豬圓環(huán)病毒2d 型滅活苗臨床免疫效果評(píng)價(jià)

肖 敏 ，劉 建 ，盧 昌 ，曹華斌 ，王 闖 *

（1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330096；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type-2，PCV2）是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原體。PCV2 在各個(gè)國(guó)家和地區(qū)都普遍存在，且各個(gè)階段的豬群均表現(xiàn)出極強(qiáng)的易感性。PCV2 感染后主要是侵害豬的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，從而繼發(fā)感染其他病原微生物，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。PCV2 的危害性并不只是針對(duì)于該病毒，而是因主要表現(xiàn)在它與豬副嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、豬藍(lán)耳病病毒以及豬細(xì)小病毒等的繼發(fā)感染。

根據(jù)PCV2 基因序列的差異，可將其分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 和PCV2e 五個(gè)亞型。Wei 等在2011-2012 對(duì)華南大區(qū)分離的66 株P(guān)CV2 進(jìn)行基因分析，結(jié)果顯示其中45 株為PCV2d型，占比68.2%。2013-2015 年，Zhan 等對(duì)中國(guó)南部地區(qū)的62 株P(guān)CV2 分離株進(jìn)行基因比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2d 型高達(dá)72.6%。Qu 等在2012-2016 年在湖南地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在PCV2 陽(yáng)性樣本中PCV2d 的感染率為67%。這些表明，在我國(guó)PCV2d 已日漸成為主要的流行毒株。GUO 等用PCV2a、PCV2b 和PCV2d 三個(gè)毒株分別給30 日齡健康仔豬進(jìn)行攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2d 攻毒組在病變臟器中的核酸拷貝數(shù)高于PCV2a 和PCV2b 組，表明PCV2d 的毒力強(qiáng)于PCV2a 和PCV2b，目前，我國(guó)大部分豬場(chǎng)都是PCV2 陽(yáng)性場(chǎng)，并且很難凈化，也沒(méi)有可以治療的特效藥。因此，對(duì)于圓環(huán)病毒的防控主要還是依靠疫苗免疫。滅活苗的穩(wěn)定性好，安全性高，目前市場(chǎng)上應(yīng)用最廣的還是圓環(huán)病毒滅活苗。

本研究采用PCV2 的2d 型毒株制備了PCV2 滅活苗，通過(guò)免疫35 日齡仔豬，利用血清抗體和抗原陽(yáng)性率等指標(biāo)評(píng)價(jià)其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

病毒為江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物保健研究所從湖北黃岡某豬場(chǎng)的陽(yáng)性病料中分離，經(jīng)測(cè)序分析為PCV2d 型，命名為HB/ZB 株，經(jīng)測(cè) 定TCID50為107.0/mL；PK15 細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。

1.2 主要試劑與試驗(yàn)動(dòng)物

ISA206 佐劑，購(gòu)自法國(guó)賽比克；DNA 提取試劑盒，購(gòu)自金瑞鴻捷生物科技有限公司；豬圓環(huán)病毒2 型ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：B20181214），購(gòu)自韓國(guó)金諾；商品苗A、B（均為2b 型毒株滅活苗）為國(guó)藥動(dòng)保和貴州福斯特公司生產(chǎn)。120 頭21 日齡健康仔豬，集團(tuán)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)自養(yǎng)。

1.3 滅活疫苗的制備與檢驗(yàn)

按 1∶2 000 比例向病毒液中緩慢加入β-丙內(nèi)酯，邊加邊攪拌，然后在4℃條件下攪拌滅活48 h，再置于37℃水浴2 h。取滅活病毒液與PK15 克隆細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL）按1∶9 混合，接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。同時(shí)設(shè)置病毒陽(yáng)性對(duì)照，盲傳3 代，采用間接免疫熒光法進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。

將檢驗(yàn)合格的滅活病毒液置于乳化容器中，按水相與油佐劑3∶1 的比例緩慢加入ISA206 佐劑，邊加邊攪拌，然后以800 r/min 攪 拌30 min，制 成水包油型疫苗。對(duì)成品苗進(jìn)行無(wú)菌和物理性狀的檢驗(yàn)，按照現(xiàn)行的《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.4 對(duì)仔豬的免疫效果評(píng)價(jià)

將120 頭21 日齡仔豬，隨機(jī)分成4組，每組30頭。分別為試驗(yàn)組，商品苗A 組，商品苗B 組，對(duì)照組。試驗(yàn)組每頭仔豬頸部肌肉注射2 mL對(duì)應(yīng)疫苗，對(duì)照組注射2 mL 生理鹽水。分別于免疫后7 d、14 d、21 d、35 d、105 d 采集血清。免疫后35 d、105 d 稱體重，記錄死亡數(shù)，統(tǒng)計(jì)成活率。

免疫后21 d、105 d 血清中核酸數(shù)量的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法。根據(jù)Genbank 中已知的PCV2 基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為F：CCAGGAGGGCGTTCTGACT，R：CGTTACCGCTGGAGAAGGAA，引物由華大基因合成。擴(kuò)增體系 為20 μL：TB Green Premix DimerEraser（2X）10 μL，ROX Reference Dye（50X）0.4 μL，上、下游引物各（10 μmol/L）0.6 μL，模板2 μL，滅菌水6.4 μL。標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室制備并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。

