電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定甜葉菊干葉中甜菊糖苷的結(jié)構(gòu)

呂博，韓印森，許慶軒，2，3

（1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

0 引言

近年來，為了替代蔗糖，減輕健康方面的顧慮，人們對(duì)高效甜味劑的需求日益增加。甜葉菊是一種菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲，其中的甜菊糖苷（Steviol glycosides）是一類四環(huán)二萜類糖苷物質(zhì)，具有低熱量、高甜度且無毒副作用，是目前正在研究作為蔗糖替代品的一種天然物質(zhì)[1-2]，甜度是蔗糖的50～300倍，這主要得益于甜葉菊葉片中的多種甜菊糖苷成分[3]，此外，甜葉菊中的活性成分黃酮[4-5]、多酚類成分[6-8]抗氧化能力強(qiáng)，其他成分還主要包括生物堿、甾醇、多糖、脂肪酸、氨基酸、嘌呤等。值得一提的是，甜葉菊葉片脂肪酸中棕櫚酸含量很高，占總脂肪酸的80%以上[9]。

甜葉菊由于產(chǎn)地不同所含的甜菊糖苷種類有很大差異，其次甜菊糖苷種類很多，把這些甜菊糖苷一一鑒定出來并不容易，并且有些含量少的糖苷按照傳統(tǒng)方法很難確定結(jié)構(gòu)，急需一種方法簡(jiǎn)單快速地鑒定出其中的糖苷類成分。質(zhì)譜法具有很高的靈敏性、特異性，且響應(yīng)速度快，是目前應(yīng)用范圍廣泛的分析測(cè)試技術(shù)之一。電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）能夠進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析，不需要復(fù)雜的樣品前處理，就可以在復(fù)雜混合物中快速找出其中糖苷成分，串聯(lián)質(zhì)譜可以給出豐富的結(jié)構(gòu)信息，通過這些結(jié)構(gòu)信息能夠快速確定這些糖苷結(jié)構(gòu)，圖1 為甜菊糖苷化學(xué)結(jié)構(gòu)通式，表1 為在此基礎(chǔ)上的幾種甜菊糖苷類成分的結(jié)構(gòu)。ESI-MS 中形成的離子主要是準(zhǔn)分子離子，如[M+H]+、[M-H]-等。準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)過低能量的碰撞誘導(dǎo)解離（CID），碎裂一般遵循“偶電子規(guī)則”，即產(chǎn)生偶電子碎片離子和中性分子。對(duì)碎裂機(jī)理進(jìn)行研究有助于推導(dǎo)未知化合物的結(jié)構(gòu)。本工作采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)甜葉菊中甜菊糖苷進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，并研究此類化合物多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑，為甜菊糖苷及其衍生物的結(jié)構(gòu)修飾與代謝反應(yīng)的研究提供極有價(jià)值的信息。

圖1 甜菊糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the steviol glycosides

表1 幾種甜菊糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical structures of the steviol glycosides

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

LCQ Fleet 離子阱質(zhì)譜儀（包括Caliber 工作站,美國(guó)賽默飛世爾公司）；移液器（美國(guó)賽默飛世爾公司）；Mille-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；電子天平（日本島津公司）；KQ-250DB型超聲清洗器（昆山市超聲儀器公司）；流動(dòng)注射泵（美國(guó)KD Scientific）。

1.2 主要材料與試劑

甜葉菊：安徽省太和縣新源保健茶廠；甲醇：色譜純，天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 樣品處理

將甜葉菊干葉粉碎后得到甜葉菊粉末。稱取0.5 g 甜葉菊粉末于100 mL 燒杯中，加入25 mL 60%甲醇搖勻后水浴超聲處理30 min，得到的甜葉菊苷粗提液與甲醇1∶4混勻，過0.22μm有機(jī)相濾膜備用。

稱取0.5 g甜葉菊粉末、0.05 g NaCl于100 mL燒杯中，加入25 mL蒸餾水搖勻后水浴超聲處理30 min，得到的甜葉菊苷粗提液稀釋在甲醇：水為1∶1 的溶液中至甜葉菊濃度為1 mg/L，此時(shí)水提液中NaCl 濃度剛好為0.1 mg/L，過0.22μm 有機(jī)相濾膜備用。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源；噴霧電壓±4 000 V；離子源溫度275 ℃；毛細(xì)管電壓26 V；采用全掃描模式（SCAN）；質(zhì)量掃描范圍m/z 200～1 200；質(zhì)譜進(jìn)樣速度為10μL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜葉菊干葉提取液的電噴霧全掃描分析

