超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥籽粒中25種磺酰脲類除草劑殘留

劉 煒， 劉 行， 楊曉鳳， 尹 全， 張義蓉， 張富麗， 劉 茜

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066; 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物育種栽培研究所，四川 成都 610300)

0 引 言

磺酰脲類除草劑是全球主流除草劑之一，具有品種較多、高活性、低毒、低劑量、廣譜、高選擇性等特點，對農(nóng)牧業(yè)的增產(chǎn)起到了十分重要的作用[1-2]?；酋ｋ孱惓輨┯煞枷慊?、磺酰脲橋和雜環(huán)三部分組成，屬于內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性除草劑，通過對植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶(ALS)的抑制，從而阻礙支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)生物合成，導(dǎo)致底物α-丁酮的積累，抑制植物細(xì)胞的分裂和生長，使細(xì)胞不能正常生長[3]。

小麥?zhǔn)侵袊饕募Z食作物之一，也是中國重要的商品糧和戰(zhàn)略儲備糧，對提升我國農(nóng)民的經(jīng)濟收入，保證農(nóng)村地區(qū)的穩(wěn)定、保障國家糧食安全方面具有重要意義[4-6]。2019年中國小麥種植面積為23 727千公頃，占我國糧食作物總面積的20%左右，小麥產(chǎn)量為13 359萬噸，占我國糧食總產(chǎn)量的20%左右[7]。在小麥種植過程中影響高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)的因素很多，麥田農(nóng)田雜草（雀麥、野燕麥、節(jié)節(jié)麥等禾本科雜草以及播娘蒿）是影響產(chǎn)量、品質(zhì)的重要因素之一，目前化學(xué)除草是保障小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)的重要措施[8]。該類除草劑廣泛應(yīng)用于小麥中害蟲綜合治理，但不合理的使用導(dǎo)致小麥中農(nóng)藥殘留，對消費者健康和環(huán)境造成長期的風(fēng)險。目前，我國磺酰脲類農(nóng)藥殘留限量還不夠完善，GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》只對部分磺酰脲類除草劑在小麥的最大殘留限量值規(guī)定，在0.01～0.1 mg/kg之間[9]，為了規(guī)避潛在健康風(fēng)險，建立一種同時檢測小麥籽粒中25種磺酰脲類除草劑的方法是必要的。

近幾年，磺酰脲類除草劑的殘留分析方法主要有色譜法[10-11]，色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]，毛細(xì)管電泳法[16]。目前已有關(guān)于小麥中磺酰脲類除草劑殘留檢測的報道，但關(guān)于同時檢測小麥籽粒中25 種磺酰脲類除草劑的方法尚未見報道，本文以 QuEChERS前處理技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了同時測定小麥籽粒中25種磺酰脲類除草劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)，旨在為小麥中農(nóng)藥殘留檢測提供高效技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥劑、試劑與儀器

25種磺酰脲類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于97%（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（質(zhì)譜純/色譜純，美國 Fisher 公司）；甲酸、甲酸銨（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，四川西隴化工有限公司）；無水硫酸鎂（德國CNW 科技公司）；石墨化炭黑(GCB)、十八烷基鍵合相硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）（上海安譜實驗科技股份有限公司）；試驗用水均為超純水。

