骨改建中miR-134-5p通過靶向Itgb1抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的研究

黃 萌，江小霞，崔建通，趙長(zhǎng)銘，王振寧，張 宇，吳麗麗，孫兆峰，徐璐璐 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 0085； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔正畸科，北京 0085； 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 0009

骨改建是維持骨骼正常結(jié)構(gòu)的重要過程。在骨微環(huán)境中，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨生成相互平衡，共同維持骨的基本結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。而外傷、激素水平等因素的刺激會(huì)引起骨改建微環(huán)境的變化，可能會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞異常激活，從而導(dǎo)致骨組織出現(xiàn)不必要的吸收、溶解，影響骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)[1]。因此，探究骨改建時(shí)影響破骨細(xì)胞的因素及其機(jī)制尤為重要。微RNA(microRNA，miRNA)作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控因子，是一種長(zhǎng)度約 22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA[2]。研究表明多種miRNA在破骨細(xì)胞生成過程中起著不可忽視的作用[3-4]。它們通過調(diào)控靶基因從而改變骨穩(wěn)態(tài)，使骨微環(huán)境向骨形成或骨吸收方向進(jìn)展[5-7]。在大鼠平滑肌中miR-134-5p過表達(dá)可以促進(jìn)鈣沉積，而這也是成骨作用開始發(fā)生的表現(xiàn)[8]。然而，miR-134-5p對(duì)骨吸收調(diào)控的相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道。因此本研究旨在探討miR-134-5p在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮的作用及其可能的機(jī)制，進(jìn)一步闡明miR-134-5p在骨改建過程中的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 ~ 8 周齡 SPF 級(jí) C57BL/6 雄性小鼠購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會(huì)審核并予以批準(zhǔn)(IACUC-DWZX-2020-729)。

2 主要試劑和材料 α-MEM 培養(yǎng)基 (Gibco，美國(guó))；特級(jí)胎牛血清FBS(Gibco，美國(guó))；磷酸緩沖鹽溶液PBS(Gibco，美國(guó))；青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco，美國(guó))；核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor κ B ligand，RANKL)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF；Peprotech，美國(guó))；轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000 試劑盒 (Invitrogen，美國(guó))；mRNA引物、miR-134-5p引物、miR-134-5p 過表達(dá)模擬物 miR-134-5p agomir、敲低模擬物miR-134-5p antagomir及相應(yīng)陰性對(duì)照(agomir NC 和 antagomir NC；生工生物工程股份有限公司，中國(guó))；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acidic phosphatase，TRAP) 試劑盒 (Sigma aldrich，美國(guó))；Trizol(Invitrogen，美國(guó))；SYBR Green 熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒、PrimeScript RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100 鬼筆環(huán)肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；上海碧云天)；RIPA緩沖液(Sigma，美國(guó))；BCA 試 劑 盒 (Thermo Fisher Scientific，USA)；兔抗鼠GAPDH 、兔抗鼠TRAP抗體、兔抗鼠CTSK、兔抗鼠NFATc1和兔抗鼠Itgb1抗體(Affinity Biosciences，USA)；羊抗兔二抗 (中杉金橋)；ECL發(fā)光液(普利萊)。

3 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 6 ~ 8周齡的C57BL/6雄性小鼠采用頸椎脫臼法處死，浸沒于75%乙醇中。在無(wú)菌條件下分離小鼠下肢皮膚，暴露脛骨、股骨，剔除肌肉、筋膜等軟組織，用含雙抗的PBS沖洗股骨和脛骨，隨后剪去干骺端，使用1 mL無(wú)菌注射器吸取無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔內(nèi)無(wú)血塊為止。將含有骨髓細(xì)胞的無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，移液器將細(xì)胞吹打混勻，1 000 r/min 離心 5 min 后棄去上清，用含 10%FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，在溫度為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 ~ 8 h。收集培養(yǎng)瓶中未貼壁的細(xì)胞，即為小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞 (bone marrow monocytes，BMMs)。1 000 r/min 離心 5 min 后棄去上清，用含10% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

