多房棘球蚴囊液對小鼠肝細(xì)胞凋亡與自噬影響的研究

徐 凱，尹鳳嬌，張耀剛，吳傳玲，李文登，任 利，樊海寧，王海久，王志鑫青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，青海西寧 8000； 青海省包蟲病研究重點實驗室，青海西寧8000； 浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院鑒湖學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，浙江紹興 000

多房棘球蚴病是一種流行于北半球的人獸共患寄生蟲病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，好發(fā)于畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)[1]。我國新疆維吾爾自治區(qū)西北地區(qū)、青藏高原東部地區(qū)、寧夏南部、甘肅中南部等為此疾病重災(zāi)區(qū)[2]。原發(fā)多房棘球蚴病灶幾乎都在肝部(約99%)[3]。多房棘球蚴在中間宿主肝內(nèi)主要為浸潤式增殖，并產(chǎn)生大小不一的囊泡，囊液(hydatid cyst fluid，HCF)通過不完整且很薄的囊壁外角皮層持續(xù)滲漏，不斷與肝組織接觸，引起局部肝纖維化和組織壞死，晚期可出現(xiàn)遠(yuǎn)期繼發(fā)性轉(zhuǎn)移病灶，故有“蟲癌”之稱，臨床預(yù)后極差[4-6]。國外學(xué)者采用分離的淋巴細(xì)胞進行體外細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)加入細(xì)粒棘球蚴囊液后，細(xì)胞內(nèi)FasL增高，Bax/Bcl-2表達(dá)比例增高，Caspase-3激活[7-8]。Mejri等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴囊液可抑制巨噬細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)感染多房棘球蚴的小鼠隨著感染時間的延長，p53、p21和Gadd45γ基因表達(dá)及Caspase-3活性呈時間依賴性升高，晚期可出現(xiàn)JNK和Caspase-3激活，同時采用Tunel實驗技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡比例也顯著升高，但并未對體外細(xì)胞功能進行探討。本研究通過觀察體外多房棘球蚴囊液作用于小鼠肝細(xì)胞后對其DDIT4、增殖、自噬和凋亡的影響，并就DDIT4對AML-12細(xì)胞增殖、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進行初步探究。

材料與方法

1 實驗細(xì)胞系 小鼠肝細(xì)胞株 (AML-12)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所，保存于青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室。

2 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM/F12(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清(依科賽生物科技有限公司)；青霉素和鏈霉素10 000 U/mL、PBS(北京索萊寶科技有限公司)；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(美國Gibco公司)；CCK8試劑盒、Annexin V-FITC/PI熒光雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒 (美國 ThermoFisher scientific公司)；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；DDIT4、Beclin-1抗 體(美 國Abcam 公 司)；Caspase-3、PCNA、LC3A/B 抗體 (美國 Cell Signaling Technology公司)；熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司，型號：GE Amersham Imager600)；酶標(biāo)儀 (德國Tecan公司，型號：M200)；電泳儀(BIO RAD公司，型號：基礎(chǔ)型)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司，型號：HT7700)；NovoCyte流式細(xì)胞儀(美國ACEA公司，型號：NovoCyte 3110)；細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國BioTek公司，型號：Cytation 5)；生物倒置顯微鏡系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司，型號：DP27)。

3 囊液收集與處理 處死感染多房棘球蚴 3 個月以上實驗用BALB/c小鼠，在無菌條件下打開腹腔，將腹腔多房棘球蚴病灶內(nèi)的囊泡小心分離，用無菌PBS反復(fù)沖洗囊泡表面5次。將無壞死的囊泡轉(zhuǎn)移至20 mL無菌注射器內(nèi)，通過擠壓將囊液分離出。囊液以 3 000 r/min 離心 30 min，用0.22 μm濾器過濾除菌后分裝，并凍干-80℃?zhèn)溆?。BCA蛋白定量法確定囊液蛋白濃度。