Waters I CLASS XEVO TQ XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI離子源)（美國沃特世公司）；高速萬能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；JA3003分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；Neofuge 18R高速離心機（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團）；超純水儀（Milli-Q 型超純水儀）；0.22 μm有機系濾膜（美國安捷倫公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取25種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用時，根據(jù)實驗需要，用乙腈或小麥籽粒空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)( Matrix effect，ME) 是指樣品中目標(biāo)分析物以外的組分，對目標(biāo)分析物的分析過程有顯著的干擾，從而影響目標(biāo)分析物定量分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性的現(xiàn)象[17]。小麥籽粒基體比較復(fù)雜，含有大量的色素、淀粉等共提取物，在前處理過程中，小麥籽粒樣品中的共提取物與目標(biāo)化合物一同進入質(zhì)譜系統(tǒng)，會對目標(biāo)化合物的離子化程度產(chǎn)生一定影響，造成響應(yīng)信號的抑制或提高[18]。在農(nóng)藥殘留定量分析中，為了有效地減少干擾物，消除基質(zhì)效應(yīng)，選擇合適的樣品前處理方法、色譜分離條件、質(zhì)譜條件、使用內(nèi)標(biāo)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等有效手段，其中優(yōu)化前處理方法，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液是最常用的手段[19]。采用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值來評價基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)0.8＜ME＜1.2 時為弱基質(zhì)效應(yīng)，可以接受；當(dāng)ME＜0.8是為基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME＞1.2是為基質(zhì)增強效應(yīng)[20]。

1.4 儀器條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：1.0 μL；流量：0.3 mL/ min。流動相 A：10 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流動相B：甲醇；流動相梯度洗脫程序見表1

表1 流動相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：采用正離子掃描，電噴霧離子源(ESI)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔反吹氣為氮氣，流量：150 L/h；碰撞氣為氬氣，壓力為 230 kPa；脫溶劑氣體流量：800 L/h；脫溶劑溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)，具體質(zhì)譜參數(shù)見表2，0.01 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1。

表2 25種除草劑的質(zhì)譜檢測條件1）

圖1 MRM 模式下 25 種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

1.5 樣品前處理

稱取已粉碎的小麥籽粒樣品5.0 g(精確至0.1 g)于50 mL離心管中，加入5.0 mL 水和 20.0 mL含1%甲酸的乙腈，渦旋 5 min；加入3.0 g 氯化鈉，渦旋 2 min，8 000 r/min離心5 min；取上清液2.0 mL于含有 80 mg C18，200 mg無水 MgSO4的 10 mL離心管中，渦旋 2 min，8 000 r/min 離心 5 min， 取上清液過濾膜供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

在ESI正離子和負(fù)離子模式下，對甲醇配制的1.0 mg/L的 25種磺酰脲類除草劑單標(biāo)準(zhǔn)溶液進行進入一級質(zhì)譜后，25種除草劑在正離子模式下均可得到穩(wěn)定的、靈敏度高的母離子。對25種磺酰脲類除草劑進行二級質(zhì)譜分析，優(yōu)化子離子、錐孔電壓以及碰撞能量等質(zhì)譜條件，最終獲得25種磺酰脲類除草劑的最佳多反應(yīng)監(jiān)測模式( MRM) 的質(zhì)譜參數(shù)(見表2)。

分別比較了不同類型的色譜柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column （100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）對目標(biāo)化合物的分離效果，發(fā)現(xiàn)CSH C18色譜柱的分離效果、峰型、響應(yīng)值最佳。

采用梯度洗脫，比較了甲醇、乙腈分別與水組成的流動相系統(tǒng)對25種目標(biāo)化合物的洗脫效果，經(jīng)過比較分離效果、峰形對稱性及靈敏度，確定甲醇-水作為流動相。由于磺酰脲類除草劑有弱酸性，在流動相中加入0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨后，吡嘧磺隆與環(huán)丙嘧磺隆，啶嘧磺隆與芐嘧磺隆，甲嘧磺隆與甲磺隆之間的分離效果更好，其他除草劑的響應(yīng)值得到提高，且改善了色譜峰峰形。因此，選擇以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液-甲醇作為流動相。

2.2 前處理方法的選擇

考慮到小麥籽粒樣品中含水量低這一特點，為了改善提取和凈化效果，預(yù)先向已粉碎的小麥籽粒樣品中加入適量的水，以利于極性的磺酰脲類除草劑的提取，從而提高農(nóng)藥的回收率，比較加水量3.0 mL、5.0 mL、10.0 mL對回收率的影響，結(jié)果表明，加水量為5.0 mL最合適。

