酶輔助三相分離法同時提取亞麻籽油、亞麻籽蛋白和亞麻籽膠工藝優(yōu)化

姚思含，廖敏和,2,3，康佳欣,2,3，魏子凱,2，劉 寧,2,3，任皓威,2,3

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部乳品重點實驗室，哈爾濱 150030； 3.哈爾濱騰凝科技有限公司，哈爾濱 150010)

亞麻(LinumzustitatissimumL.)，又稱胡麻，屬亞麻科、亞麻屬，為一年生草本植物[1]。亞麻按用途一般分為油用型亞麻、纖用型亞麻和油纖兼用型亞麻，是我國重要的經(jīng)濟農(nóng)作物之一[2]。亞麻籽為亞麻的種子，呈扁卵形，顏色有褐色、棕褐色和淡黃色之分。亞麻籽中脂肪含量為35%～45%，粗蛋白質(zhì)含量為20%～30%，膳食纖維含量大于20%，還含有木酚素、酚酸、植物甾醇、礦物質(zhì)和維生素等微量營養(yǎng)素[3-4]，具有減少心血管疾病[5-7]和抑制癌癥[8]等功能。亞麻籽油中50%以上的脂肪酸為α-亞麻酸(C18∶3)和亞油酸(C18∶2)[9]，這兩種必需脂肪酸能在人體肝臟內(nèi)去飽和酶和鏈延長酶的作用下合成二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等長鏈多不飽和脂肪酸。亞麻籽膠主要由酸性多糖和中性多糖組成，并且作為一種新型的天然功能性膠體，可代替果膠、阿拉伯膠和明膠作為乳化劑、增稠劑和穩(wěn)定劑，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中；此外，亞麻籽膠具有減輕體重、調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血糖及膽固醇等生理功能[10]。研究表明亞麻籽蛋白及其多肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、抗菌、抗糖尿病等多種生理功效[11]，具有開發(fā)潛力和研究價值。

目前亞麻籽油的提取方法主要有壓榨法[12-13]、超聲波輔助有機溶劑提取法[14]、超臨界CO2萃取法[15]、水酶法[16]和三相分離法(TPP)[17]等。水酶法是利用生物酶酶解油料種子堅硬的細胞壁和脂類復(fù)合物(脂蛋白和脂多糖)釋放油脂，具有設(shè)備簡單、產(chǎn)品質(zhì)量高、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點[16]。三相分離法是一種能將原料中的蛋白質(zhì)、脂肪和糖類同時分離為三相(脂肪處于上層，蛋白質(zhì)處于中層，糖類處于下層)[18-19]的方法，目前已被廣泛用于多種植物原料和藻類中油脂的提取[20]，蛋白質(zhì)的提取[21-22]和糖類的純化[23]；但利用TPP對原料中的油脂、蛋白質(zhì)和糖類進行同時提取鮮有報道。因此，本研究結(jié)合水酶法提取和三相分離法的優(yōu)點，利用酶輔助三相分離法(EATPP)同時提取亞麻籽中的油脂、蛋白質(zhì)和膠，并以亞麻籽油提取率為指標通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗優(yōu)化了提取工藝條件，為亞麻籽油、亞麻籽蛋白和亞麻籽膠的提取提供參考，也為亞麻籽的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

隴亞9號和定亞18號亞麻籽，武威西涼蔬菜種苗有限公司；隴亞10號亞麻籽，蘭州金橋種業(yè)有限公司；纖維素酶(比活力400 U/mg，最適溫度40～60℃，最適pH 4.0～5.5)、果膠酶(比活力30 U/mg，最適溫度50℃，最適pH 2.5～6.0)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶(比活力200 U/mg，最適溫度40～50℃，最適pH 6.5～8.5)，北京博奧拓達科技有限公司；無水乙醚(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；叔丁醇，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；磷酸氫二鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖，濟南蕭試化工有限公司；苯酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍G-250，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機、DK-98-1 電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫干燥箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津市賴玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；TGL-23高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；YRE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10酸度計，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；D-8 紫外-可見分光光度計，南京菲勒儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽的前處理

稱取適量亞麻籽，過篩，除去灰塵和不飽滿顆粒，放進高速粉碎機粉碎，每粉碎1 min后冷卻機器2 min再繼續(xù)粉碎，防止因機器溫度過高而對亞麻籽中的功能成分含量和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。最后將粉碎后的亞麻籽粉放進烘箱50℃下熱風(fēng)干燥3 h，備用。

1.2.2 亞麻籽基本成分的測定

粗脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016中索氏抽提法；粗蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5—2016中燃燒法；總糖含量的測定參照GB/T 15672—2009；水分含量測定參照GB 5009.3—2016中直接干燥法；灰分含量測定參照GB 5009.4—2016中總灰分的測定方法。

