竹子基因資源和應(yīng)用技術(shù)研究進(jìn)展

徐丹丹，李新林，鄧偉芬，蔣思媛，任慧敏， 王安可，杜旭華，柳參奎，亓果寧*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300； 2.龍泉市林業(yè)事務(wù)中心，浙江 麗水 323700； 3.國家林業(yè)和草原局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012)

竹子是多年生禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，世界上擁有80多屬1 600多種竹類植物，多生長(zhǎng)在氣候溫暖濕潤的地區(qū)。當(dāng)前世界竹林面積約2 200萬hm2，而我國擁有其中四分之一左右的竹林面積[1]，因此竹類植物在我國素有“第二森林”之稱。竹子作為我國最重要的經(jīng)濟(jì)林木之一，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、用途廣等特點(diǎn)。竹林還具有很強(qiáng)的固碳能力，能穩(wěn)定大氣中二氧化碳含量，是我國碳中和的重要載體[2]，竹子因此具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。但是在竹子研究生產(chǎn)的過程中發(fā)現(xiàn)竹子開花發(fā)育不穩(wěn)定，導(dǎo)致其遺傳改良進(jìn)展緩慢。目前在眾多竹種中，只有毛竹(Phyllostachysedulis)和麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)公布了染色體級(jí)別的基因組圖譜[2-3]，其余竹種的基因組仍在開拓研究中，加之竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立十分緩慢，很大程度上限制了竹子種質(zhì)資源的創(chuàng)新。

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者在竹子基因組、再生和轉(zhuǎn)化體系等方面進(jìn)行了深入研究，并取得了一定的進(jìn)展，基于此，該文對(duì)竹子基因組、功能基因、組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化和應(yīng)用前景等進(jìn)行綜述，總結(jié)了目前研究存在的問題，并提出可能的解決方案，為現(xiàn)代竹子種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 竹子組學(xué)研究進(jìn)展和關(guān)鍵功能基因的挖掘

1.1 竹子組學(xué)研究進(jìn)展

基于竹子重要的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，通過組學(xué)方法解析其生物學(xué)特性的研究結(jié)果也在日益增加。2013年P(guān)eng Z H等完成了對(duì)毛竹的基因組測(cè)序，該測(cè)序結(jié)果公開了1個(gè)高質(zhì)量的毛竹基因組序列草圖，2.05-Gb的基因集覆蓋了95 %的基因組區(qū)，95%以上區(qū)域的高質(zhì)量序列由毛竹基因組150倍覆蓋率的原始序列組裝，組裝scoffolds N50長(zhǎng)度超過328 kb，其中包含32 000個(gè)約占毛竹基因總數(shù)90%的基因[3]。2017年，Zhao H S等啟動(dòng)了竹和藤基因組圖譜(Genome Atlas of Bamboo and Rattan，GABR)項(xiàng)目，GABR的核心項(xiàng)目之一是Bamboo-T1K(1 000種竹子的轉(zhuǎn)錄組)，通過采集不同國家不同區(qū)域的竹子和藤樣本并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，最終生成了大規(guī)模的組學(xué)數(shù)據(jù)，以此推動(dòng)基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究到應(yīng)用基因工程的竹藤基因組研究。截止目前已經(jīng)采集了從馬來西亞、加納、肯尼亞、埃塞俄比亞、巴西和中國的許多地方約340種竹子和2種藤樣本。其中有超過300種竹子和2種藤將被測(cè)序[4]。Zhao H S等在2018年將毛竹基因組完善至高精度的染色體水平，提供了毛竹染色體水平的從頭基因組組裝scoffolds N50長(zhǎng)度達(dá)到79.90 Mb，約為之前版本的243倍的基因組數(shù)據(jù)。除此之外，還鑒定出51 074個(gè)結(jié)構(gòu)完整的高質(zhì)量蛋白質(zhì)編碼位點(diǎn)。在對(duì)26個(gè)具有代表性的竹子組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)在25 225個(gè)選擇性剪接(Alternative Splicing，AS)基因中鑒定了266 711個(gè)獨(dú)特的AS事件，從而提供了1個(gè)全面的AS圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，在竹類植物中，AS作為1個(gè)重要的生物過程，AS基因集中在更保守的基因中，這些基因具有更高的轉(zhuǎn)錄水平，組織特異性差異較大[5]。在2021年，Zhao H S等從覆蓋15個(gè)代表性地理區(qū)域的427毛竹個(gè)體的全基因組重測(cè)序中獲得545萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)，以此獲得了毛竹基因組變異圖譜，并對(duì)9個(gè)重要的性狀、形態(tài)學(xué)特征、物理(密度)和機(jī)械性能相關(guān)性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以識(shí)別候選基因[6]。Yu X L等通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)確認(rèn)了毛竹10 376個(gè)預(yù)測(cè)編碼基因，蛋白質(zhì)組分析還揭示了1 015個(gè)預(yù)測(cè)長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的蛋白質(zhì)編碼潛力，占注釋lncRNA的51.03%。因此，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)為基因注釋提供了可靠的方法[7]。

