艾絨的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

袁銘銘，姚閩，雷景邦

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西省藥品監(jiān)督管理局，江西 南昌 330029

艾葉Artemisiae ArgyiFolium 來(lái)源于菊科蒿屬植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥葉，具有散寒止痛，溫經(jīng)止血的功效［1］。現(xiàn)代研究表明，艾葉的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)以及三萜類(lèi)等［2-5］。艾葉具有平喘鎮(zhèn)咳、抗病毒、解熱鎮(zhèn)靜、止血、祛痰、抗凝血、抗菌、抗氧化等作用［4-6］。艾絨是由艾葉料剔除塵土粗梗、粉碎、然后過(guò)篩篩除葉肉、葉梗以及葉脈等粉末得到篩上層艾絨［7］，目前市場(chǎng)上出售的艾絨，多數(shù)標(biāo)以比例2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、30∶1 等標(biāo)簽，如葉絨比2∶1的表示為將2 kg 的艾葉制備得到1 kg 的艾絨，即艾絨在炮制過(guò)程中篩除掉的雜質(zhì)越多，得到的艾絨的量越低，艾絨的純度越高，一般質(zhì)量越好。而目前對(duì)于艾絨質(zhì)量的研究較少。本研究為艾絨建立穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確的鑒別和含量測(cè)定方法，填補(bǔ)該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下空白項(xiàng)，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），Agilent 1260 型高效液相色譜儀（HPLC）（美國(guó)Agilent 公司），XSE-205 型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），ME204TE 型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 主要藥品與試劑

異澤蘭黃素（批號(hào)：CFN99117，純度99.2%）對(duì)照品購(gòu)于上海洽姆儀器科技有限公司；艾葉（批號(hào)：121345-201804）對(duì)照藥材購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（SIGMA 公司）為色譜純；水為去離子超純水，其他試驗(yàn)用試劑試藥均為分析純。

本研究共收集艾葉藥材5 批，分別來(lái)自江西贛州（1 批）、湖北蘄春（1 批）、湖北隨州（1 批）和河南南陽(yáng)（2 批），所有藥材經(jīng)鑒定均為菊科植物艾的干燥葉。參考艾絨制備工藝流程，本研究采用DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機(jī)將各批次艾葉粉碎，將粉碎的艾葉過(guò)篩，通過(guò)過(guò)篩后剩余艾絨的質(zhì)量制成不同葉絨比的艾絨飲片，具體艾絨信息見(jiàn)表1。

表1 20批不同葉絨比等級(jí)的艾絨信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 稱取艾絨樣品1 g，加石油醚（60～90 ℃）25 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，用正己烷1 mL 使溶解，即得。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 取艾葉對(duì)照藥材1 g，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照藥材溶液，即得。

2.1.3 方法與結(jié)果 照《中國(guó)藥典》（2020 年版四部附錄）薄層色譜法［8］試驗(yàn)，分別吸取艾葉對(duì)照藥材溶液和供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）作為展開(kāi)劑，2%香草醛硫酸溶液為顯色劑，并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢測(cè)，在和艾葉對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該方法斑點(diǎn)分離度較好、斑點(diǎn)清晰，可作為艾絨的專(zhuān)屬性鑒別方法，色譜圖如圖1 所示。

圖1 艾絨與對(duì)照藥材的薄層色譜圖

2.2 高效液相含量測(cè)定

2.2.1 溶液制備（1）艾絨樣品溶液的制備：取艾絨樣品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再次稱重，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（2）異澤蘭黃素對(duì)照品溶液的制備：精密稱取異澤蘭黃素對(duì)照品18.85 mg，置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取上述異澤蘭黃素對(duì)照品溶液5 mL 置于50 mL 容量瓶中，用80%甲醇使溶解并定容，搖勻，即得每1 mL 含異澤蘭黃素濃度為0.018 7 mg/mL 的對(duì)照品溶液。（3）空白溶液的制備：以供試品的提取溶液（80%甲醇溶液）作為空白溶液。