1.2.3 EATPP同時提取亞麻籽油、亞麻籽蛋白和亞麻籽膠

取3 g亞麻籽粉加入到50 mL中離心管，加入10 mL纖維素酶和果膠酶的混合酶，使用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為5.0，然后放入50℃培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩一段時間，取出后再加入堿性蛋白酶，使用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為8.0，同樣放入50℃培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩一段時間后加入適量叔丁醇和硫酸銨，在一定溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩一段時間，然后在25℃下以10 000 r/min離心5 min，得到分層的三相。

用吸管吸取上層有機層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收叔丁醇后，在真空干燥箱中烘干，得亞麻籽油。

取中間相，用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液溶解，在4℃下靜置24 h后取上清液，使用截留分子質(zhì)量為8～14 kDa的透析袋透析72 h，以除去小分子雜質(zhì)，真空冷凍干燥后得到亞麻籽蛋白。

取最下層，過濾除雜后使用截留分子質(zhì)量為8～14 kDa的透析袋透析72 h，真空冷凍干燥后得到亞麻籽膠。

1.2.4 亞麻籽油提取率的測定

按式(1)計算亞麻籽油提取率(Y1)。

(1)

式中：m為亞麻籽油質(zhì)量；m0為亞麻籽的粗脂肪質(zhì)量。

1.2.5 亞麻籽蛋白的蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍法[24]測定蛋白質(zhì)含量。

標準曲線繪制：配制0.1 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)標準溶液，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL BSA標準溶液并定容至1.0 mL，得到系列質(zhì)量濃度的BSA標準溶液。1.0 mL蒸餾水作為空白對照；分別加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液，快速混勻后室溫靜置3 min；然后在595 nm波長處測定吸光值。以BSA標準溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，吸光值(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到蛋白質(zhì)標準曲線回歸方程為y=5.952 9x+0.000 5，R2=0.999 7。

樣品的測定：稱取10 mg亞麻籽蛋白，蒸餾水溶解定容得1.0 mg/mL亞麻籽蛋白溶液，取1.0 mL按標準曲線方法測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算亞麻籽蛋白的蛋白質(zhì)含量，并按式(2)計算亞麻籽蛋白提取率(Y2)。

(2)

式中：FP1為EATPP提取得到的亞麻籽蛋白中蛋白質(zhì)質(zhì)量；FP2為亞麻籽的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.2.6 亞麻籽膠提取率的測定

參照文獻[25]使用硫酸-苯酚法測定亞麻籽膠含量，其中所得標準曲線方程為y=7.207 8x+0.002 5，R2=0.999 6，并按式(3)計算亞麻籽膠提取率(Y3)。

(3)

式中：FG1為提取得到的亞麻籽膠中亞麻籽膠質(zhì)量；FG2為亞麻籽的總糖質(zhì)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有測定重復(fù)3次，實驗結(jié)果均以“平均值±標準偏差”表示，使用IBM SPSS Statistics 25進行單因素方差分析(ANOVA)，并用Duncan法進行數(shù)據(jù)顯著性分析，P<0.05說明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽的基本成分(見表1)

表1 3種亞麻籽的基本成分及含量 %

從表1可以看出：3種亞麻籽的粗脂肪含量均大于40%，且隴亞9號的粗脂肪含量顯著高于其他兩種亞麻籽(P<0.05)；3種亞麻籽的粗蛋白質(zhì)和總糖的含量均高于20%，水分和灰分含量均小于5%。以上結(jié)果表明亞麻籽具有脂肪、蛋白質(zhì)和總糖含量高和無機物含量低的特點。本研究測定的亞麻籽粗脂肪含量略高于禹曉等[26]測定的不同品種的亞麻籽，而總糖和粗蛋白質(zhì)含量略低于禹曉等[26]的測定結(jié)果。

2.2 EATPP單因素實驗

以隴亞9號亞麻籽為原料，亞麻籽油提取率為指標，通過單因素實驗分析6個因素的變化對亞麻籽油得率的影響，其中，酶添加量(纖維素酶與果膠酶、堿性蛋白酶比例1∶1∶1)以酶活性/亞麻籽質(zhì)量(U/g)表示；酶解時間為3種酶總的酶解時間，且纖維素酶-果膠酶與堿性蛋白酶酶解時間比例為1∶1；叔丁醇用量以叔丁醇體積/亞麻籽質(zhì)量(mL/g)表示；硫酸銨用量以硫酸銨質(zhì)量/亞麻籽質(zhì)量(g/g)表示。采用單一變量原則，6個單因素的固定水平為：酶添加量300 U/g，酶解時間3 h，叔丁醇用量3 mL/g，硫酸銨用量1.5 g/g，三相提取溫度40℃，三相提取時間3 h。