4 AML-12 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的 AML-12 細(xì)胞置于10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察其培養(yǎng)液的顏色變化與細(xì)胞生長情況，長至對數(shù)生長期時用于實驗。

5 CCK8 法檢測細(xì)胞活性 (濃度選擇) 將 AML-12細(xì)胞(1×104/孔)接種于96孔板內(nèi)，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去血清培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含HCF與1% FBS的培養(yǎng)基按倍比稀釋并制備終蛋白濃度為 6.4 mg/mL、3.2 mg/mL、1.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0 mg/mL(對照組)的培養(yǎng)液，分別處理 24 h、48 h、72 h 后各孔加入 10 μL CCK8 試劑，孵育 2 h，每組4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(對照孔OD-實驗孔OD)/(對照孔OD-空白孔 OD]×100%。

6 HCF 對 AML-12 細(xì)胞形態(tài)的影響 生長至對數(shù)期的AML-12細(xì)胞(3×105/孔)接種于6孔板中，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去血清培養(yǎng)基，更換1%血清培養(yǎng)基，內(nèi)含蛋白濃度0 mg/mL(對照組)、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF，分別與細(xì)胞共培養(yǎng)2 d后觀察細(xì)胞形態(tài)。

7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 分組與標(biāo)記同“6 HCF 對 AML-12 細(xì)胞形態(tài)的影響”，用 0.25%胰酶(不含EDTA)消化并收集各組細(xì)胞，300 g下離心5 min，棄上清并用4℃預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次，離心并小心吸干PBS溶液，用500 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，細(xì)胞密度 1×105/mL，在細(xì)胞懸浮液中同時加入 5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI，混勻，室溫避光孵育 15 min 后于 1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

8 MDC 染 色 檢 測 自 噬 情 況 取 生 長 對 數(shù)期AML-12細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，分組與標(biāo)記同“6 HCF 對 AML-12 細(xì)胞形態(tài)的影響”，棄培養(yǎng)液，1×Wash buffer清洗液洗滌2次，加入100μL MDC染色液覆蓋皿底，37℃下避光染色30 min，1×Wash buffer清洗液洗滌 1 次，于熒光顯微鏡下拍照觀察，其中激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)點狀染色為陽性表現(xiàn)。

9 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長對數(shù)期AML-12細(xì)胞，以3×105個/孔接種于6孔板中，分組與標(biāo)記同“6 HCF對AML-12細(xì)胞形態(tài)的影響”，細(xì)胞用含有PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液冰上裂解 30 min，4℃ 下 12 000 r/min離心10 min后取上清液，再用5×蛋白上樣緩沖液稀釋并在95℃水浴中煮沸10 min，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE 電泳。結(jié)束后轉(zhuǎn)移至 0.2 μm PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。將膜與DDIT4(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 500)、PCNA(1∶2 000)、Beclin-1(1∶1 500)、LC3A/B(1∶ 1 500)和 β-actin(1∶1 500)一抗在4℃下孵育過夜。室溫孵育1∶5 000稀釋的HRP 標(biāo)記二抗 1 h。使用增強型ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進行印記檢測，β-actin作為內(nèi)參。使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

10 透 射 電 鏡 觀 察 超 微 結(jié) 構(gòu) 取 生 長 對 數(shù)期AML-12細(xì)胞，以1×106/孔接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，分組與標(biāo)記同“6 HCF對AML-12細(xì)胞形態(tài)的影響”，EP管中收獲培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，PBS洗滌2次；2.5%戊二醛固定過夜后用1%鋨酸在避光室溫條件下固定2 h，用不同濃度梯度(30%、50%、70%、80%、95%、100%)乙醇進行脫水，然后浸透包埋、聚合、超薄切片，拍照，電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。

11 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計與分析，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用 Analysis of Variance(ANOVA)分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCF 對 AML-12 細(xì)胞活力的影響 用不同濃度 HCF 對 AML-12 細(xì)胞干預(yù) 24 h、48 h、72 h，其細(xì)胞活力 (光密度)見表1。48 h 后 0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF可明顯降低細(xì)胞活性，因此本研究選用這兩個濃度進行后續(xù)實驗。