2.2.2 色譜條件 采用CAPCELL PAK C18MG Ⅱ S5（4.6 mm×250 mm,5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）為流動(dòng)相；流動(dòng)相流速為1.0 mL/min；設(shè)定波長(zhǎng)為344 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.3 專(zhuān)屬性考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液、異澤蘭黃素對(duì)照品溶液以及空白溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果如圖2 所示，待測(cè)成分的色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)按異澤蘭黃素色譜峰計(jì)不低于5 000；空白溶液對(duì)待測(cè)成分均無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性好。

圖2 艾絨的HPLC色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)稀釋后的對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，分別按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以異澤蘭黃素的進(jìn)樣量（x，μg）作為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性關(guān)系考察，得回歸方程Y=3 188.693 3X+4.759 6，r=0.999 9。結(jié)果表明，異澤蘭黃素在0.018 7～0.561 μg 和峰面積具有較好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取異澤蘭黃素對(duì)照品溶液10 μL，照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，異澤蘭黃素峰面積的RSD（n=6）為0.35%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1）6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，然后按照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定峰面積，記錄每份樣品的峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算艾絨樣品中異澤蘭黃素的含量。結(jié)果測(cè)得異澤蘭黃素的平均含量（n=6）為1.747 mg/g，RSD 為0.71%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一艾絨樣品（編號(hào)AR-1），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，分別與制備后在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果，異澤蘭黃素峰面積的RSD（n=6）0.50%，表明該艾絨樣品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的艾絨樣品（編號(hào)AR-1）6 份，每份0.25 g，精密稱定，分別按已知量的100%加入含異澤蘭黃素（0.009 35 mg/mL）的溶液50 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備回收率樣品溶液，然后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 艾絨中異澤蘭黃素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 艾絨樣品含量測(cè)定 取20 批艾絨樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備艾絨樣品溶液，然后照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法分別計(jì)算艾絨樣品中異澤蘭黃素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 艾絨中異澤蘭黃素的含量結(jié)果（n=3，mg/g）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別項(xiàng)

通過(guò)考察石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（3∶1）、三氯甲烷-甲醇（15∶1）以及石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）三個(gè)不同展開(kāi)劑系統(tǒng)，結(jié)果顯示石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）作為展開(kāi)劑分離效果最好。

3.2 含量測(cè)定項(xiàng)

3.2.1 樣品提取方法的優(yōu)化 本研究分別采用30%

甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇為提取溶劑對(duì)艾絨樣品進(jìn)行提取。結(jié)果顯示，以80%甲醇為提取溶劑時(shí)，異澤蘭黃素色譜峰的分離度較好，且含量最高，因此選擇80%甲醇作為艾絨樣品的提取溶劑。又分別考察了超聲提取和回流提取兩種提取方法對(duì)艾絨樣品中異澤蘭黃素的影響，發(fā)現(xiàn)回流提取的色譜峰峰面積明顯大于超聲提取，含量更高，故本研究選擇回流提取的方式作為艾絨樣品的提取方式。此外，考察不同提取時(shí)間（30、60、90 min），不同料液比（1∶50、1∶100、1∶200 g/mL）對(duì)異澤蘭黃素含量的影響，最終擇優(yōu)選擇提取時(shí)間60 min、料液比1∶50（g/mL）。

3.2.2 色譜條件的優(yōu)化 本研究考察了4 種流動(dòng)相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）進(jìn)行了色譜條件的摸索。發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）作為流動(dòng)相時(shí)，樣品圖譜中異澤蘭黃素的色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）作為流動(dòng)相。同時(shí)，采用DAD檢測(cè)器在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，異澤蘭黃素在為344 nm 附近有最大吸收，且色譜峰與其余色譜峰分離良好，基線較平，故最終選擇344 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)：（1）建立了艾絨薄層鑒別方法，該法斑點(diǎn)清晰，分離度好；（2）測(cè)定了20 批不同葉絨比艾絨中含量，結(jié)果不同批次的含量差異較明顯，同時(shí)呈現(xiàn)出葉絨比越大，含量越低，這可能與艾絨在加工制備時(shí)需要不斷的過(guò)篩，篩除掉艾粉和艾渣，艾粉主要為艾葉的葉肉組織，其內(nèi)含有大量的有機(jī)成分。因此，葉絨比越大的艾絨，所含的雜質(zhì)和艾粉越少，異澤蘭黃素含量就越低。本實(shí)驗(yàn)所建立的定性定量方法為進(jìn)一步完善艾絨的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供參考依據(jù)。