除毛竹外，研究學(xué)者還對(duì)麻竹開展了研究，早在2011年Gao Z M等已經(jīng)以麻竹幼葉為材料構(gòu)建歸一化cDNA文庫，共獲得9 574個(gè)高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags，ESTs)，其中unigenes 5 317個(gè)，contigs 1 502個(gè)，singletons 3 815個(gè)[8]。2012年Liu M Y等對(duì)麻竹進(jìn)行了從頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，建立了1個(gè)完整的數(shù)據(jù)集，測(cè)序產(chǎn)生了15 138 726個(gè)reads，將它們組裝到103 354個(gè)scaffolds后共鑒定到68 229個(gè)unigenes，這些麻竹特有的基因有助于更好地了解麻竹的基因多樣性[9]。Zhao H S等則在2013年獲得了麻竹的11 513 607個(gè)原始序列reads，鑒定出了81個(gè)新miRNAs，獲得了162個(gè)潛在靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)是植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，通過對(duì)miRNAs的鑒定為麻竹及相關(guān)物種的研究提供了理論基礎(chǔ)[10]。Guo Z H等還構(gòu)建了1種六倍體麻竹的高密度遺傳連鎖圖譜[11]。Tu M等對(duì)麻竹愈傷組織芽器官發(fā)生的5個(gè)階段的組織樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得了73 209個(gè)高質(zhì)量的非冗余性轉(zhuǎn)錄本亞型，長(zhǎng)度主要在1 000～3 000 bp之間。同時(shí)還預(yù)測(cè)了72 576個(gè)編碼序列(CDSs)，N50值為1 176 bp，相關(guān)蛋白序列為68 269個(gè)，該數(shù)據(jù)為后續(xù)麻竹的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供有價(jià)值的資源[12]。Zheng Y S等在2022年首次破譯并組裝獲得染色體水平的六倍體麻竹分型基因組，大小為2 737 Mb，contig N50和scoffolds N50分別為2.57和4.5 Mb。該研究將麻竹組裝成3個(gè)分型亞基因組(AABBCC)，共注釋了135 231個(gè)蛋白質(zhì)編碼位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)兩套分型染色體之間存在大量單核苷酸變異(SNVs)和插入缺失標(biāo)記(InDels)，該結(jié)果為深入研究亞基因組的進(jìn)化關(guān)系及等位基因特異性表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。這一高質(zhì)量的六倍體基因組和全面的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集將為以麻竹為模式物種進(jìn)行竹子研究奠定基礎(chǔ)[2]。

Li W等在2021年發(fā)布了高質(zhì)量的二倍體草本竹子(Raddiadistichophylla)589 Mb全基因組草圖，測(cè)序共產(chǎn)生了253.94 Gb的短測(cè)序reads，contigs和scoffolds的N50長(zhǎng)度分別為86.36 kb和1.81 Mb，共注釋了30 763個(gè)基因，平均轉(zhuǎn)錄本大小為2 887 bp，該竹子基因組序列將為全球竹子物種的生物研究、種質(zhì)保護(hù)等提供新的見解[13]。

基于目前數(shù)個(gè)竹種基因組數(shù)據(jù)的公布，研究學(xué)者們?cè)诖嘶A(chǔ)上不斷開展對(duì)竹子基因家族鑒定和特性研究，比如細(xì)胞壁生物合成關(guān)鍵基因家族HCT(hydroxycinnamoyl-CoA, shikimate/quinate)和 CCR(cinnamoyl CoA reductase)[3]、萌發(fā)延遲(Delay of Germination1，DoG)家族[14]、 泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，UBP)等基因家族[15]。竹子基因家族的鑒定與研究為竹子品種創(chuàng)新提供了候選基因和理論支撐，有利于推動(dòng)竹子種質(zhì)資源的發(fā)展。雖然目前有了毛竹和麻竹的基因組數(shù)據(jù)，但對(duì)龐大的竹子家族而言竹子的基因組學(xué)仍需要不斷地研究和完善，隨著新測(cè)序技術(shù)的不斷更新，基因組學(xué)相關(guān)研究實(shí)現(xiàn)快速發(fā)展，以高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的各種組學(xué)研究廣泛應(yīng)用于竹子等植物的各個(gè)領(lǐng)域。測(cè)序技術(shù)的成熟加上測(cè)序成本的降低，越來越多的竹子品種的基因信息被破解。而竹子的全基因組測(cè)序工作仍需繼續(xù)推進(jìn)，毛竹等竹種的功能基因組學(xué)研究遠(yuǎn)不及水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等農(nóng)作物，因此建立1種包含基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等相關(guān)數(shù)據(jù)的綜合性數(shù)據(jù)庫顯得尤為重要。

1.2 竹子關(guān)鍵功能基因

基于毛竹和麻竹基因組數(shù)據(jù)的公布，在其各自生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因陸續(xù)被鑒定出來，以下針對(duì)已有的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)。

