培養(yǎng)8 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算相對抑制率。公式為：相對抑制率=[(對照菌落生長直徑—處理菌落生長直徑)÷對照菌落生長直徑]×100%[12]。所得結(jié)果經(jīng)Finney幾率分析法和DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，求出各殺菌劑的毒力回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)特性

2.1.1 溫度對病原菌菌落生長、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)的影響

葡萄膠孢炭疽菌在溫度為5℃和40℃時(shí)菌絲不生長，10℃時(shí)菌絲少量生長，且無孢子產(chǎn)生（表1）。適宜菌絲生長和孢子萌發(fā)的溫度范圍為20℃～ 30 ℃，其中25℃和30℃下最高，二者之間在0.05水平下差異不顯著。在20℃～ 30℃的溫度范圍內(nèi)，病原菌的產(chǎn)孢量隨著溫度的增加而增高，且于30℃時(shí)達(dá)到最大為（2.77±0.40）×107個(gè)/mL，顯著高于其他處理。因此高溫有利于該病原菌的生長發(fā)育，且病菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的適宜溫度為20℃～30 ℃，最適溫度為30℃。

表1 溫度對病原菌菌落生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

2.1.2 孢子致死溫度

通過測定，發(fā)現(xiàn)分生孢子在40℃～ 52 ℃共計(jì)9個(gè)溫度條件下水浴15 min后，其在40℃、42℃、44℃、46℃和48 ℃下均能萌發(fā)，且萌發(fā)率呈現(xiàn)下降趨勢，分別下降了10.25%、5.23%、3.94%、3.01%和1.64%，而49℃、50℃和52 ℃下均不能萌發(fā)。因此分生孢子的致死溫度為49 ℃、15 min。

2.1.3 pH對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

由表2可看出葡萄炭疽病原菌對酸堿適應(yīng)性較強(qiáng)，菌絲能在pH值在3～10范圍內(nèi)生長，同時(shí)也有孢子產(chǎn)生。pH 為6時(shí)，菌絲生長雖然達(dá)到最大，但與pH為4和5的處理差異不顯著；而產(chǎn)孢量于pH為4的處理達(dá)到最高為（2.27±0.43）×107個(gè)/mL，顯著高于其他處理。說明該病原菌喜酸性環(huán)境。

表2 pH對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢量的影響

2.1.4 光周期對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

葡萄炭疽病病原菌在三種不同光周期處理下均能生長和產(chǎn)孢（見表3）。其中全黑暗處理下菌落生長最慢，顯著低于有光照的處理，而產(chǎn)孢量達(dá)到最大為（1.43±0.66）107個(gè)/mL，顯著高于其他兩種光周期處理。因此光照有利于菌絲的擴(kuò)展，黑暗有利于產(chǎn)孢量的增加。

表3 光周期對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

2.1.5 不同碳氮源對病原菌菌落生長及產(chǎn)孢的影響

在測試的3種碳源中，蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快和產(chǎn)孢量最高（表4）。此時(shí)菌落直徑為（5.47±0.68）cm，其次為葡萄糖和淀粉的處理，但二者差異不顯著。而在供試的6種氮源下，適合菌絲生長的氮源是蛋白胨、牛肉膏和酵母膏，其中蛋白胨的處理為最大為（6.43±0.40）cm，三種處理間差異不顯著；適合產(chǎn)孢的氮源是牛肉膏和硝酸鈉，其中牛肉膏的處理最高為（2.58±0.73）×107個(gè)/mL。因此適合病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的碳氮源是蔗糖和牛肉膏。

表4 不同碳氮源處理對膠孢炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.1.6 濕度對孢子萌發(fā)的影響

在測試的10個(gè)濕度條件下，孢子萌發(fā)率與濕度成正比關(guān)系，且高濕條件有利于孢子萌發(fā)（圖2）。當(dāng)相對濕度低于80%時(shí)，孢子不能萌發(fā)，而在80%～100%均能萌發(fā)，且隨著濕度的增加孢子萌發(fā)率增高，100%時(shí)孢子萌發(fā)率達(dá)到最高,為47%。

