桔梗總皂苷對(duì)支氣管肺發(fā)育不良新生大鼠肺損傷的作用及機(jī)制研究

吳朋，李銀華，譚心海，閔鋒，袁利娟，鄭婷

（天門市第一人民醫(yī)院1.兒科，2.檢驗(yàn)科，湖北 天門431700；3.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢430064）

支氣管肺發(fā)育不良（broncho-pulmonary dysplasia, BPD）是嬰幼兒時(shí)期較為常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響嬰幼兒的身體發(fā)育[1]。有研究[2]顯示，在肺的正常發(fā)育中，氧氣作為一種環(huán)境刺激起重要的調(diào)節(jié)作用，長(zhǎng)期暴露于高氧環(huán)境會(huì)干擾肺部的發(fā)育，導(dǎo)致肺泡上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而發(fā)生不可逆的發(fā)育異常。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）是維持肺泡上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑[3]。HGF 與其受體c-Met結(jié)合在肺炎、肺癌等肺疾病中發(fā)揮重要作用[4]。MIRANDA 等[5]報(bào)道抑制HGF/c-Met 信號(hào)通路可有效改善肺損傷。桔?？傇碥帐菑慕酃Ｖ刑崛〕龅囊环N三萜類化合物，對(duì)鎮(zhèn)咳、祛痰、抗腫瘤、抗氧化及免疫增強(qiáng)起主要作用[6]。桔?？傇碥湛梢悦黠@減輕PM2.5 導(dǎo)致的肺組織病變，對(duì)其損傷具有一定的修復(fù)作用[7]，然而關(guān)于桔?？傇碥赵贐PD 的作用報(bào)道較少。本研究通過觀察桔梗總皂苷對(duì)高氧致BPD新生大鼠肺組織的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 新生大鼠66 只，1日齡，體重（5.60±0.45）g，由北京科興中維生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0052，本研究符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R 原則。

1.2 試劑及儀器

地塞米松磷酸鈉注射液購自辰欣藥業(yè)股份有限公司，桔?？傇碥铡⑻K木精-伊紅染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，兔源多克隆HGF 抗體、c-Met 抗體、p-c-Met 抗體購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，兔源單克隆抗β-actin 抗體購自美國CST 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自美國Novus Biologicals 公司。顯微鏡購自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司，酶聯(lián)免疫分析儀購自澳大利亞Techan公司，超低溫冰箱購自美國Thermo 公司，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高氧致大鼠BPD 模型的復(fù)制與分組 將SD新生大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、BPD 組、地塞米松組、桔?？傇碥盏蛣┝拷M、桔梗總皂苷中劑量組、桔梗總皂苷高劑量組，每組11 只。除對(duì)照組外，其他組通過持續(xù)吸入高濃度氧復(fù)制大鼠BPD 模型[8]。將新生大鼠及其母鼠一同置于高氧箱中，箱中維持氧體積分?jǐn)?shù)為90%，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)＜0.5%，溫度25℃左右，濕度50%～70%，每日開箱30 min，更換水、飼料及墊料，連續(xù)7 d。各組隨機(jī)挑選1 只大鼠，取其肺組織進(jìn)行HE 染色。如果肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔厚度不均勻，表明大鼠BPD 模型復(fù)制成功。桔梗總皂苷低、中、高劑量組分別腹腔注射50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 桔?？傇碥眨厝姿山M腹腔注射地塞米松5 mg/kg，BPD組和對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。

1.3.2 標(biāo)本采集 末次給藥24 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，處死各組大鼠，取其肺組織。剪取0.5 g 右肺組織用于提取組織蛋白；另剪取0.5 g肺組織-80℃冰箱冷凍保存，用于ELISA 實(shí)驗(yàn)；剩余右肺組織常規(guī)石蠟切片備用。左肺組織稱重、烘干。