4 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將 BMMs 以5×105/孔接種于 24 孔板中，用含 30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換液，誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。將提取的原代BMMs以1×104/孔接種于96孔板中，細(xì)胞誘導(dǎo)至7 d時(shí)，根據(jù)TRAP染色試劑盒說(shuō)明書對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色：移除培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，每次5 min。4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3遍，每次 5 min，使用TRAP染色液37℃孵育1 h后終止染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，記錄每個(gè)孔中TRAP陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目≥3的破骨細(xì)胞數(shù)目。

5 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為過表達(dá) miR-134-5p(agomir)組、敲低 miR-134-5p (antagomir)組及其 相應(yīng)對(duì)照組 (agomir NC 和 antagomir NC)。 將BMMs細(xì)胞以1×106/孔種于12孔板中，按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書，使用LipofectamineTM2000 將 agomir、antagomir及其相應(yīng)對(duì)照 agomir NC、antagomir NC 分別轉(zhuǎn)染入 BMMs中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換含 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的 α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d。按照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色(方法同前)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組形成的破骨細(xì)胞數(shù)目。

6 肌動(dòng)蛋白環(huán) (F-actin)染色 為檢測(cè)誘導(dǎo)后形成的破骨細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白環(huán)數(shù)目，將提取的原代BMMs以1×104/孔接種于96孔板中，細(xì)胞按照分組誘導(dǎo)至7 d時(shí)，PBS清洗BMMs誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞3次，4%多聚甲醛冰上固定15 min，PBS清洗細(xì)胞3次；用含0.5% Triton X-100的PBS室溫透化細(xì)胞10 min，PBS清洗細(xì)胞3次；加入鬼筆環(huán)肽染色液，在室溫避光孵育20 min，進(jìn)行染色；PBS清洗細(xì)胞3次，加入DAPI染色液復(fù)染10 min，吸去染色液，PBS 清洗細(xì)胞3次；吸去多余水分，封片，熒光顯微鏡觀察纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)。經(jīng)標(biāo)記后細(xì)胞呈紅色空泡狀，含有3個(gè)或3個(gè)以上DAPI藍(lán)染細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞即為破骨細(xì)胞。

7 RNA 提取及 qRT-PCR 使用 Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，按照mRNA和miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，分別對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒或miRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)破骨相關(guān)因子的表達(dá)；以U6作為內(nèi)參，用miRNA熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)miR-134-5p的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1，結(jié)果以2-ΔΔCt表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

8 預(yù) 測(cè) miR-134-5p 靶 基 因 通 過 靶 基 因 數(shù) 據(jù)庫(kù)TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)以及miRDB(http://mirdb.org)在線預(yù)測(cè) miR-134-5p 的靶基因結(jié)果，繪制韋恩圖，得到交集靶基因。

9 檢測(cè)靶基因和蛋白表達(dá)量 收集誘導(dǎo)后的破骨細(xì)胞，分別通過qRT-PCR(實(shí)驗(yàn)步驟同上文“7 RNA 提取及 qRT-PCR”)和 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組Itgb1基因和蛋白表達(dá)量。

10 Western blot檢測(cè) Western blot檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后的破骨細(xì)胞，用PBS清洗2遍，加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞。按照BCA試劑盒的說(shuō)明，測(cè)定蛋白含量后，制備10% SDS-PAGE的凝膠取定量的總蛋白量進(jìn)行電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉 1 h，一抗TRAP、CTSK和NFATc1按照1∶1 000的濃度配制后4℃孵育過夜；次日TBST洗3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育1 h后，TBST洗3次，ECL發(fā)光液顯色。使用 Image J 軟件對(duì) Western blot條帶進(jìn)行分析。

11 統(tǒng)計(jì)與分析 采用 Graphpad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的±s表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間樣本比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMMs 分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化情況 小鼠 BMMs在含有 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，在7 ~ 10 d內(nèi)發(fā)生細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞。通過TRAP染色方法，發(fā)現(xiàn)與誘導(dǎo)1 d的BMMs細(xì)胞相比，誘導(dǎo)7 d后的BMMs細(xì)胞可形成大量多核巨細(xì)胞，且兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001；圖1)。對(duì)形成的破骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在破骨誘導(dǎo)過程中破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK和NFATc1表達(dá)升高(圖2A~C)，而破骨細(xì)胞中miR-134-5p的表達(dá)降低(P＜0.05；圖2D)，提示破骨誘導(dǎo)成功，且miR-134-5p在破骨細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用。