表1 CCK-8法檢測HCF對AML-12細(xì)胞活力的影響Tab.1 Effect of HCF on the viability of AML-12 cells by CCK-8 method

2 HCF 對 AML-12 細(xì)胞的影響 48 h 后對照組細(xì)胞形態(tài)多呈橢圓形或圓形，細(xì)胞生長密度正常，而分別經(jīng)過 0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF 處理后，大部分細(xì)胞形態(tài)明顯拉長，細(xì)胞呈梭形，相鄰細(xì)胞間連接也變得疏松，細(xì)胞生長密度較對照組減小，細(xì)胞生長明顯受到抑制。見圖1。

圖1 不同蛋白濃度HCF共培養(yǎng)48 h的AML-12細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1 Morphology of AML-12 cells co-cultured with different protein concentrations in HCF for 48 h (100×)

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 48 h 后，與對照組比較，0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF 均能促進AML-12細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) ，各組凋亡(Q2+Q3象限)情況和平均凋亡率見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測AML-12細(xì)胞凋亡率(aP<0.01，vs 對照組)Fig.2 Apoptosis of AML-12 cells detected by flow cytometry (aP<0.01, vs control group)

4 MDC 染色檢測自噬情況 MDC 染色后，于熒光顯微鏡下可見對照組細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色，且不明顯；而加入 0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF 可見大量高亮度類圓形團塊，即自噬小體。與對照組相比，0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF 組平均熒光強度明顯升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 HCF對AML-12細(xì)胞自噬水平的影響(MDC染色，200×；aP<0.01，vs 對照組；bP<0.01，vs 0.4 mg/mL)Fig.3 Effect of HCF on autophagy levels of AML-12 cells (MDC staining, 200×; aP<0.01, vs control group; bP<0.01, vs 0.4 mg/mL)

5 Western blot法檢測凋亡、自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF 組 DDIT4、PCNA、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；0.4 mg/mL HCF 組與 0.8 mg/mL HCF組LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 HCF對AML-12細(xì)胞相關(guān)蛋白水平的影響(aP<0.01, vs 對照組; bP<0.05, vs 0.4 mg/mL)Fig.4 Effect of HCF on AML-12 cell-related protein levels (aP<0.01, vs control group; bP<0.05, vs 0.4 mg/mL)

6 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察到對照組細(xì)胞胞質(zhì)未見明顯腫脹，線粒體基質(zhì)較均勻，嵴少量減少，自噬水平低；0.4 mg/mL組線粒體損傷程度較低，輕微腫脹，嵴少量斷裂、減少，胞內(nèi)可見較多自噬溶酶體；0.8 mg/mL組細(xì)胞線粒體損傷程度高，線粒體膜破損、基質(zhì)外溢，嵴缺失，胞內(nèi)可見較大面積自噬溶酶體。見圖5。

圖5 透射電鏡觀察各組AML-12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastructure of AML-12 cells in each group observed by TEM

討 論

多房棘球蚴寄生于宿主肝是一個慢性過程。其囊液的持續(xù)刺激破壞了宿主肝細(xì)胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡，使細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，影響肝多房棘球蚴病的轉(zhuǎn)歸[2]。多房棘球蚴導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡及自噬的機制尚不明確。王俊華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在感染多房棘球蚴的小鼠模型和肝多房棘球蚴病患者肝病灶周圍的肝細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，F(xiàn)as和Caspase家族蛋白表達(dá)明顯增加，提示Fas和Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路可能參與了多房棘球蚴所致肝損傷進程。我們課題組前期研究通過檢測肝多房棘球蚴病患者病灶邊緣帶肝組織發(fā)現(xiàn)自噬和凋亡相關(guān)蛋白顯著上調(diào)，且DDIT4表達(dá)顯著增高，得出在肝多房棘球蚴病中凋亡和自噬可能緩慢協(xié)同并促進病灶浸潤的結(jié)論[12]。