1.3.3 計(jì)算各組大鼠肺組織濕重/干重（wet weight/dry weight, W/D）值 稱取各組大鼠左肺組織濕重（wet weight, W）后，置于75℃烤箱中72 h，稱量干重（dry weight,D），計(jì)算各組大鼠W/D 值。

1.3.4 HE 染色觀察各組大鼠肺組織病理變化及放射狀肺泡計(jì)數(shù)（radical alveolar counts, RAC） 取各組大鼠右肺組織常規(guī)石蠟切片，HE 染色、脫水、中性樹膠封片后，每張切片選取5 個(gè)視野，顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化，并計(jì)算大鼠肺組織中RAC。

1.3.5 ELISA檢測(cè)各組大鼠肺組織中炎癥因子IL-6、TNF-α水平 取大鼠右肺組織，剪碎并研磨成組織勻漿，用ELISA 試劑盒分別檢測(cè)IL-6、TNF-α 水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)各組大鼠肺組織中HGF、c-Met、p-c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量 用RIPA 組織裂解液提取右肺組織蛋白，并檢測(cè)其濃度，調(diào)整上樣量，95℃水浴滅活，上樣行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉，孵育一抗（HGF、c-Met、p-c-Met、β-actin 抗體，1∶1 500），4℃過夜，洗膜后孵育二抗（1∶4 500）37℃，1 h，洗膜后顯色，用Bio-Rad 成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白灰度信號(hào)，β-actin 為內(nèi)參，Image J 軟件定量分析HGF、c-Met、p-c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桔?？傇碥諏?duì)BPD新生大鼠W/D值的影響

對(duì)照組、BPD 組、地塞米松組、桔?？傇碥盏蛣┝拷M、桔?？傇碥罩袆┝拷M、桔?？傇碥崭邉┝拷M新生大鼠 的W/D 值分別為（4.68±0.04）、（6.01±0.06）、（4.75±0.05）、（5.54±0.05）、（5.50±0.04）及（4.81±0.06）。各組新生大鼠W/D 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 157.416，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，BPD 組W/D 值高于對(duì)照組（P＜0.05）；地塞米松組，桔梗總皂苷低、中、高劑量組W/D 值低于BPD 組（P＜0.05）；桔?？傇碥盏汀⒅袆┝拷MW/D 值高于地塞米松組（P＜0.05）；桔?？傇碥崭邉┝拷MW/D 值低于桔?？傇碥盏?、中劑量組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組新生大鼠W/D值比較 （±s）

2.2 桔?？傇碥諏?duì)BPD新生大鼠肺組織病理變化及RAC的影響

對(duì)照組新生大鼠肺組織無明顯病理變化；BPD組新生大鼠肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡腔增大，肺泡間隔增厚，且出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與BPD 組相比，地塞米松組、桔?？傇碥盏?、中、高劑量組新生大鼠肺泡病理改變減輕（見圖2）。對(duì)照組、BPD 組、地塞米松組、桔?？傇碥盏蛣┝拷M、桔梗總皂苷中劑量組、桔?？傇碥崭邉┝拷M新生大鼠的RAC 分別為（14.06±1.02）個(gè)、（6.76±0.53）個(gè)、（12.13±1.00）個(gè)、（9.64±0.61）個(gè)、（9.73±0.55）個(gè)及（11.86±1.12）個(gè)。各組新生大鼠肺組織RAC 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.104，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，BPD 組新生大鼠肺組織RAC 低于對(duì)照組（P＜0.05）；地塞米松組，桔?？傇碥盏?、中、高劑量組RAC 高于BPD 組（P＜0.05）；桔?？傇碥盏?、中劑量組RAC 低于地塞米松組（P＜0.05）；桔?？傇碥崭邉┝拷M新生大鼠肺組織RAC高于桔?？傇碥盏汀⒅袆┝拷M（P＜0.05）（見圖3）。