圖2 是甜葉菊干葉提取液的正離子電噴霧全掃描圖。由于甜菊糖苷的多羥基結(jié)構(gòu)，在電噴霧正離子模式下容易形成加氫離子、加鈉離子和加鉀離子等多種準(zhǔn)分子離子。各化合物中加鈉離子質(zhì)量數(shù)比加氫離子多22，加鉀離子質(zhì)量數(shù)比加鈉離子多16，根據(jù)這些差值可以確定這些化合物的質(zhì)量數(shù)，同時(shí)與文獻(xiàn)[10-13]對(duì)照可以初步確定這些化合物的身份，比如：m/z643為RB/SB加H 峰，m/z665 為RB/SB加Na峰，m/z681為RB/SB加K 峰；m/z789 為DA 加H 峰，m/z811 為DA 加Na 峰，m/z827 為DA 加K 峰或STV/RB加Na 峰，m/z843 為STV/RB 加K 峰；m/z951 為RC 加H 峰，m/z973 為RC 加Na 峰，m/z989 為RC 加Na 峰或RA/RE 加Na 峰，m/z967 為RA/RE 加H 峰，m/z1005 為RA/RE 加K 峰。只有甜葉菊成分中的甜菊糖苷具有這種特征，可以快速地把甜菊糖苷與其它成分區(qū)別出來。

圖2 甜葉菊干葉提取液的正離子電噴霧全掃描圖Fig.2 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract in positive ion mode

由于正離子模式下甜菊糖苷信號(hào)比較弱，難以進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究，但是由于其豐富的加和離子信息，可以初步確定甜菊糖苷的身份，使其在結(jié)構(gòu)鑒定中仍然具有重要的價(jià)值。

根據(jù)甜葉菊干葉提取液的負(fù)離子電噴霧全掃描圖（圖3）和幾種已知甜菊糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（表2）可知，譜圖中出現(xiàn)的m/z641、803、965是幾種甜菊糖苷減H 峰，m/z677、839、985、1 001是甜菊糖苷加Cl峰（見表2），減H 峰與加Cl 峰相對(duì)分子量相差36，此為甜菊糖苷類成分的特征峰，可以用于鑒定甜菊糖苷。另外m/z353、447、515 幾種豐度較強(qiáng)的峰分別為甜葉菊葉中的酚類成分咖啡酰奎寧酸、阿魏?？崴?、二咖啡?？鼘幩醄14-15]。在負(fù)離子模式下，甜菊糖苷的去質(zhì)子化物質(zhì)和氯離子加合物在整個(gè)質(zhì)譜圖中都可以觀察到。在負(fù)離子模式下觀察到的氯離子加合物可能是由質(zhì)譜儀或葉基質(zhì)中的痕量氯化物引起的。在圖3 中，RS/SB減H峰信號(hào)強(qiáng)度明顯高于加Cl峰，STV/RB加Cl峰信號(hào)強(qiáng)度是其減H峰的將近6倍，RA/RE加Cl峰信號(hào)強(qiáng)度是其減H 峰的4 倍左右。在樣品中人為添加氯離子如圖4 所示。RS/SB 減H 峰信號(hào)強(qiáng)度低于加Cl 峰，STV/RB 加Cl 峰信號(hào)強(qiáng)度是其減H 峰的8 倍，RA/RE加Cl峰信號(hào)強(qiáng)度是其減H 峰的4 倍左右。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)中C19 位R1為H 的甜菊糖苷信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，C19位R1為糖基的甜菊糖苷信號(hào)強(qiáng)度無明顯變化，說明結(jié)構(gòu)中C19位R1為H的甜菊糖苷更容易受環(huán)境中Cl離子的影響，在譜圖中表現(xiàn)為甜菊糖苷加Cl峰信號(hào)強(qiáng)度的提高。

圖3 甜葉菊干葉提取液的負(fù)離子電噴霧全掃描圖Fig.3 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract in negative ion mode

圖4 甜葉菊干葉提取液（0.1 mg/L的NaCl溶液）的負(fù)離子電噴霧全掃描圖Fig.4 Full scan mass spectrum of stevia dried leaves extract(0.1 mg/L NaCl solution)in negative ion mode

表2 甜菊糖苷的質(zhì)譜峰和相對(duì)分子質(zhì)量Table 2 The mass spectra and relative molecular mass of steviol glycosides