1.2.1毛竹莖竿快速生長(zhǎng)相關(guān)基因 竹子具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高和材性好等諸多特性，是可快速補(bǔ)充的可再生資源，可作為木材的良好替代品。作為速生樹種，竹子具有比普通樹種高35%的吸收二氧化碳和釋放氧氣的能力，對(duì)環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要，在實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰碳中和中具有至關(guān)重要的作用。為了更好地運(yùn)用竹子的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，該文整理和總結(jié)了近年來竹子快速生長(zhǎng)方面的研究成果。根據(jù)前人研究可知竹子的快速生長(zhǎng)與光合作用、油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)生物合成和苯丙素生物合成有關(guān)。大多數(shù)竹種都有木質(zhì)化的高大莖竿，竹子木質(zhì)莖的快速生長(zhǎng)可視為竹子的重要特性。Jin G H等在毛竹的進(jìn)化過程發(fā)現(xiàn)竹系特有的1 622個(gè)基因，這些基因被稱作“孤兒基因(特有新基因)”，“新基因”與表達(dá)分化的全基因組加倍(WGD)基因都在莖竿快速生長(zhǎng)模塊中高度表達(dá)，說明毛竹的快速生長(zhǎng)受到這些基因的影響[16]。天門冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteases，APs)是一類天門冬肽酶，Wang X Q等研究發(fā)現(xiàn)毛竹中的AP基因(PhAPs)表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式，并可能通過整合光和赤霉素等環(huán)境信號(hào)影響毛竹快速生長(zhǎng)，包括細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)[17]。Huang B等發(fā)現(xiàn)PeLBDs基因在竹筍快速生長(zhǎng)過程中表達(dá)，PeLBD20、PeLBD29、PeLBD46、PeLBD10、PeLBD38和PeLBD06的表達(dá)與竹筍的快速生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)。其中正相關(guān)性關(guān)系最顯著的是PeLBD20和PeLBD38，推測(cè)它們?cè)诿窨焖偕L(zhǎng)期起著重要的生物學(xué)作用[18]。Zhang Z J等發(fā)現(xiàn)PeDoG基因家族也與毛竹早期枝條的快速生長(zhǎng)有關(guān)[14]。Huang B等發(fā)現(xiàn)毛竹的熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor，HSF)PeHsfs在芽快速生長(zhǎng)過程中特異表達(dá)[19]。Niu L Z等以蕓香竹(Boniaamplexicaulis)作為研究對(duì)象，揭示了DNA甲基化在調(diào)節(jié)竹筍快速生長(zhǎng)中的重要性，并表明DNA甲基化與木本竹的發(fā)育時(shí)間或年齡有關(guān)。Guo X Q等從毛竹中分離出了9個(gè)酸性轉(zhuǎn)化酶(Acid invertases，INVs)，包括7個(gè)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶(PhCWINV1—7)和2個(gè)液泡酸性轉(zhuǎn)化酶(PhVINV11、PhVINV12)。酶活性分析發(fā)現(xiàn)INV活性在快速生長(zhǎng)的組織，如莖節(jié)間的延伸部位顯著升高，且分別在持續(xù)表達(dá)PhCWINV1、PhCWINV4和PhCWINV7的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)中其株高明顯高于對(duì)照植株，說明INVs能促進(jìn)植株株高的生長(zhǎng)，因此猜測(cè)INVs在竹子的快速生長(zhǎng)方面也發(fā)揮著一定作用[20]。同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子KNOX(KNOTTED1-likehomeobox)通過調(diào)控靶基因來維持分生組織中的激素，在毛竹莖竿的快速生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。劉青等克隆了麻竹DlKNOX基因，發(fā)現(xiàn)DlKNOX在節(jié)部的表達(dá)豐度最高，為日后進(jìn)一步研究DlKNOX在麻竹莖竿發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)[21]。Wei Q等通過轉(zhuǎn)錄組和qPCR分析發(fā)現(xiàn)在孝順竹(Bambusamultiplex)中糖分可能通過抑制蔗糖非發(fā)酵-1基因(sucrose non-fermenting 1，BmSnf1)的表達(dá)來促進(jìn)節(jié)間的快速生長(zhǎng)[22]。以上研究，為后續(xù)深入探索毛竹快速生長(zhǎng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為培育竹子新品種提供了候選基因。此外，單堿基甲基化分析揭示全基因組DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化和木本竹子莖部的快速生長(zhǎng)具有相關(guān)性[23]。

1.2.2毛竹木質(zhì)化相關(guān)基因 木質(zhì)素屬于次生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重要組成部分，羥基肉桂酰輔酶a(hydroxycinnamoyl-CoA，shikimate/quinate，HCT)和肉桂酰輔酶a還原酶(cinnamoyl CoA reductase，CCR)家族蛋白作為關(guān)鍵酶可以催化苯丙素途徑產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素[3]。Wang J L等認(rèn)為在毛竹中，苯丙素中間體可能通過苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)或者4-香豆酸輔酶a連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase ，4CL)的催化作用轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素或類黃酮。推測(cè)PAL和4CL可能在該轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[24]。NAC(NAM，ATAF和CUC)轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括芽頂端分生組織的形成和維持、激素信號(hào)、細(xì)胞分裂，尤其是調(diào)控次生細(xì)胞壁(Secondary Wall，SCW)的合成[25]。Shan X M等通過對(duì)毛竹NAC家族的研究，發(fā)現(xiàn)了毛竹PeNAC8、PeNAC36和PeNAC73作為轉(zhuǎn)錄激活因子可能通過調(diào)控細(xì)胞次生壁合成參與木質(zhì)化過程[25]。Que F等研究發(fā)現(xiàn)PeTALEs(Transcription Activator Like Effectors，TALE)在毛竹次生細(xì)胞壁的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，該基因家族PeBLH11、PeKNOX11、PeKNOX13、PeKNOX2、PeKNOX3、PeKNOX5、PeKNOX7和PeKNOX9可能參與了快速生長(zhǎng)階段次生細(xì)胞壁木聚糖合成的調(diào)控[26]。Yang Y等研究發(fā)現(xiàn)尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(Uridine diphosphate glucose dehydrogenases，UGDHs)是毛竹細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵酶，該酶的編碼基因是PeUGDH4[27]。毛竹木質(zhì)化的研究，為進(jìn)一步探究竹子快速生長(zhǎng)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)代謝過程的相關(guān)性提供參考。