圖2 不同濕度對炭疽菌孢子萌發(fā)的影響

2.2 殺菌劑對病原菌的毒力比較

通過菌絲生長速率法測定發(fā)現(xiàn)，9種殺菌劑對葡萄炭疽病菌絲生長均有不同的抑制作用（表5）。其中丙環(huán)唑乳油、氟環(huán)唑水懸浮劑、苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、己唑醇水懸浮劑的抑制效果較好，其EC50均低于0.50 μg/mL，分別為0.35μg/mL、0.44μg/mL、0.45 μg/mL、0.47 μg/mL，且相關(guān)性高，適合田間用藥選擇。戊唑醇水乳劑和吡唑醚菌酯乳油的EC50介于0.50～ 1.50 ug/mL之間；而福美雙可濕性粉劑、啶酰菌胺水分散粒劑和代森錳鋅可濕性粉劑的EC50較大，介于10～ 55 μg/mL之間。

表5 9種殺菌劑對葡萄炭疽病病原的抑制結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物病害的發(fā)生流行是寄主、病原和環(huán)境互作后的結(jié)果，因此病原菌生物學(xué)特性與病害發(fā)生發(fā)展有著緊密聯(lián)系。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類寄主廣泛的植物病原真菌，目前有600余種，多發(fā)生于高溫濕熱地區(qū)，主要引起葉斑、枝枯、爛果等，造成減產(chǎn)。其中較為常見的致病種是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[13-14]。本研究從云南葡萄種植產(chǎn)區(qū)蒙自市的葡萄炭疽病標(biāo)本上分離鑒定出其病原菌為膠孢炭疽菌，該菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的溫度范圍為20℃～30℃，且最適溫度為25℃，而產(chǎn)孢適宜溫度相對較高為30℃，分生孢子致死溫度為49 ℃、15 min；喜高濕環(huán)境，孢子萌發(fā)相對濕度要求高于80%；光照有利于菌絲的擴(kuò)展，黑暗有利于產(chǎn)孢量的增加；這些與董陽輝等和趙杰等對葡萄炭疽病生物學(xué)特性測定中溫度、濕度和光照等影響因素結(jié)果相似[15-16]。但與王培松等[17]對山東煙臺(tái)葡萄炭疽菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果略有差異，可能是同一病原菌存在不同的生態(tài)適應(yīng)性。不同酸堿環(huán)境和營養(yǎng)條件對葡萄膠孢炭疽菌生長也有較大影響。本文中病原菌菌落生長的適宜pH范圍較大，其菌絲生長最適pH為6，產(chǎn)孢最佳pH為4，喜酸性環(huán)境；適宜病菌菌絲生長和產(chǎn)孢的碳源和氮源是蔗糖和牛肉膏，而無機(jī)氮源的促進(jìn)生長效果不佳；相似的結(jié)果也表現(xiàn)于董陽輝等和趙杰等對葡萄炭疽病生物學(xué)特性測定中[14-15]。因此該病易在高溫、高濕和酸性環(huán)境（果實(shí)著色期）下侵染和發(fā)生，這與葡萄炭疽病易發(fā)生流行于蒙自市草壩鎮(zhèn)的5月下旬葡萄收獲季節(jié)的天氣條件相一致。

關(guān)于葡萄炭疽病的防治主要還是化學(xué)防治，目前主要采用三唑類甾醇脫甲基抑制劑咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑，以及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯等多種藥劑交替使用[18-21]。本文采用菌絲生長速率法測定了9種殺菌劑對葡萄炭疽病病原膠孢炭疽菌的毒力情況，發(fā)現(xiàn)丙環(huán)唑、氟環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑和己唑醇抑菌活性很高，EC50分別為0.35μg/m、0.44μg/m、0.45μg/m、0.47μg/mL。因此，在防治葡萄炭疽病時(shí)，上述所測定的4種三唑類甾醇脫甲基抑制劑是值得推薦的殺菌劑，其次是有機(jī)硫類的福美雙和煙酰胺類的啶酰菌胺等。若要將本文的研究結(jié)果應(yīng)用于田間，還需要進(jìn)一步的盆栽防治試驗(yàn)，或者將上述6種不同類型的藥劑混配篩選，才能進(jìn)行該病害的有效防控。