南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺增生及抗氧化能力的影響

解雙瑜，孫 波，張 宇，高 峰，劉東傲，彭 媛，趙子偉

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.寶清縣科技促進(jìn)中心，黑龍江 雙鴨山 155600)

前列腺增生是老年男性常見疾病之一，為前列腺的一種良性病變。近年來，南瓜籽因具有緩解前列腺增生的功效而受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，而南瓜籽甾醇是南瓜籽中重要的活性成分。研究表明，植物甾醇對(duì)前列腺組織具有保護(hù)作用，如：對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎有明顯的抑制作用[1]；松花粉總甾醇[2]和油菜花粉甾醇[3]對(duì)由丙酸睪酮誘導(dǎo)的大鼠前列腺增生具有明顯的改善作用。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)[4]，植物甾醇可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)兩種關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)鞘磷脂循環(huán)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而改善前列腺增生。植物甾醇能夠通過阻止細(xì)胞周期G0向G1階段轉(zhuǎn)化從而抑制細(xì)胞分裂，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]，以此改善前列腺增生的癥狀[7]。植物甾醇還具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)抑制5-α還原酶的活性，進(jìn)而阻止睪酮轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的雙氫睪酮的作用[8]。此外，植物甾醇還具有抗氧化、抗癌、抗炎癥及抗菌等功效[9-11]。

大鼠前列腺增生癥狀的變化常常伴隨著體內(nèi)抗氧化能力的變化[12-14]。有學(xué)者提出前列腺增生的發(fā)生和發(fā)展可能與機(jī)體抗氧化能力有關(guān)[15-16]。研究表明，前列腺增生患者體內(nèi)的各種抗氧化酶活性明顯降低，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。由于機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的降低，導(dǎo)致·OH的積累，·OH結(jié)合并氧化DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，造成氧化損傷。氧化損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞突變，增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)[17]。目前國(guó)際上常用的代表生物體內(nèi)抗氧化能力的指標(biāo)主要包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等。其中T-AOC代表生物體的總抗氧化能力，是生物體內(nèi)酶與非酶抗氧化能力的總和[18]。SOD則是生物體內(nèi)存在的一種超氧自由基清除因子，可以將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，進(jìn)而消除自由基對(duì)組織細(xì)胞的氧化攻擊[19-20]。而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸使脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其具有細(xì)胞毒性，會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死[21]。

因此,本文將提取純化的南瓜籽甾醇作用于丙酸睪酮誘導(dǎo)后構(gòu)建的前列腺增生大鼠模型，研究其對(duì)大鼠前列腺增生及抗氧化能力的影響，以期為今后南瓜籽深加工以及南瓜籽功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體重為140～160 g，由黑龍江省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)基地提供。

1.1.2 原料與試劑

寶清大白板南瓜籽，由黑龍江省雙鴨山市寶清縣白瓜籽交易大市場(chǎng)提供。

丙酸睪酮注射液(25 mg/mL)，寧波第二激素廠；實(shí)驗(yàn)鼠專用糧，遼寧省沈陽(yáng)市前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠；前列腺酸性磷酸酶(PACP)測(cè)試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99%)與樺木醇內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇，天津市康科德科技有限公司；氫氧化鈉，天津市大陸化學(xué)試劑廠；正己烷，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250，合肥博美生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GC-2010pro氣相色譜儀(配有氫火焰離子化檢測(cè)器)，日本島津公司；CZR 309型榨油機(jī)，廣州萬(wàn)彪通用設(shè)備有限公司；Sigma 3-18K低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA 2004型電子天平，上海橫平儀器儀表廠；XW-80A旋渦混合器，上海弛唐電子有限公司；RE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河南省泰斯特儀器有限公司；101-0A鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜籽甾醇的制備

1.2.1.1 南瓜籽甾醇的提取與純化

南瓜籽甾醇的提取與純化參照張宇等[22]的方法進(jìn)行。

1.2.1.2 南瓜籽甾醇組分測(cè)定

南瓜籽甾醇組分測(cè)定參照GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定 氣相色譜法》進(jìn)行。

1.2.2 大鼠前列腺增生模型的建立

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間大鼠自由飲水與進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為5組，每組10只，并編號(hào)分籠。其中1組為對(duì)照組，另外4組構(gòu)建前列腺增生模型。

造模方法：每天按5 mg/kg的劑量對(duì)所有需要造模的大鼠皮下注射丙酸睪酮注射液，連續(xù)注射28 d，對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水[23]。造模期間大鼠自由飲水與進(jìn)食。

1.2.3 大鼠分組與給藥

將造模后的4組大鼠分為模型組，南瓜籽甾醇低劑量組、中劑量組、高劑量組；南瓜籽甾醇低、中、高劑量組分別按每天80、160、320 mg/kg劑量灌胃南瓜籽甾醇，模型組和對(duì)照組按160 mg/kg的劑量灌胃生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)28 d。給藥期間大鼠自由飲水與進(jìn)食。

1.2.4 大鼠指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 前列腺指數(shù)的測(cè)定

所有大鼠在末次給藥后斷食24 h，稱重后立即處死，摘取其眼球采全血，解剖并摘取前列腺組織。將前列腺組織用冰生理鹽水洗凈并吸干表面水分，用精密天平(0.000 1 g)稱取前列腺組織質(zhì)量，計(jì)算前列腺指數(shù)[24]。

(1)