1.2.3竹子花發(fā)育相關(guān)基因 竹子開花期不穩(wěn)定，頻率低，且大多數(shù)竹子開花后集體枯萎，這會(huì)導(dǎo)致竹林面積減少，竹子產(chǎn)量降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境破壞。因此，研究參與竹子開花發(fā)育的關(guān)鍵基因十分必要。在該文中我們對(duì)目前已有的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)。張穎研究發(fā)現(xiàn)毛竹PheDof-1(DNA binding with one finger，Dof)在花發(fā)育的早期具有很高的表達(dá)，其中PheMADS-14在毛竹花器官中表達(dá)最為明顯[28]。Peng Z H等發(fā)現(xiàn)在開花基因網(wǎng)絡(luò)中，開花關(guān)鍵基因CONSTANS和花途徑整合因子(Floral Pathway Integrator，F(xiàn)PI)的調(diào)控序列中發(fā)現(xiàn)插入片段，導(dǎo)致其表達(dá)量降低，毛竹長(zhǎng)時(shí)間營養(yǎng)繁殖導(dǎo)致花發(fā)育遲緩[3]。Dutta S等發(fā)現(xiàn)bZIP家族BtFD1參與了花和營養(yǎng)發(fā)育，而且對(duì)開花具有正向調(diào)控作用。BtFD1的組成型表達(dá)導(dǎo)致植株矮化，花梗長(zhǎng)度和花/植株數(shù)明顯減少，表明BtFD1基因的及時(shí)表達(dá)可能是其在植物中發(fā)揮程序性發(fā)育作用的關(guān)鍵[29]。Hou D等從綠竹(B.oldhamii)中鑒定到1個(gè)SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1)基因過表達(dá)抑制子BoMADS50，BoMADS50在成熟葉片和花原基形成時(shí)期高表達(dá)，BoMADS50與BoAP1蛋白在調(diào)控綠竹開花過程中具有協(xié)同作用。與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)BoMADS50和BoMADS50-1/2/3/4可能是該竹重要的正開花調(diào)節(jié)因子[30]。Dutta S等發(fā)現(xiàn)毛竹中可能存在CONSTANS(CO)-FLOWERINGLOCUST(FT) CO，F(xiàn)T基因拷貝數(shù)的增加和表達(dá)差異的增加在光周期介導(dǎo)的竹子開花過程中起著重要作用[31]。Zhang Y T通過對(duì)毛竹的MADS-box基因在花器官和葉片中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)PeMADS5作為開花激活因子，參與了毛竹的開花過程[32]。Huang B等發(fā)現(xiàn)PeLBD12、PeLBD44、PeLBD30和PeLBD22在毛竹圓錐花序中顯著高表達(dá)，提示它們可能參與了毛竹花的發(fā)育。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了在花中特異表達(dá)基因PeLBD25[18]。Huang B等基于熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factors，HSF)在毛竹不同組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)許多PeHsfs在穗部表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，這些PeHsfs基因可能參與了毛竹穗部發(fā)育[19]。在麻竹中，高志民等發(fā)現(xiàn)麻竹DlMADS18可能參與其開花時(shí)間的調(diào)控[33]。陳東亮研究發(fā)現(xiàn)DlAP2可能具有促進(jìn)麻竹開花的功能[34]。Fan H J等則通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)DlFT1在麻竹中表達(dá)顯著上調(diào)，而DlFT1的表達(dá)受DlCO1調(diào)控，提示麻竹中可能存在CO-FT調(diào)控模塊，這些結(jié)果表明DlFT1是1個(gè)具有促花功能的候選基因[35]。Cheng Z C等人發(fā)現(xiàn)毛竹Phe-miR159通過調(diào)控AtMYB33表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)花藥內(nèi)皮層次生增厚相關(guān)基因表達(dá)，最終影響花藥開裂[36]。以上研究對(duì)未來竹子花發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵功能基因挖掘提供了研究方向。