Caspase-3作為最關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，在凋亡過程中起著重要作用。在細(xì)胞凋亡進程中，通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞色素C激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，進展至不可逆性凋亡階段[13-14]。細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，指細(xì)胞受刺激時利用溶酶體消化回收廢棄的細(xì)胞成分和細(xì)胞器以實現(xiàn)自身代謝和能量的更新，但若自噬過度激活可促進細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡，且常伴隨細(xì)胞凋亡和壞死[15-16]。Beclin-1是編碼調(diào)節(jié)自噬的蛋白質(zhì)，在自噬中起核心作用，其表達(dá)水平可反映自噬的發(fā)生[17]。LC3是自噬小體膜上的標(biāo)記蛋白，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式產(chǎn)生，在自噬過程中LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ并被招募為自噬小體，這是自噬小體形成的關(guān)鍵步驟[18]。介導(dǎo)微管與細(xì)胞骨架成分之間物理相互作用的DDIT4在人體正常組織廣泛低表達(dá)，對多種細(xì)胞刺激均能產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，受多種細(xì)胞信號通路的調(diào)控，在細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞周期、自噬、凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[19-20]。一些資料顯示，高水平的DDIT4與急性髓系白血病、乳腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、皮膚癌、肺癌等的不良預(yù)后有關(guān)[21]。王宇飛等[22]研究發(fā)現(xiàn)DDIT4過表達(dá)可對HT22細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用。戈春城等[23]通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)DDIT4可能與低氧反應(yīng)、糖酵解、mTORC1信號通路、NF-κb介導(dǎo)的TNF-α信號通路、G2/M檢查點、p53信號通路等生物學(xué)功能有關(guān)，提示DDIT4可能參與細(xì)胞自噬、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。感染多房棘球蚴的宿主長期受營養(yǎng)不良、氧氣和生長因子等因素影響，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)頻繁的代謝應(yīng)激，最終引起細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞，出現(xiàn)預(yù)后不佳。

目前，關(guān)于DDIT4基因蛋白在棘球蚴病中的作用研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠AML-12細(xì)胞經(jīng)HCF作用后其細(xì)胞活性受到明顯抑制，生長密度明顯減??；流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率較對照組明顯升高；MDC熒光呈現(xiàn)大量高亮度類圓形自噬小體；Western blot檢測示小鼠AML-12細(xì)胞經(jīng)HCF作用后DDIT4呈高表達(dá)，促凋亡因子Caspase-3也呈高表達(dá)；自噬相關(guān)蛋白指標(biāo)Beclin-1和LC3呈高表達(dá)；透射電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可觀察到 0.4 mg/mL HCF 組與 0.8 mg/mL HCF 組細(xì)胞損傷程度均明顯增高，胞內(nèi)細(xì)胞器空泡明顯增多，自噬數(shù)量較多。提示感染多房棘球蚴后宿主肝細(xì)胞凋亡自噬可能與DDIT4蛋白密切相關(guān)。過表達(dá)DDIT4會抑制AML-12細(xì)胞增殖，促進其自噬并誘導(dǎo)凋亡。因此，在肝多房棘球蚴病中凋亡與自噬可能緩慢協(xié)調(diào)促進病情進展并導(dǎo)致預(yù)后不佳。

綜上所述，HCF作用后的AML-12細(xì)胞DDIT4因子呈高表達(dá)，其高表達(dá)可能抑制AML-12細(xì)胞的增殖，并促進其凋亡和自噬。但相關(guān)機制及信號通路尚不清楚，與凋亡和自噬的調(diào)控基因的關(guān)系有待進一步研究。本研究為下一步DDIT4在HCF影響肝細(xì)胞轉(zhuǎn)歸過程中的具體作用機制研究提供了方向。