2.2.1 酶添加量對亞麻籽油提取率的影響(見圖1)

圖1 酶添加量對亞麻籽油提取率的影響

從圖1可以看出：與未添加酶比較，酶的添加使亞麻籽油提取率顯著提高了5.34～24.00百分點(P<0.05)，這是由于纖維素酶和果膠酶可以水解亞麻籽細胞壁的纖維素和果膠成分，破壞細胞壁后可以使細胞內(nèi)油脂更大程度地溶解于有機溶劑叔丁醇中；而堿性蛋白酶可以水解蛋白脂肪復(fù)合物，釋放出游離脂肪，從而提高油脂提取率。在100～400 U/g的范圍內(nèi)隨著酶添加量增加亞麻籽油提取率提高，而在酶添加量達到500 U/g時，亞麻籽油提取率稍微降低(P>0.05)。因此，選擇最佳的酶添加量為400 U/g。

2.2.2 酶解時間對亞麻籽油提取率的影響(見圖2)

圖2 酶解時間對亞麻籽油提取率的影響

從圖2可以看出：隨著酶解時間延長，亞麻籽油提取率先升高，在2 h時達到最大值，為(82.02±1.03)%；然后在3～5 h內(nèi)提取率先減小后增大，雖然5 h時的提取率相對4 h時顯著提高，但是與3 h時的提取率差異并不顯著(P>0.05)。因此，最佳酶解時間選擇2 h。

2.2.3 叔丁醇用量對亞麻籽油提取率的影響(見圖3)

圖3 叔丁醇用量對亞麻籽油提取率的影響

從圖3可以看出，叔丁醇用量對亞麻籽油提取率影響顯著(P<0.05)，隨著叔丁醇用量從1 mL/g增加到4 mL/g，亞麻籽油提取率從(49.52±2.12)%增加到(84.37±1.07)%，然后在叔丁醇用量為5 mL/g時亞麻籽油提取率又顯著降低至(79.86±1.21)%。叔丁醇用量過高不僅影響三相分離效果，而且還有可能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[27]，所以控制叔丁醇用量不僅可以保護蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不被破壞，而且能節(jié)省提取成本。因此，最佳的叔丁醇用量為4 mL/g。

2.2.4 硫酸銨用量對亞麻籽油提取率的影響(見圖4)

圖4 硫酸銨用量對亞麻籽油提取率的影響

從圖4可以看出，亞麻籽油提取率隨著硫酸銨用量的增加顯著提高(P<0.05)，在硫酸銨用量為2.0 g/g時提取率最高，為(83.32±1.04)%，之后隨著硫酸銨用量繼續(xù)增加，亞麻籽油提取率有所降低，這與之前的研究結(jié)果基本一致[17,24,28]。硫酸銨作為一種中性的硫酸鹽，濃度較高可以增加滲透壓力，對植物細胞膜產(chǎn)生沖擊力，使得細胞變得通透甚至破裂，促使細胞內(nèi)部的油脂體的釋放以及鹽離子與蛋白質(zhì)電荷的結(jié)合使其加速沉淀[29]，從而提高亞麻籽油提取率并促進三相的形成。但過量的硫酸銨會使蛋白質(zhì)變性，不利于油脂的溶出，從而降低油脂提取率[30]。因此，最佳的硫酸銨用量為2.0 g/g。

2.2.5 三相提取溫度對亞麻籽油提取率的影響(見圖5)

圖5 三相提取溫度對亞麻籽油提取率的影響

從圖5可以看出，隨著三相提取溫度從30℃升高到45℃，亞麻籽油提取率從(71.49±1.31)%顯著增加到(82.33±1.53)%，之后隨著三相提取溫度的繼續(xù)升高，亞麻籽油提取率稍有下降(P>0.05)。有研究表明在TPP反應(yīng)中，溫度的升高可以增加蛋白質(zhì)在體系中的溶解度，促進脂肪在有機溶劑中的溶解并且還有助于植物細胞破裂和質(zhì)量傳遞[31]，但是溫度過高也會導(dǎo)致三相界面層的蛋白質(zhì)在其他兩相中重新溶解而影響油脂提取率[30]。綜合考慮，選擇最佳的三相提取溫度為45℃。

2.2.6 三相提取時間對亞麻籽油提取率的影響(見圖6)

圖6 三相提取時間對亞麻籽油提取率的影響

從圖6可以看出，隨著三相提取時間的延長亞麻籽油提取率顯著增加，提取4 h時亞麻籽油提取率達到最高，為(83.53±1.19)%，之后隨著三相提取時間的繼續(xù)延長，亞麻籽油提取率下降，但無顯著性差異。因此，最佳的三相提取時間為4 h。