1.2.4竹子生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(Growth-Regulated Factors，GRFs)在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中有著重要作用。Shi Y N等從毛竹基因組中鑒定了18個(gè)GRF基因，并從中篩選出了在不同組織中表達(dá)水平較高的基因PeGRF11[37]。Guo Z H等在木本竹子中發(fā)現(xiàn)類SOC1基因的缺失/故障、PRR(Pseudo-Response Regulator)基因的正向選擇以及GA(Gibberellin)通路關(guān)鍵酶編碼基因的拷貝數(shù)變異共同調(diào)控了木本竹子的營養(yǎng)生長(zhǎng)期[11]。在毛竹的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中，細(xì)胞分裂在毛竹生長(zhǎng)前期發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)胞伸長(zhǎng)則在生長(zhǎng)后期起著主要作用。Li L等研究發(fā)現(xiàn)在毛竹生長(zhǎng)發(fā)育過程中，E2F/DP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞周期的表達(dá)起著調(diào)控作用，并且當(dāng)毛竹受到非生物脅迫時(shí)，PheE2F/DPs的表達(dá)水平顯著升高，說明毛竹可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控響應(yīng)非生物逆境[38]。泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Proteases，USPs)是去泛素酶中最大的一類，調(diào)控植物的發(fā)育和脅迫反應(yīng)。Wu R H等發(fā)現(xiàn)在毛竹葉片PeUBP大部分基因出現(xiàn)高表達(dá)，說明PeUBP可能參與了葉片的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。Huang B等研究發(fā)現(xiàn)毛竹HSF在穗和嫩枝中大都有很高的表達(dá)，說明它們可能在毛竹的生殖生長(zhǎng)和嫩枝的快速生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用[19]。磷脂酰-乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族對(duì)毛竹地上分枝和地下側(cè)芽的發(fā)育均有調(diào)控作用[19]。Zhao J W等研究后發(fā)現(xiàn)PheTFL9、PheTFL2和PheTFL8可能通過激活休眠芽而促進(jìn)毛竹生長(zhǎng)發(fā)育[39]。

隨著麻竹基因組數(shù)據(jù)的公布，調(diào)節(jié)麻竹生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因也有所研究。Qiao G R等通過對(duì)麻竹基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)EXPB3和TCP可能在細(xì)胞分裂和分化中起調(diào)節(jié)作用[40]。赤霉素(Gibberellic Acid，GAs)在植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。目前已經(jīng)從麻竹中成功分離獲得GAs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因DlmDELLA[41]。之后Jin K M等在麻竹基因組中鑒定到66個(gè)編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子的基因，并在DlTCPs的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了與生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，而且DlTCPs在嫩枝和葉片中表達(dá)較高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DlTCP12-C是OsTB1的同源基因，是側(cè)芽出芽的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，對(duì)腋芽發(fā)育和側(cè)枝生長(zhǎng)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[42]。

1.2.5其它關(guān)鍵功能基因 對(duì)于竹子而言，它們的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種因素的影響，例如溫度，水分和生物脅迫等。Cheng X R等在毛竹中鑒定到35個(gè)三螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Trihelix Transcription Factors，TTFs)，其中PeTT19和PeTT35在葉片中均有高表達(dá)，推測(cè)這2個(gè)基因與氣孔或光合作用相關(guān)；PeTTF27表達(dá)受SA、ABA和MeJA顯著誘導(dǎo)；部分PeTTFs在干旱和鹽脅迫下表達(dá)變化明顯，暗示這些基因在毛竹響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[43]。Ma R F等發(fā)現(xiàn)毛竹鋅指轉(zhuǎn)錄因子PeYABBYs含有大量的激素響應(yīng)元件和應(yīng)激響應(yīng)元件，包括GA響應(yīng)元件(GAREs)、厭氧響應(yīng)元件(ARE)等，說明PeYABBYs基因可能參與植物激素的響應(yīng)過程。研究發(fā)現(xiàn)在毛竹生長(zhǎng)發(fā)育過程中YABBY高度富集并參與植物葉片發(fā)育[44]。Jin K M等發(fā)現(xiàn)所有的膨脹蛋白PeEXs都有ABA響應(yīng)元件，尤其是PeEXPA1、PeEXPA20、PeEXPB5和PeEXLA4，這些基因在非生物脅迫下可能積極參與相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，其中PeEXPA19與ABA響應(yīng)密切相關(guān)[45]。Wang T T等發(fā)現(xiàn)PeGATAs與毛竹非生物脅迫有關(guān)，可能對(duì)赤霉素和脫落酸有響應(yīng)，PeGATA9與竹子根莖細(xì)胞生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，而側(cè)芽的細(xì)胞生長(zhǎng)則受到PeGATAs的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[46]。Wu M等對(duì)毛竹WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行了全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)PeWRKY83是通過調(diào)控脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ABA合成在耐鹽性中發(fā)揮積極作用[47]。PheWRKY72-2可能通過作為氣孔關(guān)閉的正向調(diào)節(jié)因子來增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的耐受性[48]。在PeLBDs啟動(dòng)子中含有MYB結(jié)合位點(diǎn)，參與干旱、高鹽和低溫反應(yīng)的誘導(dǎo)[18]。Zhang Z J等發(fā)現(xiàn)PeDoGs作為bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控Polarlike1 (PL1)基因的表達(dá)在毛竹中發(fā)揮疾病應(yīng)答作用[14]。Wu R H等對(duì)所有PeUBP基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了許多與ABA、MeJA和SA相對(duì)應(yīng)的順式調(diào)控元件，表明PeUBPs在植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用[15]。擬南芥在茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)處理下可導(dǎo)致在植物防御中發(fā)揮重要作用的硫代葡萄糖苷(glucosinolate)水平的升高。PeIQDs在PEG和MeJA處理下均被增加或抑制，推測(cè)毛竹IQD基因在抵御食草性昆蟲和干旱脅迫方面可能具有類似的生物學(xué)功能[49]。Huang B等對(duì)PeHsf啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)毛竹HSFs的表達(dá)受植物發(fā)育過程和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)順式元件的調(diào)控，熱響應(yīng)是PeHsf蛋白的主要功能，PeHsf轉(zhuǎn)錄因子還參與大分子生物合成、RNA生物合成、氮化合物代謝、細(xì)胞生物合成、初級(jí)代謝以及RNA代謝過程的調(diào)控[19]。Xiang M Q等對(duì)麻竹的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)玉米leafcolor(Lc)基因，可以獲得花青素水平顯著提高的麻竹轉(zhuǎn)基因株系，從而提高了麻竹對(duì)低溫和干旱脅迫的耐受性[50]。