式中：PI為前列腺指數(shù)；m為前列腺組織質(zhì)量，mg；M為大鼠體重，g。

1.2.4.2 前列腺組織切片觀察

取大鼠前列腺組織左葉用10%的中性福爾馬林固定液固定，石蠟包埋后切片，HE染色，并用光學(xué)顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4.3 前列腺 PACP、T-AOC、SOD、MDA的測(cè)定

將大鼠全血在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min制備血清，測(cè)定其PACP活性。取大鼠前列腺組織右葉加入9倍預(yù)冷后的生理鹽水置于勻漿機(jī)中勻漿，然后將勻漿液在4℃、2 500 r/min條件下離心10 min制備上清液，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、T-AOC水平、SOD活性、MDA含量。上清液蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定[25]，PACP活性、T-AOC水平、SOD活性、MDA含量參照測(cè)試盒說明書采用比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜籽甾醇的組分

表1為南瓜籽甾醇各組分在總甾醇中的所占比例。

表1 南瓜籽甾醇各組分及所占比例

由表1可知，在南瓜籽甾醇中共檢測(cè)出7種組分，其中β-谷甾醇所占比例最高，為71.80%，其次為菜油甾醇，所占比例為7.73%。

2.2 大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)

南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的影響見表2。

表2 南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺濕重

由表2可以看出，模型組的前列腺濕重與前列腺指數(shù)顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。從前列腺濕重和前列腺指數(shù)數(shù)值來看，南瓜籽甾醇高劑量組<南瓜籽甾醇中劑量組<南瓜籽甾醇低劑量組。南瓜籽甾醇高劑量組的前列腺濕重、前列腺指數(shù)與模型組相比具有顯著性差異(p<0.05)。

2.3 大鼠PACP活性

南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺酸性磷酸酶(PACP)的活性影響見表3。

表3 南瓜籽甾醇對(duì)大鼠PACP活性的影響

由表3可以看出：模型組的PACP活性顯著高于對(duì)照組(p<0.05)；南瓜籽甾醇低劑量組的PACP活性與模型組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)；南瓜籽甾醇中、高劑量組的PACP活性均顯著低于模型組(p<0.05)。PACP是由成熟的前列腺上皮細(xì)胞合成及分泌的一種糖蛋白，經(jīng)前列腺管道進(jìn)入精囊，由尿道排出。當(dāng)前列腺發(fā)生病變時(shí)，病變的細(xì)胞產(chǎn)生的PACP由于無(wú)導(dǎo)管或腺體導(dǎo)管被破壞，故直接被吸收入血循環(huán)，而導(dǎo)致血清PACP活性升高，常用于診斷前列腺癌和預(yù)估后期治療效果[26]。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大鼠前列腺增生模型建立成功，前列腺組織細(xì)胞受到損傷，南瓜籽甾醇則有改善這種損傷的作用。

2.4 大鼠前列腺組織抗氧化能力

南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺組織抗氧化能力的影響見表4。

由表4可以看出，模型組的T-AOC水平、SOD活性顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，MDA含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。南瓜籽甾醇中、高劑量組的T-AOC水平、SOD活性均顯著高于模型組(p<0.05)。南瓜籽甾醇高劑量組的T-AOC水平、SOD活性顯著高于中劑量組(p<0.05)。南瓜籽甾醇高劑量組的MDA含量顯著低于模型組(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠前列腺增生模型的建立過程中，不僅降低了其組織的抗氧化能力而且還有大量的細(xì)胞被損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過氧化反應(yīng)加??；而南瓜籽甾醇在一定程度上具有提高其抗氧化能力、緩解細(xì)胞損傷的作用。

表4 南瓜籽甾醇對(duì)大鼠前列腺組織抗氧化能力的影響

2.5 大鼠前列腺組織切片

大鼠前列腺組織石蠟切片HE染色圖片見圖1。

圖1 大鼠前列腺組織石蠟切片HE染色圖片

由圖1可以看出，對(duì)照組的前列腺組織細(xì)胞呈立方形整齊排列，表面光滑無(wú)褶皺，腺腔沒有擴(kuò)張現(xiàn)象，腺上皮與間質(zhì)細(xì)胞組織未見增生。模型組、南瓜籽甾醇低劑量組中，前列腺組織細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則排列，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)乳頭狀突出，表面褶皺，腺腔擴(kuò)張，腔內(nèi)積存大量液體，腺上皮增厚，伴隨間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生。南瓜籽甾醇中、高劑量組中，前列腺組織細(xì)胞呈不規(guī)則排列，表面褶皺，但乳頭狀突出減少，腺腔擴(kuò)張程度縮小，腔內(nèi)積存液體量減少，腺上皮增厚及間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生程度均有所減輕，且高劑量組的效果更明顯。

3 結(jié) 論

南瓜籽甾醇在一定程度上具有改善大鼠前列腺增生及提高大鼠前列腺組織抗氧化能力的作用。結(jié)合本研究中南瓜籽甾醇組分的檢測(cè)分析結(jié)果，推測(cè)β-谷甾醇可能是南瓜籽甾醇中發(fā)揮主要作用的成分，因?yàn)棣?谷甾醇的抗氧化能力阻止了大鼠前列腺組織中細(xì)胞的自由基損傷，間接起到了改善前列腺增生的作用。然而，迄今為止前列腺增生的發(fā)病機(jī)制仍未闡述清楚，所以南瓜籽甾醇對(duì)前列腺增生的改善作用是否與其抗氧化能力有關(guān)仍有待進(jìn)一步深入研究。