比較了甲醇、乙腈、含1%甲酸的乙腈對25種的提取效率（圖2）。結(jié)果表明，以甲醇為提取劑時，苯磺隆、醚苯磺隆、煙嘧磺隆、甲酰胺磺隆的回收率僅為45.5%、56.8%、65.3%、66.1%。以乙腈為提取溶劑時，25種磺酰脲除草劑的回收率為86.8%～100.7%；以含1%甲酸的乙腈為提取溶劑時，25種磺酰脲除草劑的回收率為88.5%～112.9%，乙腈中加入1%甲酸，可提高對堿性敏感農(nóng)藥( 如單嘧磺隆)的回收率。因此，最終選擇含1%甲酸的乙腈作為提取試劑。

圖2 25種除草劑在不同提取溶劑中的平均回收率

2.3 凈化條件的優(yōu)化

小麥籽?；|(zhì)較為復(fù)雜，含有較多的淀粉和油脂，提取目標(biāo)化合物的同時，也提取出大量的油脂色素等雜質(zhì)。GCB、PSA及C18是QuEChERS方法中常用的凈化劑，用于可以去小麥籽中色素、鑿醇、脂類、糖類等雜質(zhì)。比較了GCB、PSA及C18的凈化效果。結(jié)果表明， GCB作為凈化劑時，凈化效果較好，但對25種磺酰脲除草劑產(chǎn)生吸附，降低了回收率，回收率在18.2%～74.1%之間；PSA作為凈化劑時，凈化效果較好，回收率在75.2%～85.1%之間。不同質(zhì)量（40 mg、60 mg、80 mg、100 mg）C18作為凈化劑時，加入80 mg C18 凈化效果好， 25種磺酰脲除草劑的回收率在88.9%～105.2%之間。

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

用小麥籽?？瞻谆|(zhì)溶液配制系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)化合物的峰面積(y)與對應(yīng)的質(zhì)量濃度 (x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限( LOD) 和定量下限( LOQ)。目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)（r2）在0.996 2～0.999 4 之間，檢出限在 0.006 ～0.21 μg/kg 之間，定量限在0.019 ～0.71 μg/kg之間，能夠滿足小麥籽粒中磺酰脲除草劑定量分析的基本要求。ME在0.83～1.13之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以忽略，具體結(jié)果見表3。

表3 25種除草劑的線性關(guān)系、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選取小麥籽?？瞻讟悠?，依據(jù)小麥籽中25種磺酰脲除草劑的 MRL 值以及方法的靈敏度添加3個濃度進行添加回收試驗，每個添加水平重復(fù)7次，按上述所述前處理方法及條件進行測定，計算25種磺酰脲類除草劑的平均添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。25種磺酰脲類除草劑的平均添加回收率均在85.9%～107.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）0.9%～6.8 % 之間，該分析方法準(zhǔn)確性和精密度滿足小麥籽粒中25種磺酰脲類除草劑殘留分析的要求，具體結(jié)果見表4。

表4 25種磺酰脲類除草劑在小麥籽粒中的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n =7)

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對市場采購的20份小麥籽粒樣品進行檢測。結(jié)果表明：2種除草劑分別有樣品檢出。其中：芐嘧磺隆2份，含量為0.042 4 mg/kg和0.035 6 mg/kg，超出GB 2763—2019規(guī)定的最大殘留限量值0.02 mg/kg；胺苯磺隆1份，含量為0.023 5 mg/kg，GB 2763—2019未規(guī)定限量值。其他樣品均無除草劑檢出，此方法適用小麥籽粒中磺酰脲類除草劑多殘留的篩查。

3 結(jié)束語

本文以 QuEChERS 前處理技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了同時測定小麥籽粒中25種磺酰脲類除草劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)。在1～100 μg/kg添加水平下，平均回收率在 85.9%～107.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為0.9%～6.8%之間，檢出限在 0.006～0.21 μg/kg之間，定量限在0.019 ～0.71 μg/kg 之間，該方法前處理簡單，分析時間短，準(zhǔn)確度和靈敏度高，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，適合小麥籽粒樣品中磺酰脲類除草劑的實際檢測需要。