圖1 BMMs破骨誘導(dǎo)分化7 d后的TRAP染色A：破骨誘導(dǎo)1 d后的TRAP染色；B：破骨誘導(dǎo)7 d后的TRAP染色；C：對(duì)形成破骨細(xì)胞進(jìn)行定量分析Fig.1 TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days A: TRAP staining after the BMMs was induced for 1 day; B: TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days; C: quantitative analysis of the formation of osteoclasts

圖2 BMMs破骨誘導(dǎo)分化7 d后的破骨相關(guān)基因TRAP (A)、CTSK (B)、NFATc1(C)及miR-134-5p (D)的表達(dá)Fig.2 Expression levels of osteoclast-related genes TRAP (A), CTSK (B), NFATc1(C) and miR-134-5p after the BMMs was induced for 7 days

2 miR-134-5p 過表達(dá)和敲低模擬物轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證 BMMs轉(zhuǎn)染miR-134-5p過表達(dá)和敲低模擬物及其相應(yīng)陰性對(duì)照48 h后，通過qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。與各自陰性對(duì)照組相比，miR-134-5p過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染agomir組)破骨細(xì)胞中miR-134-5p表達(dá)顯著升高(P＜0.001)，而在miR-134-5p敲低組(轉(zhuǎn)染antagomir組)顯著降低(P＜0.05；圖3)，表明細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)miR-134-5p過表達(dá)或敲低。

圖3 miR-134-5p過表達(dá)物agomir、敲低物antagomir及其相應(yīng)對(duì)照的轉(zhuǎn)染效率 A：轉(zhuǎn)染agomir后檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率；B：轉(zhuǎn)染antagomir后檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率Fig.3 Transfection efficiency of miR-134-5p A: transfection efficiency after agomir was transfected into the BMMs;B: transfection efficiency after antagomir was transfected into the BMMs

3 miR-134-5p 抑制破骨細(xì)胞的形成 對(duì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)量，并且進(jìn)行肌動(dòng)蛋白環(huán)(F-actin)染色，同時(shí)通過qRT-PCR檢測(cè)破骨相關(guān)基因。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染agomir后，TRAP染色示agomir組中TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P＜0.01)；而轉(zhuǎn)染antagomir后，antagomir組中TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01；圖4)。通過F-actin免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白環(huán)數(shù)目，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，也顯示了同樣的結(jié)果——轉(zhuǎn)染agomir后肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成數(shù)目顯著減少，而轉(zhuǎn)染antagomir后肌動(dòng)蛋白環(huán)形成數(shù)目明顯增多(P＜0.01；圖5)。同時(shí)，通過qRT-PCR檢測(cè)破骨分化相關(guān)基因TRAP、CTSK和NFATc1，轉(zhuǎn)染agomir后破骨分化相關(guān)基因的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，相反，轉(zhuǎn)染antagomir后破骨分化相關(guān)基因表達(dá)較對(duì)照組升高(P＜0.001；圖6)。上述結(jié)果提示miR-134-5p可顯著抑制破骨細(xì)胞生成。

圖4 miR-134-5p過表達(dá)(轉(zhuǎn)染agomir)抑制破骨細(xì)胞形成，敲低(轉(zhuǎn)染antagomir)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成A：轉(zhuǎn)染agomir后進(jìn)行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞形成數(shù)目；B：轉(zhuǎn)染antagomir后進(jìn)行TRAP染色觀察破骨細(xì)胞形成數(shù)目Fig.4 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited osteoclasts formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the formation of the the osteoclasts A: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with agomir; B: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with antagomir