2 竹子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系研究現(xiàn)狀

2.1 竹子組織培養(yǎng)研究

竹子組培研究起步始于1968年，但研究進(jìn)展相對(duì)遲緩，直到20世紀(jì)80年代國外學(xué)者才較為系統(tǒng)地進(jìn)行了竹子組織培育研究的工作。通過組培方式進(jìn)行竹子培育, 被認(rèn)為是中國加快發(fā)展竹子生產(chǎn)的一個(gè)新途徑[51]。近年來，叢生竹類竹子組織培養(yǎng)的研究成果約占90%，散生竹和混生竹也有不少研究報(bào)道。該綜述以不同竹種為研究對(duì)象，對(duì)現(xiàn)有竹子組織培養(yǎng)的科學(xué)研究工作進(jìn)行了總結(jié)，進(jìn)一步革新了竹子培育技術(shù)和優(yōu)化竹子培育方法, 為后續(xù)竹子再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的完善提供參考，為竹子的合理利用提供理論基礎(chǔ)，以更好地實(shí)現(xiàn)竹子的生態(tài)、社會(huì)價(jià)值和效益[52]。

研究者們目前已經(jīng)建立了包括以筍用為主的筍用竹[53]、常綠小喬木多花山竹子(Garciniamultiflora)[54]、混生竹類矢竹(Pseudosasajaponica)[55]；散生竹類黃甜竹(Acidosasaedulis)[56]、毛竹[57]、雷竹(Ph.violascens‘Prevernalis’)[58]、佛肚毛竹(Ph.edulisf.ventricosa)[57]；叢生竹類曙箣竹(Sasaversicolor)[59]、馬來甜龍竹(D.asper)[60]、糯竹(Cephalostachyumpergracile)[61]、孝順竹[62]、慈竹(B.emeiensis)[63]、巨龍竹(D.sinicus)[64]、版納甜龍竹(D.hamiltonii)[65]等竹種完整的再生體系。以上研究大大推動(dòng)了竹子的培育進(jìn)程。

2.2 竹子組織培養(yǎng)影響因素

竹子再生是無性繁殖的過程[66]。該文從不同方面歸納總結(jié)了不同竹種的組織培養(yǎng)再生體系，包括竹子外植體的選擇、培養(yǎng)基種類、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與添加物和抑制褐化方式等。

(1)外植體：外植體的選擇是開展竹子組織培養(yǎng)的第一步，已有研究表明，種子、播種苗枝條、以芽繁芽、胚培養(yǎng)、芽尖、根等許多組織或器官都可以作為竹子進(jìn)行組織培養(yǎng)的外植體。不同的竹種選取的外植體種類不同，多數(shù)采用幼嫩莖段、成熟的種胚和嫩芽為再生的材料，它們具有快速長(zhǎng)成根狀莖或者迅速再生的優(yōu)勢(shì)。此外，有一些竹種采用其它材料作為外植體，如王曙光對(duì)巨龍竹開展研究后發(fā)現(xiàn)種胚和小穗莖節(jié)更合適作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織[64]。喬桂榮以麻竹花藥為外植體，成功誘導(dǎo)出了體胚并直接分化成苗[67]。以上研究表明了不同竹種組織培養(yǎng)選擇外植體不同，合適的外植體能快速促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)育。

(2)培養(yǎng)基：植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基是影響再生體系是否成功的重要因素之一。目前，大多數(shù)竹子組培的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基，也有一些竹種采用1/2 MS和3/4 MS培養(yǎng)。唐磊研究發(fā)現(xiàn)以圣音竹(Ph.edulisf.tubaeformis)當(dāng)年生嫩芽為外植體時(shí)，最適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3/4 MS，新萌發(fā)嫩芽則采用1/2 MS[68]，江濤研究發(fā)現(xiàn)毛竹幼芽在MS1培養(yǎng)基上擴(kuò)繁和分化效果最好[69]。覃和業(yè)等對(duì)麻竹生根培養(yǎng)基的研究發(fā)現(xiàn)，1/2 MS為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的生根苗移栽成活率均在80%以上，總體上優(yōu)于MS培養(yǎng)基[70]。

