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    數(shù)字序列分析對(duì)兩種大蒜總氨基酸測(cè)定方法結(jié)果間的相關(guān)性研究

    2022-03-31 02:07:30擺富葉張婷婷劉睿婷李蘭蘭李喬喬安澤沖李新霞
    關(guān)鍵詞:茚三酮百靈精氨酸

    擺富葉,張婷婷,劉睿婷,2,李蘭蘭,李喬喬,安澤沖,王 巖,李新霞

    (1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011;2新疆大蒜藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830013)

    大蒜(Allium SativumL.)為百合科或蔥科蔥屬植物蒜的地下鱗莖,富含多種氨基酸[1-2],具有抗氧化[3-4],保護(hù)肝臟、降低血小板凝集[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、抗輻射[7]、抗炎[8-9]、抗腫瘤[10-11]等功效,多用于抗腫瘤治療,其中的精氨酸還具有免疫調(diào)節(jié)及抗氧化功能[12-15]。目前測(cè)定氨基酸的方法主要有光譜法、色譜法和氨基酸分析儀直接分析法[16-17]。光譜法采用茚三酮顯色法測(cè)總氨基酸,其原理是茚三酮將α-氨基酸氧化成亞氨基后水解成氨與還原的茚三酮和茚三酮之間發(fā)生縮合,產(chǎn)生藍(lán)紫色產(chǎn)物,根據(jù)這個(gè)有色反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可見光譜法定量。在植物中有多種氨基酸,根據(jù)反應(yīng)原理采用一個(gè)氨基酸對(duì)照品為替代,以它計(jì)總氨基酸含量是一個(gè)經(jīng)典的方法,它的優(yōu)點(diǎn)是快速、節(jié)省對(duì)照品,方法的穩(wěn)定性好,易于操作,適用于大樣本量對(duì)總氨基酸含量數(shù)據(jù)有需求的分析測(cè)定。色譜法常采用柱前衍生化,異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate,PITC)為柱前衍生氨基酸分析常用試劑,該法可以測(cè)定每一種氨基酸的具體含量,但操作冗長(zhǎng),檢測(cè)成本較高。氨基酸分析儀只能測(cè)定18種已有對(duì)照品的氨基酸,但特殊氨基酸,如蒜氨酸不包括在內(nèi),且儀器價(jià)格相對(duì)昂貴。數(shù)字序列相關(guān)性分析法[18]是判斷兩個(gè)序列是否具有線性或擬線性關(guān)系的方法。本研究采用茚三酮顯色-可見分光光度法(茚三酮顯色-Vis 法)和PITC 衍生化-HPLC 法(HPLC 法)分別測(cè)定大蒜總氨基酸的含量,采用數(shù)字序列相關(guān)分析法分析兩種測(cè)定方法間的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀(日本島津公司);UV2550 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);AB135-S分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

    1.2 試劑對(duì)照品:天冬氨酸(百靈威,批號(hào)L660Q23),谷氨酸(百靈威,批號(hào)LQ80Q22),絲氨酸(百靈威,批號(hào)LD10Q112),甘氨酸(百靈威,批號(hào)L6C0Q29),組氨酸(百靈威,批號(hào)L650Q40),精氨酸(百靈威,批號(hào)L280Q27),蘇氨酸(百靈威,批號(hào)LB50P24),丙氨酸(百靈威,批號(hào)LR40Q23),酪氨酸(百靈威,批號(hào)LT60Q16),纈氨酸(百靈威,批號(hào)L330Q56),苯丙氨酸(百靈威,批號(hào)LG50Q57),蛋氨酸(百靈威,批號(hào)LK70Q23),賴氨酸(百靈威,批號(hào)LR60Q15),天冬酰胺(百靈威,批號(hào)L280Q59),脯氨酸(百靈威,批號(hào)LE30Q108),亮氨酸(百靈威,批號(hào)L210Q38),色氨酸(百靈威,批號(hào)LL90Q74),S-烯丙基-L-半胱氨酸(東京化成,批號(hào)J4ZFO-JK),S-甲基-L-半胱氨酸(東京化成,批號(hào)KNGB J-I C),蒜氨酸(新疆埃樂欣,批號(hào)AL160526),正己烷(天津天新,批號(hào)20180710),茚三酮(中國(guó)醫(yī)藥,批號(hào)20040318),磷酸二氫鉀(天津致遠(yuǎn),批號(hào)2019062059),三乙胺(天津光復(fù),批號(hào)20110509),磷酸氫二鈉(天津致遠(yuǎn),批號(hào)201907205),異硫氰酸苯酯(百靈威,批號(hào)T7530),乙酸鈉(天津福晨,批號(hào)20140804),冰醋酸(天津富宇,批號(hào)20120911),乙腈(美國(guó)Sigma)、甲醇(美國(guó)Sigma)。