圖2 各組新生大鼠肺組織病理變化 （×50 μm）

圖3 各組新生大鼠肺組織RAC比較 （±s）

2.3 桔?？傇碥諏?duì)BPD新生大鼠肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α的影響

各組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，BPD組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；地塞米松組、桔梗總皂苷低、中、高劑量組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α 水平低于BPD 組（P＜0.05）；桔?？傇碥盏汀⒅袆┝拷M新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α 水平高于地塞米松組（P＜0.05）；桔?？傇碥崭邉┝拷M新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α 水平低于桔?？傇碥盏?、中劑量組（P＜0.05）。見表1 和圖4。

圖4 各組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

表1 各組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

表1 各組新生大鼠肺組織IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與BPD組比較，P ＜0.05；③與地塞米松組比較，P ＜0.05；④與桔?？傇碥盏蛣┝拷M比較，P ＜0.05；⑤與桔梗總皂苷中劑量組比較，P ＜0.05。

組別IL-6/（ng/L）TNF-α/（ng/L）對(duì)照組BPD組地塞米松組桔?？傇碥盏蛣┝拷M桔?？傇碥罩袆┝拷M桔?？傇碥崭邉┝拷MF 值P 值58.11±5.49 603.42±30.16①174.64±14.03①②367.45±30.84①②③353.83±30.52①②③183.42±16.07①②④⑤684.419 0.000 50.34±5.38 675.42±40.12①186.97±18.06①②435.07±38.27①②③411.25±37.85①②③201.04±19.67①②④⑤576.557 0.000

2.4 桔?？傇碥諏?duì)BPD 新生大鼠肺組織HGF、c-Met、p-c-Met蛋白表達(dá)的影響

各組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，BPD 組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）；地塞米松組，桔?？傇碥盏?、中、高劑量組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于BPD組（P＜0.05）；桔梗總皂苷低、中劑量組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于地塞米松組（P＜0.05）；桔?？傇碥崭邉┝拷M新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于桔?？傇碥盏?、中劑量組（P＜0.05）。見表2 和圖5。

表2 各組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與BPD組比較，P ＜0.05；③與地塞米松組比較，P ＜0.05；④與桔?？傇碥盏蛣┝拷M比較，P ＜0.05；⑤與桔梗總皂苷中劑量組比較，P ＜0.05。

組別HGF p-c-Met/c-Met對(duì)照組BPD組地塞米松組桔?？傇碥盏蛣┝拷M桔梗總皂苷中劑量組桔?？傇碥崭邉┝拷MF 值P 值0.46±0.03 1.06±0.08①0.72±0.03①②0.90±0.08①②③0.87±0.06①②③0.78±0.05①②④⑤118.773 0.000 0.56±0.01 1.04±0.07①0.64±0.03①②0.78±0.05①②③0.75±0.04①②③0.67±0.04①②④⑤143.793 0.000

圖5 各組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

BPD 是嬰幼兒易發(fā)生的慢性呼吸道疾病，其主要病理變化是肺泡發(fā)育不良。BPD 會(huì)引起呼吸障礙、肺組織水腫、膿毒血癥等癥狀，引起機(jī)體產(chǎn)生大量細(xì)胞因子而造成肺損傷[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，BPD 組新生大鼠肺泡融合泡腔增大，間隔增加，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織RAC 降低，W/D值升高，與尹玲玲等[11]研究結(jié)果一致，提示BPD 新生大鼠模型復(fù)制成功，肺組織出現(xiàn)損傷。由于BPD 的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此研究其發(fā)病機(jī)制，找尋新型有效的治療藥物，對(duì)其臨床診治具有重要意義。桔?？傇碥帐侵兴幗酃Ｖ兄饕钚晕镔|(zhì)，常用于潤(rùn)喉和化痰，并促進(jìn)膿液的排出[12-13]。董雙勇等[14]研究顯示，桔?？傇碥諏?duì)大鼠急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，桔?？傇碥詹煌瑒┝拷M較BPD 組新生大鼠肺泡病理變化明顯減輕，肺組織RAC 升高，W/D 值降低，其中桔?？傇碥崭邉┝拷M較桔?？傇碥盏?、中劑量組治療效果顯著，且與地塞米松組治療效果相似，提示桔?？傇碥湛梢跃徑飧哐跽T導(dǎo)的BPD 新生大鼠肺部組織損傷，且與桔?？傇碥談┝坑嘘P(guān)。