(3)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與添加物：生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響植物愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。通過對(duì)已發(fā)表的竹子整個(gè)組織培養(yǎng)過程的研究和歸納，發(fā)現(xiàn)IBA、2,4-D、NAA等生長(zhǎng)素使用廣泛，6-BA、KT是常用的細(xì)胞分裂素。竹子不同的組織培養(yǎng)時(shí)期，培養(yǎng)基使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物也不同。以黃甜竹為例，王舒對(duì)不同時(shí)期組織培養(yǎng)基的成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)添加2,4-D、6-BA、KT的培養(yǎng)基是最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基添加6-BA、KT、TDZ、NAA，叢生芽增殖和再生植株生根的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也有所不同[56]。江濤研究發(fā)現(xiàn)毛竹在MS+3 mg·L-1NAA條件下愈傷組織生根比率最高，達(dá)到(47.71±3.98)%[69]。徐振國等為了提高麻竹的扦插生根率，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加泥炭，激素選擇為NAA，激素濃度處于40～80 mg·L-1時(shí)扦插苗各指標(biāo)最佳；泥炭+生根粉ABT+80 mg·L-1NAA為最佳處理組合[71-72]。

(4)褐化：褐化是影響組織培養(yǎng)效果的重要影響因素之一，嚴(yán)重的褐化會(huì)導(dǎo)致組培材料的死亡。因此，研究學(xué)者對(duì)如何減少褐化問題開展了許多研究，發(fā)現(xiàn)抑制褐化可以采用抗氧化劑、改變光照和溫度等方法。不同的竹種抑制褐化采取的措施不同，趙康對(duì)佛肚毛竹防褐化研究中發(fā)現(xiàn)接種前用100 mg·L-1的半胱氨酸浸泡種胚，在培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1抗壞血酸后置于黑暗環(huán)境培養(yǎng)能有效地抑制褐化現(xiàn)象[57]。而唐磊對(duì)圣音竹的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中同時(shí)添加100 mg·L-1PVP和40 mg·L-1Vc后可以有效地抑制褐化，使褐化率降低到16%[68]。

總體來說，竹子組織培養(yǎng)體系已經(jīng)越來越完善，但是依然存在一些難以解決的問題，如組培材料的污染是最常見的問題，在外植體初培養(yǎng)階段最容易污染，造成的原因可能是材料帶菌，也有可能是接種污染，因此組織培養(yǎng)的第一步就需要做到盡可能無菌。褐化和玻璃化也是組培過程中常見的問題，造成褐化的原因有很多，包括非酶促褐變和酶促褐變，“玻璃化”是組織培養(yǎng)過程中特有的1種生理失調(diào)或生理病變[52]，為了解決這類問題還需進(jìn)一步改善培養(yǎng)基的配方。

2.3 竹子遺傳轉(zhuǎn)化研究

隨著毛竹基因組和麻竹基因組數(shù)據(jù)的公布，與竹子重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因陸續(xù)被挖掘，建立完善高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于研究竹子關(guān)鍵基因的生理功能顯得尤為重要。隨著不同竹種組織培養(yǎng)技術(shù)體系的不斷完善，目前已經(jīng)有許多研究學(xué)者發(fā)表了竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系，推動(dòng)竹子種質(zhì)資源的創(chuàng)新研究。植物遺傳轉(zhuǎn)化最常見的技術(shù)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，例如麻竹[73]、馬來甜龍竹[60]等大多數(shù)竹種已經(jīng)建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系。諸葛菲通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功培養(yǎng)了具有花青素合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因的馬來甜龍竹芽尖愈傷組織[60]。張寧采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化版納甜龍竹抗性愈傷組織獲得了轉(zhuǎn)基因的白化苗，愈傷組織和再生苗通過檢測(cè)證明GUS基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入版納甜龍竹[65]。張玲等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得表達(dá)codA基因的麻竹轉(zhuǎn)基因植株，提高了麻竹的耐低溫能力[73]。但是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受到眾多因素的影響，比如菌株侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等。為了構(gòu)建更加高效穩(wěn)定的竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究學(xué)者探索出了新的方法并通過實(shí)踐得以驗(yàn)證。諸葛菲采用基因槍介導(dǎo)法將綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)導(dǎo)入馬來甜龍竹芽尖愈傷組織中[60]。CRISPR/Cas9等第三代基因編輯技術(shù)是1種高效的基因位點(diǎn)特異性編輯技術(shù)，但在竹子中的應(yīng)用少之又少。葉善汶完善了毛竹的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化相關(guān)體系，成功驗(yàn)證CRISPR/Cas9體系可以應(yīng)用于毛竹原生質(zhì)體[74]。之后Ye S W等對(duì)竹子原生質(zhì)體中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，利用玉米UBI作為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)構(gòu)建了UBI-Cas9/OsU6b-sgRNA，應(yīng)用于麻竹內(nèi)源基因編輯。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)六倍體麻竹進(jìn)行了基因改造，在第一代轉(zhuǎn)基因株系中獲得了純合子突變，得到一株株高改變的竹子突變體。2022年Huang B Y等首次建立了毛竹的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以毛竹未成熟胚為外植體誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織分化，在此基礎(chǔ)上，利用PeU3.1 snRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA表達(dá)，在毛竹中實(shí)現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9的基因組編輯，這些技術(shù)體系將有利于毛竹重要基因的生理功能驗(yàn)證[75]。以上這些證明CRISPR/Cas9在竹子中的適用性，一定程度上促進(jìn)了未來竹子功能基因的研究和育種[76]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，竹子轉(zhuǎn)基因體系也不斷更新和進(jìn)步，但不同竹種遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立仍存在許多難題。目前最新獲得的毛竹遺傳轉(zhuǎn)化體系以胚作為外植體材料，存在如果胚齡過小，幾乎透明，沒有明顯的芽點(diǎn)，而高成熟度胚難以從硬胚乳和種皮中分離出來等問題[75]。雖然麻竹、毛竹等竹種的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，但仍有大部分竹種的遺傳轉(zhuǎn)化體系還在探索中，研究學(xué)者也在尋找除了傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方式之外的新方法。對(duì)于難以再生的竹種，可根據(jù)竹子體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率高低的類型構(gòu)建再生植株；也可以通過優(yōu)化轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及人工培養(yǎng)條件采用基因編輯技術(shù)等構(gòu)建竹子的遺傳轉(zhuǎn)化體系，竹子原生質(zhì)體—原生質(zhì)體融合—原生質(zhì)體復(fù)壁成細(xì)胞團(tuán)—植株再生的實(shí)驗(yàn)路線，也是有效改進(jìn)竹子遺傳育種技術(shù)的手段[66]。綜上所述，竹子組織離體培養(yǎng)再生的過程既受到外部環(huán)境的影響，又受到竹子自身?xiàng)l件的制約。如何不斷完善竹子遺傳轉(zhuǎn)化體系，為竹子種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供更多高效途徑是未來研究的重點(diǎn)。