    1.3 藥材大蒜于2021年8月-9月購(gòu)買自11個(gè)產(chǎn)地(1-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)秋播大蒜、2-康其鄉(xiāng)大蒜、3-黑英山五大隊(duì)大蒜、4-托克遜鄉(xiāng)九村秋播大蒜、5-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)春播大蒜、6-托克遜鄉(xiāng)九村春播大蒜、7-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)秋蒜、8-托克遜鄉(xiāng)一村春播大蒜、9-托克遜鄉(xiāng)一村秋播大蒜、10-大橋鄉(xiāng)五村大蒜、11-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)春蒜);大蒜粉于2018 年10 月24 日購(gòu)買自23個(gè)產(chǎn)地(12-甘肅武威(紫皮蒜)、13-青海西寧(獨(dú)頭蒜)、14-河南、15-青海西寧(白蒜)、16-山東(巴里坤種植)、17-甘肅武威(獨(dú)頭蒜)、18-青海西寧(紅蒜)、19-新疆拜城縣、20-新疆昭蘇、21-山東(紫皮蒜)、22-李寨三社、23-新疆且末(大蒜)、24-新疆巴里坤(第一批次)、25-新疆且末(高原香蒜)、26-新疆且末(香蒜)、27-名聯(lián)十二社、28-甘肅酒泉(第一批次)、29-新疆塔城、30-新疆巴里坤(第二批次)、31-新疆三棵樹(第四批次)、32-新疆吉木薩爾、33-甘肅酒泉(第二批次)、34-甘肅民樂),經(jīng)冷凍干燥后獲得大蒜的凍干粉。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 茚三酮顯色-Vis法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

    2.1.1 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液的配制(pH8.0):取0.9 %磷酸二氫鉀溶液10 mL 加入2.4 %磷酸氫二鈉溶液190 mL混勻即得。2%茚三酮溶液的配制:稱取2.0 g 茚三酮置于錐形瓶,加入70 mL 蒸餾水溶解,加入氯化亞錫80 mg,過濾,蒸餾水定容至100 mL,備用。氨基酸對(duì)照品溶液的配制:稱定精氨酸對(duì)照品0.1 g 置于50 mL 量瓶中,用蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,即得(每1 mL中約含精氨酸2.0 mg)。

    2.1.2 供試品溶液制備 大蒜經(jīng)凍干粉碎獲得蒜粉,稱取大蒜粉0.5 g 置于50 mL 量瓶中,加5 mL 甲醇超聲10 min,加水定容至刻度,搖勻,離心,取上清液備用。稱取大蒜100 g 于500 mL 的燒杯,加水200 mL煮沸10 min,勻漿,轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶,加水定容至刻度,離心,取上清備用。

    2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 量取1.0 mL 供試品或?qū)φ掌啡芤?,置?0 mL 具塞試管中,加磷酸鹽緩沖液(pH8.0)至5.0 mL,加1.0 mL 2%茚三酮溶液,80℃水浴30 min,放置室溫,加水至16.0 mL。以相應(yīng)的試劑為空白,測(cè)定567 nm處的吸光度。

    2.1.4 回歸方程的建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求量取精氨酸對(duì)照品溶液0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL,分別置20 mL 具塞試管中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定,以濃度和吸光度分別為橫縱坐標(biāo),建立回歸方程:Y=0.004 2X-0.640 1,r=0.999 5。結(jié)果表 明,在200.00~400.00 μg/mL范圍內(nèi)氨基酸的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

    2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 量取供試品溶液6 份,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,結(jié)果精密度RSD<2%。

    2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,每隔5 min 測(cè)定1 次已反應(yīng)完畢的供試品溶液,連續(xù)測(cè)定45 min。結(jié)果表明,在45 min 內(nèi)氨基酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度穩(wěn)定。