炎癥反應(yīng)是BPD 發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)，高氧引起的BPD 主要特征是肺組織中性粒細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)等反應(yīng)，炎癥反應(yīng)嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肺組織血管生成和肺泡形成異常[15-16]。IL-6、TNF-α 是促炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[17]，邊紅恩等[18]研究顯示BPD新生大鼠肺組織中細(xì)胞炎癥因子IL-1、TNF-α 分泌量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BPD 組肺組織中炎癥因子IL-6、TNF-α 水平升高，提示BPD 組新生大鼠體內(nèi)促炎因子分泌異常，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起肺部組織損傷。張瀟月等[19]研究顯示，TNF-α、IL-6 參與高氧暴露所致支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)病過程，且IL-6 是其發(fā)病的關(guān)鍵因子。張鳳梅等[20]研究顯示抑制炎癥因子分泌可以有效減輕BPD新生大鼠肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，桔?？傇碥詹煌瑒┝拷M較BPD 組新生大鼠肺組織中炎癥因子IL-6、TNF-α 水平降低，且桔梗總皂苷高劑量組較桔?？傇碥盏?、中劑量組IL-6、TNF-α 水平降低，提示桔?？傇碥湛梢砸种艻L-6、TNF-α 分泌，減輕BPD 新生大鼠肺部組織炎癥反應(yīng)，緩解其肺部損傷，且與桔?？傇碥談┝坑嘘P(guān)。

HGF 在新生兒肺泡形成過程中發(fā)揮重要作用，HGF 主要由成纖維細(xì)胞分泌，參與肺泡上皮細(xì)胞的增殖、分化等過程，c-Met是HGF的受體，HGF與c-Met結(jié)合后，c-Met 發(fā)生磷酸化激活下游靶基因，在肺泡上皮細(xì)胞的發(fā)育和修復(fù)過程中至關(guān)重要[21-22]。LOFTUS 等[23]研究顯示，在肺損傷疾病中，HGF、c-Met 表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BPD 組肺組織中HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白表達(dá)升高，提示新生大鼠BPD 的發(fā)生引起HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白表達(dá)變化，新生大鼠BPD 引起的肺損傷與HGF/c-Met 信號(hào)通路有關(guān)。研究顯示，HGF/c-Met 和TGF-α/EGFR 信號(hào)可以增強(qiáng)機(jī)體肺泡上皮細(xì)胞的先天免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎癥因子分泌[24-25]。推測(cè)高氧誘導(dǎo)的BPD 新生大鼠體內(nèi)HGF/c-Met 信號(hào)通路異常活化，炎癥因子分泌失調(diào)，造成肺部嚴(yán)重?fù)p傷。本研究顯示，桔梗總皂苷不同劑量組較BPD 組新生大鼠肺組織HGF、p-c-Met/c-Met 蛋白表達(dá)降低，提示桔?？傇碥湛梢砸种艸GF、p-c-Met/c-Met 蛋白表達(dá)，推測(cè)桔?？傇碥湛赡芡ㄟ^抑制HGF/c-Met 通路激活，減少炎癥因子分泌，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，緩解肺損傷。

綜上所述，桔?？傇碥湛赡芡ㄟ^抑制HGF/c-Met信號(hào)通路激活，減少炎癥因子分泌，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，對(duì)BPD 新生大鼠肺組織發(fā)揮保護(hù)作用。桔梗總皂苷生物活性較多，需要進(jìn)一步探究其對(duì)BPD 治療的具體機(jī)制。