圖5 miR-134-5p過表達(dá)(轉(zhuǎn)染agomir)抑制肌動(dòng)蛋白環(huán)形成，敲低(轉(zhuǎn)染antagomir)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白環(huán)形成A：轉(zhuǎn)染agomir后進(jìn)行F-actin染色觀察肌動(dòng)蛋白環(huán)形成數(shù)目；B：轉(zhuǎn)染antagomir后進(jìn)行F-actin染色觀察肌動(dòng)蛋白環(huán)形成數(shù)目Fig.5 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited actin ring formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated actin ring formation A: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with agomir; B: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with antagomir

圖6 miR-134-5p過表達(dá)(轉(zhuǎn)染agomir)抑制破骨分化相關(guān)基因表達(dá)，敲低(轉(zhuǎn)染antagomir)促進(jìn)破骨分化相關(guān)基因表達(dá)A：轉(zhuǎn)染agomir后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)破骨分化相關(guān)基因表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染antagomir后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)破骨分化相關(guān)基因表達(dá)Fig.6 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited the expression levels of the osteoclast-related genes and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the expression levels of osteoclast-related genes A: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with agomir; B: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with antagomir

4 miR-134-5p 靶 基 因 預(yù) 測(cè) 為 了 進(jìn) 一 步 探究miR-134-5p抑制破骨細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制，通過TargetScan 、miRWalk、miRDB 這三個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè) miR-134-5p的靶基因，對(duì)三者所預(yù)測(cè)的結(jié)果繪制韋恩圖，得到交集靶基因。結(jié)果提示miR-134-5p與Itgb1的3’UTR區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-134-5p潛在的靶基因(圖7)。

圖7 Itgb1可能是miR-134-5p調(diào)控的靶基因A：TargetScan、miRDB及miRWalk預(yù)測(cè)的miR-134-5p交集靶基因；B：生物信息網(wǎng)站TargetScan預(yù)測(cè)miR-134-5p可能調(diào)控Itgb1以及調(diào)控位點(diǎn)區(qū)域Fig.7 Itgb1 may be the potential target gene regulated by miR-134-5p A: crosstalk of miR-134-5p target genes predicted by TargetScan, miRDB and miRWalk; B: miR-134-5p potentially targeted Itgb1 genes and its regulatory site region

5 qRT-PCR 及 Western blot檢 測(cè) miR-134-5p 靶基因Itgb1和蛋白表達(dá)量 qRT-PCR顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染agomir組中Itgb1表達(dá)顯著降低(P＜0.001)，而轉(zhuǎn)染antagomir組中Itgb1表達(dá)升高(P＜0.05；圖8)。Western blot檢測(cè) Itgb1 蛋白的表達(dá)水平，條帶結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染agomir后Itgb1蛋白表達(dá)量減少，轉(zhuǎn)染antagomir后Itgb1蛋白表達(dá)量增加，對(duì)Western blot條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，也呈現(xiàn)同樣的結(jié)果(P＜0.01；圖9)。

圖8 qRT-PCR顯示過表達(dá)或敲低miR-134-5p對(duì)Itgb1基因表達(dá)的影響 A：過表達(dá)miR-134-5p后Itgb1基因表達(dá)降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1基因表達(dá)升高Fig.8 Expression level of Itgb1 gene was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 gene decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 gene increased with knockdown of miR-134-5p

圖9 Western blot顯示過表達(dá)或敲低miR-134-5p對(duì)Itgb1蛋白表達(dá)的影響 A：過表達(dá)miR-134-5p后Itgb1蛋白表達(dá)降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1蛋白表達(dá)升高Fig.9 Expression level of Itgb1 protein was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 protein decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 protein increased with knockdown of miR-134-5p

討 論

骨改建是生物體受外界干預(yù)后發(fā)生的復(fù)雜生理性反應(yīng)，其發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)即骨組織的可塑性，也是人們研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[9]。多種細(xì)胞參與了骨改建的過程，如成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，其中破骨細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。破骨細(xì)胞的發(fā)生主要是通過RANK受體激活RANKL，從而引起下游NF-κB和其他信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)NFATc1的表達(dá)，繼而引起包括TRAP、MMP9、Cathepsin K等破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)升高[10]。這一過程受到多種細(xì)胞因子和蛋白的調(diào)控，其中miRNA的作用不可忽視。miRNA是一類保守性強(qiáng)、內(nèi)源性的非編碼小RNA，由多種酶加工合成，其通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)域結(jié)合起到識(shí)別和沉默靶基因的作用[11]。miRNA在包括增殖、代謝和疾病發(fā)生等領(lǐng)域都發(fā)揮著不同的作用，其中包括骨改建的過程。Guo等[12]研究發(fā)現(xiàn)口頜面發(fā)育過程中miR-206-3p可以促進(jìn)成骨，而抑制破骨細(xì)胞分化。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導(dǎo)的骨丟失中miR-1247-5p發(fā)揮著重要作用。