    2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按1:1 加入精氨酸對(duì)照溶液(0.3 mg/mL)于供試品溶液(5.002 mg/mL)(n=6)中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,結(jié)果顯示加樣回收率在95.0%~105.0%范圍內(nèi),RSD<2.0%。

    2.1.8 含量測(cè)定分別稱取31 批不同批號(hào)的大蒜樣品(n=3),按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定567 nm 處吸光度,以精氨酸計(jì)大蒜總氨基酸含量,見表1。

    表1 茚三酮顯色-Vis法和HPLC法測(cè)定31批大蒜總氨基酸含量及數(shù)據(jù)變換結(jié)果

    2.2 HPLC法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

    2.2.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液的配制:稱取適量各氨基酸對(duì)照品,加水溶解并稀釋至所需濃度(天冬氨酸:151.44 μg/mL,谷氨酸:146.76 μg/mL,絲氨酸:82.08 μg/mL,甘氨酸:80.96 μg/mL,組氨酸:78.56 μg/mL,精氨酸:1002.14 μg/mL,蘇氨酸:161.04 μg/mL,丙氨酸:159.88 μg/mL,脯氨酸:161.52 μg/mL,酪氨酸:80.44 μg/mL,纈氨酸:149.12 μg/mL,蛋氨酸:131.56 μg/mL,亮氨酸:80.36 μg/mL,苯丙氨酸:148.40 μg/mL,色氨酸:79.52 μg/mL,賴氨酸:151.72 μg/mL,S-烯丙基-L-半胱氨酸:98.28 μg/mL,S-甲基-L-半胱氨酸:80.72 μg/mL,天冬酰胺:98.80 μg/mL),備用。蒜氨酸對(duì)照品溶液的配制:稱取蒜氨酸對(duì)照品適量,用50%甲醇配制成濃度為368 μg/mL的溶液,備用。

    2.2.2 供試品溶液的配制 鮮蒜經(jīng)凍干得蒜粉,取各產(chǎn)地蒜粉100 mg 置于10 mL 容量瓶中,加5 mL 甲醇超聲10 min,用水定容至刻度,即得。大蒜供試品溶液配制見“2.1.2”。

    2.2.3 色譜條件 色譜柱:日本島津VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相A:pH6.5 乙酸鈉溶液(1 000 mL-乙腈70 mL);流動(dòng)相B:甲醇-乙腈-水(20∶60∶20),檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流速1.0 mL/min,柱溫35℃,進(jìn)樣量10 μL,按流動(dòng)相A:0~5 min,98%;5~6 min,95%;6~14 min,91%;14~18 min,79%;18~32 min,55%;32~34 min,45%;34~38 min,0%,程序洗脫,見圖1。

    圖1 20種氨基酸對(duì)照品HPLC色譜圖

    2.2.4 含量測(cè)定 取供試品溶液,衍生化處理,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以外標(biāo)法對(duì)各氨基酸含量進(jìn)行計(jì)算,各氨基酸含量結(jié)果之和為大蒜總氨基酸含量,結(jié)果見表1。

    2.3 建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸相關(guān)性數(shù)學(xué)模型采用數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果是否具有相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型,用相關(guān)系數(shù)Cμ1·μ2、r來(lái)判斷。

    按不同方法分別計(jì)算相關(guān)系數(shù)得:

    式中:Cμ1·μ2,r為相關(guān)系數(shù),μ1、μ2和x、y 為變量,μ1=xi/maxxi,μ2=yi/maxyi),xi和yi分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量;maxxi和maxyi分別是茚三酮顯色-Vis法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量中的最大值,x和y分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量變換結(jié)果。按照Cμ1·μ2相關(guān)程度判定:若|Cμ1·μ2|<0.5,無(wú)明顯相關(guān)性;若|Cμ1·μ2|≥0.9,有相當(dāng)明顯相關(guān)性。按照r相關(guān)程度判定:若0.7≤|r|<1,高度相關(guān);若|r|<0.4,低度相關(guān)。本研究將茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)按μ1=xi/maxxi,μ2=yi/maxyi進(jìn)行數(shù)據(jù)變換,見表1。將表1 數(shù)據(jù)按照公式(1)和(2)計(jì)算得:Cμ1·μ2=0.921 7,r=0.932 0,表明測(cè)定大蒜總氨基酸含量所采用的茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法具有“相當(dāng)明顯即高度相關(guān)性”,擬合出線性方程:Y=1.003 3X+2.278 1,r=0.932 0,且P<0.01,說明相關(guān)性具有顯著性意義,見圖2。