血清中抗體水平的檢測(cè)采用間接ELISA 法，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件，對(duì)各組間數(shù)據(jù)通過(guò)單因素方差分析（One-Way ANOVA），抗原與抗體陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗的檢驗(yàn)

在熒光顯微鏡下未觀察到熒光，表明滅活徹底。外觀檢驗(yàn)為乳白色，穩(wěn)定性試驗(yàn)：800×g 離心15 min 未出現(xiàn)破乳現(xiàn)象。無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)無(wú)菌落形成，無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

2.2 對(duì)仔豬的免疫效果評(píng)價(jià)

2.2.1 疫苗對(duì)體重及成活率的影響

免疫105 d 后試驗(yàn)組存活率為93%，商品苗A 組和商品苗B 組的存活率分別為95%、93%，未免疫對(duì)照組的存活率為70%。試驗(yàn)組與商品苗組的存活率都高于對(duì)照組。由表1 可以看出，免疫前各組體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），免疫35 d、105 d 后試驗(yàn)組與商品苗的2 個(gè)組的增重均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 免疫35 d、105 d 后各組體重 kg/頭

2.2.2 疫苗對(duì)仔豬血液病毒載量的影響

免疫后21 d 各組血清抗原檢測(cè)均為陰性。由表2 可以看出，免疫后105 d 試驗(yàn)組與2 個(gè)商品苗組抗原含量與抗原陽(yáng)性率顯著低于陰性的對(duì)照組（P＜0.05），且試驗(yàn)組的抗原陽(yáng)性率又顯著低于兩個(gè)商品苗組（P＜0.05）。

表2 免疫105 d 后各組抗原含量和抗原陽(yáng)性率

2.2.3 疫苗對(duì)仔豬抗體水平的影響

免疫前后不同日齡各組血清抗體水平見(jiàn)圖1，免疫前后各組血清抗體陽(yáng)性率見(jiàn)表3。從圖1 和表3 可以看出，免疫前各組抗體水平較高，且抗體陽(yáng)性率100%，表明該豬群母源抗體水平較好。免疫后35 d 各組的抗體水平持續(xù)下降并到達(dá)最低點(diǎn)，但此時(shí)試驗(yàn)組仍能維持較高的陽(yáng)性率，且抗體水平高于其余3 組。免疫后105 d，各組抗體全部升高，各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 免疫前后不同日齡各組血清抗體水平

表3 免疫前后各組血清抗體陽(yáng)性率

3 討論

2014-2015 年翟寶庫(kù)等對(duì)大慶周邊的未免疫豬群進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示豬群PCV2 的感染率為54.7%。時(shí)慶賀等對(duì)2016-2017 年 對(duì)13 份PCV2 陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序分析，其中7 株為2b 型，6 株為2d 型。吳明臻等對(duì)浙江金華地區(qū)2012-2018 年的PCV2 進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)PCV2c型 和PCV2e 型，PCV2a 和PCV2b均為13.04%，PCV2d 型占73.91%。表明流行毒株在逐漸向2d 型過(guò)渡。因此本研究選用本實(shí)驗(yàn)室分離的2d型毒株HB/ZB 株來(lái)制備滅活苗，對(duì)于豬群抵抗PCV2 感染提供更好的保護(hù)作用。

本研究中的免疫組的仔豬均增重顯著高于對(duì)照組，這與莊汝柏、周華林等的研究結(jié)果一致。PCV2 感染常導(dǎo)致豬皮炎與腎病綜合征、滲出性皮炎、先天性震顫和腸炎、肉芽腫性腸炎、生殖障礙、豬呼吸道疾病綜合征，亞臨床型感染的特點(diǎn)是生長(zhǎng)性能不良。本研究中研制的滅活苗能顯著地提高仔豬的均增重，表明該疫苗對(duì)有效改善PCV2 的亞臨床感染方面有良好的效果。

翟寶庫(kù)等研究發(fā)現(xiàn)，仔豬僅免疫1 針PCV2 疫苗，抗體水平并不能達(dá)到理想效果，需在首免后2～4 周再進(jìn)行1 次加強(qiáng)免疫才能獲得更好的保護(hù)力。吳忻等選擇抗體陰性的14 日齡仔豬進(jìn)行免疫，在免疫后6 周抗體陽(yáng)性率才達(dá)到100%，仔豬存在較長(zhǎng)時(shí)間的抗體空檔期。這與本研究中仔豬育肥前期抗體陽(yáng)性率100%，抗原全陰性的結(jié)果一致。本研究中在免疫后35 d 對(duì)照組與2 個(gè)商品苗組雖然抗體水平維持在臨界水平以上，但是抗體陽(yáng)性率都低于80%，表明在育肥后期，這些豬對(duì)于PCV2 的感染已經(jīng)不具備足夠的保護(hù)力。這個(gè)結(jié)論在抗原檢測(cè)上也得到了證實(shí)，免疫后105 d 各組抗原陽(yáng)性率開(kāi)始急劇升高。因此有必要在6 周齡以前再進(jìn)行1 次加強(qiáng)免疫。