3 應(yīng)用與展望

如今，竹子的基因組和關(guān)鍵功能基因的挖掘越來越多，但仍存在欠缺，包括至今只有毛竹、麻竹有發(fā)布相關(guān)基因組，其余很大一部分竹種還在探索中，未來需要不斷完善已公布的竹種基因組和研究發(fā)現(xiàn)新的竹種基因組，這將會(huì)是一項(xiàng)巨大的工程。其次，對(duì)竹子關(guān)鍵基因的挖掘還需進(jìn)一步拓展，某些關(guān)鍵功能基因還未被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，而竹子功能基因的驗(yàn)證需要運(yùn)用遺傳轉(zhuǎn)化體系，目前已經(jīng)有許多研究學(xué)者開展了新的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，包括采用竹子花葉病毒、納米材料和花粉等遺傳轉(zhuǎn)化的方法。關(guān)于納米材料和花粉以及花葉病毒的應(yīng)用已經(jīng)有研究學(xué)者在其它物種中開展研究，且已發(fā)表了系統(tǒng)的文章和方法。Kwak S Y等在擬南芥中實(shí)現(xiàn)了用納米顆粒介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)基因的方式，葉綠體轉(zhuǎn)化不存在外源基因向雜草親屬擴(kuò)散的問題，可以作為成熟植物的一種轉(zhuǎn)化方式[77]。Li S J等發(fā)表了1種運(yùn)用納米孔的方法來確定大豆基因中插入玉米Ds轉(zhuǎn)座子，這種方法同樣適用于其它生物體，該方法還可以用靶向單個(gè)轉(zhuǎn)基因的探針定位植物體內(nèi)插入的轉(zhuǎn)基因，是一種有效的轉(zhuǎn)基因方式[78]。Lv Z Y等報(bào)道了1種新的轉(zhuǎn)基因方式，通過花粉轉(zhuǎn)染，將外源基因成功地轉(zhuǎn)入了玉米自交系，并成功表達(dá)，其后代同時(shí)還具有高度的遺傳穩(wěn)定性，為以胚芽進(jìn)行基因編輯育種材料的遺傳轉(zhuǎn)化提供了借鑒[79]。Zhao X等利用磁場(chǎng)轉(zhuǎn)染花粉，將外源DNA附在具有磁性的納米顆粒上，通過磁場(chǎng)傳遞到花粉中進(jìn)行授粉，獲得轉(zhuǎn)基因植株使得后代帶有目標(biāo)基因，該方法對(duì)新品種的育種有很大的參考意義[80]。Bouton C等研究出利用狐尾花葉病毒(Potexvirus)作為載體，在插入目標(biāo)基因后GFP可以在小麥和玉米中瞬時(shí)表達(dá)[81]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，未來有望將這些新技術(shù)應(yīng)用到竹子遺傳轉(zhuǎn)化中。

因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，我們可以通過借鑒和參考，推動(dòng)為竹子種質(zhì)創(chuàng)新研究的新發(fā)展。提高測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)、建立系統(tǒng)完善的組織培養(yǎng)體系、創(chuàng)新轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及探索現(xiàn)代竹子應(yīng)用新方向是今后的研究重點(diǎn)。竹子是目前研究的熱門植物，未來對(duì)于竹子種質(zhì)創(chuàng)新的研究將會(huì)越來越進(jìn)步和完善。