2.3 EATPP響應(yīng)面實驗

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，固定酶解時間為2 h，三相提取溫度為45℃，三相提取時間為4 h，以酶添加量、叔丁醇用量和硫酸銨用量為因素，亞麻籽油提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10軟件，進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，共計17組，響應(yīng)面實驗因素與水平見表2，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面實驗因素與水平

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表3

2.3.2 二次項模型的建立和方差分析

對表3中響應(yīng)面實驗結(jié)果進行回歸擬合，得到酶添加量(A)、叔丁醇用量(B)和硫酸銨用量(C)與亞麻籽油提取率(Y)回歸方程：

Y=88.78+1.75A-0.27B+0.48C+0.12AB-0.64AC-0.11BC-2.53A2-1.03B2-1.61C2

該回歸方程中的3個一次項系數(shù)中有2個正值和1個負值，表明酶添加量和硫酸銨用量對亞麻籽油提取率有協(xié)同作用，而叔丁醇用量對亞麻籽油提取率有拮抗作用[32]。該模型的方差分析見表4。

表4 模型的方差分析

模型的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.907 8，變異系數(shù)為1.21%，表明方程擬合程度高，離散程度低。由表4 可以看出，模型的F值為7.65，P<0.05，說明模型具有較好的顯著性。失擬項P>0.05，說明實驗結(jié)果與該模型的差異程度不顯著。根據(jù)F值的大小可以得到影響亞麻籽油提取率大小的因素主次順序為酶添加量>硫酸銨用量>叔丁醇用量。根據(jù)AB、AC和BC的P值均大于0.05，說明三個因素交互作用不顯著。

2.3.3 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定和驗證

通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗得到的最佳工藝條件為酶添加量433.17 U/g、叔丁醇用量3.89 mL/g、硫酸銨用量2.05 g/g，預(yù)測得到的亞麻籽油提取率為89.11%?？紤]到實際操作，將工藝條件調(diào)整為酶解時間2 h、酶添加量433 U/g、叔丁醇用量3.9 mL/g、硫酸銨用量2.1 g/g、三相提取溫度45℃、三相提取時間4 h，在此條件下進行驗證實驗，亞麻籽油提取率為(89.03±1.45)%，與預(yù)測值比較接近，因此可以用優(yōu)化方法進行亞麻籽油的提取。采用該工藝對隴亞10號和定亞18號亞麻籽進行油脂提取，得到的亞麻籽油提取率分別為(84.47±1.98)%和(86.69±2.31)%。

2.4 亞麻籽蛋白和亞麻籽膠提取率

在2.3確定的最優(yōu)條件下，采用3種原料提取得到的亞麻籽蛋白和亞麻籽膠提取率見表5。

表5 優(yōu)化的EATPP下亞麻籽膠和亞麻籽蛋白提取率 %

從表5可以看出，亞麻籽膠提取率為31.62%～35.61%，亞麻籽蛋白提取率為50.58%～55.69%。亞麻籽膠和亞麻籽蛋白提取率均較低，可能是由于兩者以結(jié)合形式存在而影響了各自的提取率。Kaushik等[33]研究表明，亞麻籽膠和亞麻籽蛋白在低pH條件(pH 3.1)以一定的比例(1∶3)形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Kaushik[34]、Pham[35]等用亞麻籽蛋白-亞麻籽膠復(fù)合物作為亞麻籽油的微膠囊化壁材，發(fā)現(xiàn)亞麻籽蛋白-亞麻籽膠復(fù)合物可以顯著提高亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性；Pham等[36]體外消化實驗表明，亞麻籽蛋白-亞麻籽膠復(fù)合物可以減緩微膠囊殼中蛋白質(zhì)的水解降解，且微膠囊可以在胃相中保持完整，并將包封劑遞送到腸相中。因此，亞麻籽中的蛋白質(zhì)和糖類具有很高的營養(yǎng)價值和開發(fā)潛力。

3 結(jié) 論

利用EATPP同時提取亞麻籽油、亞麻籽蛋白和亞麻籽膠，以亞麻籽油提取率為指標，通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗對EATPP工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)的EATPP工藝條件為：酶解時間2 h，酶添加量433 U/g，叔丁醇用量3.9 mL/g，硫酸銨用量2.1 g/g，三相提取溫度45℃，三相提取時間4 h。在最優(yōu)工藝條件下，3個品種亞麻籽的亞麻籽油提取率為84.47%～89.03%，亞麻籽蛋白提取率為50.58%～55.69%，亞麻籽膠提取率為31.62%～35.61%。EATPP不僅能夠同時分離亞麻籽中脂肪、蛋白質(zhì)和膠，而且能夠降低成本和提高亞麻籽的利用率。本研究為亞麻籽油、亞麻籽蛋白和亞麻籽膠的提取提供了參考，也為亞麻籽的綜合利用提供了理論基礎(chǔ)。