在血管平滑肌組織中，Choe等[8]發(fā)現(xiàn)miR-134-5p可通過抑制組蛋白去乙?；?促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中鈣沉積。而成骨細(xì)胞正是通過鈣沉積逐漸形成骨基質(zhì)，這提示我們miR-134-5p與骨再生密切相關(guān)[8,14]。然而，miR-134-5p在骨改建過程中的作用尚未見報(bào)道。因此本研究關(guān)注于破骨分化，主要探討了miR-134-5p在破骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮的作用。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，利用小鼠BMMs進(jìn)行破骨誘導(dǎo)分化，miR-134-5p的表達(dá)在破骨發(fā)展過程中降低，據(jù)此我們猜想miR-134-5p在破骨過程中發(fā)揮作用。因此，我們通過在BMMs中分別轉(zhuǎn)染miR-134-5p過表達(dá)物(agomir)、miR-134-5p敲低物(antagomir)及其各自的陰性對(duì)照后進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，驗(yàn)證miR-134-5p在其中的具體作用。我們采用TRAP染色和F-actin染色驗(yàn)證破骨細(xì)胞的形成[15]。結(jié)果顯示，與其陰性對(duì)照相比，agomir組TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核數(shù)目大于3的破骨細(xì)胞數(shù)量和肌動(dòng)蛋白環(huán)數(shù)目明顯減少，這說(shuō)明miR-134-5p抑制了骨髓巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的形成和分化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-134-5p在破骨細(xì)胞分化中的抑制作用，我們檢測(cè)了破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK和NFATc1的表達(dá)，在過表達(dá)后其均下降，而敲低后均上調(diào)，與染色結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，miR-134-5p可以負(fù)調(diào)控破骨進(jìn)程從而影響B(tài)MMs的破骨分化，這與Dinesh等[16]的結(jié)果相似。同樣，Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-134-3p在創(chuàng)傷性股骨頭修復(fù)中起積極作用，可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，進(jìn)而加速骨組織的修復(fù)。

接下來(lái)，我們尋找miR-134-5p可能的靶標(biāo)，我們通過生物信息學(xué)方法，通過將TargetScan、miRDB和miRWalk三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于miR-134-5p可能調(diào)控的基因取交集，對(duì)miR-134-5p的潛在靶基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Itgb1可能是miR-134-5p的潛在靶基因。過表達(dá)miR-134-5p會(huì)引起Itgb1的mRNA和蛋白表達(dá)量減少，從而發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞形成的功能。既往研究表明，整合素受體不僅是細(xì)胞黏附和遷移的效應(yīng)器，在細(xì)胞分化過程中也發(fā)揮著重要作用。Itgb1可調(diào)節(jié)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、Ⅱ型肺上皮細(xì)胞分化以及軟骨發(fā)生等，同時(shí)Itgb1在多種細(xì)胞表面表達(dá)，其中包括破骨細(xì)胞[18-19]。Wang等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)Itgb1作為IGFBP1的關(guān)鍵受體，對(duì)于其發(fā)揮促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的功能至關(guān)重要。而miR-134-5p和Itgb1的靶向關(guān)系及二者在破骨細(xì)胞中發(fā)揮的作用尚未見報(bào)道。

綜上所述，miR-134-5p可能通過抑制Itgb1基因表達(dá)來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成，從而參與骨改建的過程。但若要明確miR-134-5p對(duì)Itgb1基因的具體調(diào)控作用，仍需進(jìn)一步的luciferase實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并有必要完善miR-134-5p對(duì)破骨細(xì)胞分化、凋亡的影響。