    圖2 兩法測(cè)定大蒜總氨基酸含量的回歸曲線

    2.4 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證隨機(jī)抽取3 批大蒜粉進(jìn)行茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量,所得數(shù)據(jù)用本文建立的相關(guān)性數(shù)學(xué)模型分析,驗(yàn)證相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的適用性。結(jié)果表明茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量測(cè)算HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量,與HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量的真實(shí)值比較,絕對(duì)值誤差較小,說明該相關(guān)性數(shù)學(xué)模型具有較高的適用性,見表2。

    表2 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證

    3 討論

    茚三酮顯色-Vis 法的原理是含有伯氨基的氨基酸經(jīng)茚三酮氧化為游離氨,再與茚三酮及還原性茚三酮縮合成藍(lán)紫色產(chǎn)物,根據(jù)該產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行定量測(cè)定,因此不論氨基酸是何種結(jié)構(gòu),只要含有伯氨基,均可定量轉(zhuǎn)化為游離氨,可以反映含有伯氨基的氨基酸總含量。本研究采用20種氨基酸對(duì)其經(jīng)茚三酮氧化后縮合產(chǎn)物的光譜分別進(jìn)行了掃描,對(duì)縮合反應(yīng)條件進(jìn)行了考察,是穩(wěn)定可靠的,故選擇567 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。但無(wú)法檢測(cè)到脯氨酸和天冬酰胺在567 nm 處的最大吸收峰,因脯氨酸是沒有伯氨基的,與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì);天冬酰胺則因?yàn)榱硗夂粋€(gè)酰胺基可與茚三酮反應(yīng),生成棕色產(chǎn)物。因此任選一種含有伯氨基的氨基酸,就可以采用茚三酮顯色-Vis 法對(duì)總氨基酸進(jìn)行含量測(cè)定。本研究以精氨酸為對(duì)照品,是因?yàn)榫彼崤c蒜氨酸占大蒜總氨基酸含量的80%以上,精氨酸約為總氨基酸的49%,而精氨酸與蒜氨酸相比易獲得、更經(jīng)濟(jì),以精氨酸為對(duì)照品采用茚三酮顯色-Vis 法測(cè)定大蒜總氨基酸是可靠的,缺點(diǎn)是不知道各氨基酸分別是多少。

    茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果通過數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立相關(guān)性數(shù)學(xué)模型,并由茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜總氨基酸結(jié)果預(yù)測(cè)大蒜總氨基酸結(jié)果,驗(yàn)證數(shù)據(jù)的結(jié)果表明結(jié)果是可行的。HPLC 柱前衍生化可以得到每一種氨基酸(只要有對(duì)照品)的含量,相加后就是總氨基酸含量。對(duì)于大蒜來(lái)說,蒜氨酸是特征氨基酸需要采用HPLC 方法獲得含量,課題組已經(jīng)建立了非衍生化的測(cè)定方法,較為簡(jiǎn)便,如果再采用茚三酮顯色-Vis 法結(jié)合數(shù)學(xué)模型獲得總氨基酸含量,就可以評(píng)價(jià)大蒜氨基酸的情況。經(jīng)HPLC 法測(cè)定脯氨酸和天冬酰胺僅占總氨基酸含量的0.57%,是兩種方法誤差的原因之一,但影響不大。

    本研究從原理和大批量數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果及數(shù)學(xué)模型分析均顯示測(cè)定大蒜樣品中總氨基酸含量的茚三酮顯色-Vis 法相對(duì)HPLC 法更快速更經(jīng)濟(jì),可以結(jié)合蒜氨酸HPLC 法測(cè)定結(jié)果控制和評(píng)價(jià)大蒜樣品原料的質(zhì)量,本研究采用數(shù)字序列相關(guān)性分析評(píng)價(jià)該方法替代HPLC 柱前衍生化法測(cè)定大蒜總氨基酸的可靠性是有意義的。

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