2.2 負(fù)離子模式下甜菊糖苷的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析

負(fù)離子模式下相對(duì)分子質(zhì)量為642的化合物的ESI-MS2質(zhì)譜圖示于圖5a，m/z641在高能量（由于甜菊糖苷結(jié)構(gòu)中電子云密度的影響，低能量下C19 位上的基團(tuán)易斷裂，只有在能量較高的狀態(tài)下，結(jié)構(gòu)中C13 位的基團(tuán)才能斷裂[16]）轟擊下產(chǎn)生子離子m/z479、461、317。為了研究其電噴霧質(zhì)譜碎裂規(guī)律，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)串連質(zhì)譜研究。子離子m/z479 在能量轟擊下碎裂成子離子m/z317 示于圖5b中，子離子m/z461 在能量轟擊下碎裂成子離子m/z317 示于圖5c 中，m/z317 不再發(fā)生碎裂。m/z641 丟失一分子葡萄糖基得到子離子m/z479，丟失一分子葡萄糖基、一分子水或者一分子葡萄糖得到子離子m/z461。若丟失一分子葡萄糖，在下一次斷裂時(shí)應(yīng)該為葡萄糖基的斷裂，然而子離子m/z461在能量轟擊下碎裂成子離子m/z317 與假設(shè)不符，因此推測(cè)m/z641 在發(fā)生碎裂時(shí)丟失的為一分子葡萄糖基、一分子水，并且這種丟失水分子的情況概率低且信號(hào)強(qiáng)度很低，說明水分子的丟失并不容易。與甜茶苷、甜菊雙糖苷的結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。

圖5 負(fù)離子模式下m/z641（a）、m/z479（b）、m/z461（c）的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.5 ESI-MSn spectra of the ions at m/z641(a),m/z 479(b)and m/z 461(c)in negative ion mode

負(fù)離子模式下相對(duì)分子質(zhì)量為788 的化合物的ESI-MS2質(zhì)譜圖示于圖6a，m/z787 在能量轟擊下產(chǎn)生子離子m/z641、625、607、479、317。為了探討其電噴霧質(zhì)譜碎裂規(guī)律，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)串連質(zhì)譜研究。首先選擇m/z641 子離子，該離子在能量轟擊下產(chǎn)生子離子m/z479、461、317 示于圖6b 中。其次選擇子離子625，在能量轟擊下，該子離子裂解為m/z479、461、317 示于圖6c 中。子離子m/z479 在能量轟擊下又可碎裂成子離子m/z317 示于圖6d 中。m/z787 丟失一分子鼠李糖基得到子離子m/z641，丟失一分子葡萄糖基得到子離子m/z625，丟失一分子葡萄糖基、一分子水得到子離子m/z607，丟失一分子鼠李糖基、一分子葡萄糖基得到子離子m/z479，丟失一分子鼠李糖基、兩分子葡萄糖基得到子離子m/z317。這與杜克苷A 的結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。碎裂產(chǎn)生的子離子m/z625的信號(hào)強(qiáng)度最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于m/z641的信號(hào)強(qiáng)度，由此看出，杜克苷A發(fā)生碎裂時(shí)葡萄糖基相比鼠李糖基容易脫去，因此可以得出結(jié)論，甜菊糖苷離子的C19比C13位容易斷裂。結(jié)合杜克苷A 的結(jié)構(gòu)，其二級(jí)譜圖中出現(xiàn)丟失水分子的峰，并且必定伴隨C19 位葡萄糖基的丟失，推測(cè)丟失的水分子是在C13 位鼠李糖上。與相對(duì)分子質(zhì)量為642 的化合物比較，其在二級(jí)譜圖中出現(xiàn)的丟失水分子的結(jié)構(gòu)應(yīng)為C19位同樣為葡萄糖基的甜茶苷，而甜菊雙糖苷沒有水分子的損失。

圖6 負(fù)離子模式下m/z787（a）、m/z641（b）、m/z625（c）、m/z479（d）的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MSn spectra of the ions at m/z787(a),m/z641(b)and m/z625(c),m/z479(d)in negative ion mode

負(fù)離子模式下相對(duì)分子質(zhì)量為803的化合物的ESI-MS2質(zhì)譜圖示于圖7。[STV/RB-H]-串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖7a，m/z803在能量轟擊下產(chǎn)生子離子m/z641、623、479、317；為了研究其電噴霧質(zhì)譜碎裂規(guī)律，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)串連質(zhì)譜研究。m/z803 的子離子峰m/z641在能量轟擊下碎裂成子離子m/z479、461、317示于圖7b 中，子離子m/z479 在能量轟擊下碎裂成子離子317 示于圖7c 中。[STV/RB+Cl]-串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖7d 中，m/z839的子離子峰在能量轟擊下碎裂成子離子m/z803、641，其中子離子m/z641在能量轟擊下碎裂成子離子m/z479、317示于圖7e中，與m/z803的碎裂過程相同。m/z803丟失一分子葡萄糖基得到子離子m/z641，丟失一分子葡萄糖基、一分子水得到子離子m/z623，丟失兩分子葡萄糖基得到子離子m/z479，丟失三分子葡萄糖基得到子離子m/z317。與甜菊苷、瑞鮑迪苷B的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)。碎裂過程中有水的損失，必定存在C19位葡萄糖基的成分，即STV。

圖7 負(fù)離子模式下m/z803（a）、m/z641（b）、m/z479（c）、m/z839（d）、m/z641（e）的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.7 ESI-MSnspecta of the ions at m/z803(a),m/z641(b),m/z479(c),m/z839(d),m/z641(e)in negative ion mode

負(fù)離子模式下相對(duì)分子質(zhì)量為967 的化合物的ESI-MS2質(zhì)譜圖示于圖8a，m/z1001 在15.5%能量轟擊下產(chǎn)生子離子m/z965、803。為了研究其電噴霧質(zhì)譜碎裂規(guī)律，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)串連質(zhì)譜研究。子離子m/z803 在16%能量下碎裂成子離子m/z641、479、317 示于圖8b 中。m/z1001 丟失一分子氯化氫得到子離子m/z965，丟失一分子氯化氫、一分子葡萄糖基得到子離子m/z803。與瑞鮑迪苷A的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)。

圖8 負(fù)離子模式下m/z1001（a）、m/z803（b）的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.8 ESI-MSn spectra of the ions at m/z1001(a)and m/z803(b)in negative ion mode

3 討論與結(jié)論

對(duì)甜葉菊中的甜菊糖苷進(jìn)行了電噴霧多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析研究，并在負(fù)離子模式下均獲得了靈敏度較高的電噴霧質(zhì)譜信息。在負(fù)離子模式下，各化合物在二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜中均發(fā)生在C13 位O-C鍵的斷裂及C19位側(cè)鏈羧基的斷裂。這是該類化合物的質(zhì)譜斷裂特征，可能是由于C19位所連的羧基的誘導(dǎo)及吸電子特性，使其電子云發(fā)生偏移，致使O-C 鍵易于斷裂造成的；C13 位亦然。ESI 作為一種軟電離方式，以多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MS）分析甜菊糖苷的掃描質(zhì)譜裂解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其基本裂解途徑相似。本研究為甜菊糖苷及其衍生物的結(jié)構(gòu)修飾與代謝反應(yīng)的研究提供了極有價(jià)值的信息。

（1）甜葉菊干葉提取液的正離子電噴霧全掃描圖信息豐富，可以根據(jù)[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量分別相差22、16 對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行判斷，即可以作為甜菊糖苷的特征峰；在甜葉菊干葉提取液的負(fù)離子電噴霧全掃描圖中，可以根據(jù)[M-H]-、[M+Cl]-離子對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量相差36，其他成分不具有這種特性，因此可以作為甜菊糖苷的特征峰進(jìn)行判斷。

甜葉菊由于產(chǎn)地的不同含有的甜菊糖苷種類也不同，目前已發(fā)現(xiàn)30 多種甜菊糖苷[17]，因此甜菊糖苷的鑒定方法顯得尤為重要。利用電噴霧正離子模式及負(fù)離子模式中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M-H]-、[M+Cl]-特征離子能夠快速識(shí)別甜葉菊中的甜菊糖苷類成分，對(duì)甜菊糖苷的鑒定有重要意義。

（2）電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜中，碰撞能量相同的條件下，甜菊糖苷結(jié)構(gòu)中C19 位的糖苷鍵相較于C13 位糖苷鍵更易斷裂；雖然甜菊糖苷結(jié)構(gòu)中連接的糖基含有多個(gè)OH 活性基團(tuán)，但即使在較高的碰撞能量下也不易斷裂；所有甜菊糖苷最后都碎裂為m/z317 的子離子，說明在串聯(lián)質(zhì)譜中，甜菊糖苷只丟失C13、C19 位的取代基，骨架結(jié)構(gòu)不發(fā)生碎裂，因此可以作為鑒定此類化合物的基礎(chǔ)。

（3）液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）可實(shí)現(xiàn)對(duì)甜菊糖苷類成分同分異構(gòu)體的分離及鑒定，但在進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜時(shí)卻缺乏靈活性，單獨(dú)使用電噴霧質(zhì)譜法可以靈活地選擇目標(biāo)離子、使用合適的碎裂能量進(jìn)行多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜研究，更方便地獲取目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)信息。