亮氨酸對豬乳腺上皮細胞營養(yǎng)轉運的影響及調控機制

朱鵬巍 吳采池 崔 暢 鄭小雨 馬梓瑋 王 俊 張世海 管武太 陳 芳

(華南農業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州510642)

乳腺是仔豬在哺乳期從母體獲得營養(yǎng)的最重要的器官，乳腺的泌乳能力對仔豬在哺乳期間的生長情況，斷奶時的成活率、個體重以及斷奶后的生長發(fā)育情況都有至關重要的影響[1]。在家畜物種(如母豬和奶牛)中，產奶量是后代斷奶前生長和存活最大的限制因素[2-4]。所有哺乳動物的乳汁都是乳腺上皮細胞的分泌產物[5]，在母豬中，乳腺上皮細胞的數(shù)量一般在分娩時翻倍，通常乳腺上皮細胞的數(shù)量和產奶量呈正相關[6]。人們普遍認為，母豬產奶量很大程度上取決于乳腺上皮細胞的數(shù)量和它們的分泌能力[4]。在泌乳過程中，乳腺上皮細胞從血液循環(huán)中吸收營養(yǎng)并合成乳成分[7]。血液循環(huán)中的氨基酸、葡萄糖以及乳脂合成的前體，離開血液進入細胞外液，被乳腺上皮細胞通過其基底外膜上特定的氨基酸轉運載體、葡萄糖轉運載體以及脂肪酸轉運載體吸收進入細胞；然后，氨基酸通過多肽鍵共價結合在一起，在內質網(wǎng)的核糖體中形成蛋白質后轉移到高爾基體，在那里它們被加工運輸出細胞[2]；血液中的葡萄糖進入乳腺上皮細胞后，一些葡萄糖轉化為半乳糖，隨后葡萄糖和半乳糖通過過一系列酶催化反應進入高爾基體形成乳糖，并通過滲透梯度運輸至乳腺上皮細胞的頂膜，與乳蛋白一起從分泌小泡釋放到肺泡腔中[8]；而乳脂的合成前體進入細胞后到達細胞內光滑內質網(wǎng)，參與甘油三酯的合成途徑，形成小脂滴并融合產生更大的脂滴，向乳腺上皮細胞頂膜移動并釋放[2]。乳腺上皮細胞新合成的乳汁以及包括免疫球蛋白在內的部分母體血液成分，被分泌和運輸?shù)饺橄俜闻萸缓蛯Ч芟到y(tǒng)，然后在催產素激增后釋放給仔豬。由此可見，乳腺上皮細胞的轉運合成能力直接影響了母豬的泌乳性能和哺乳仔豬的生長情況。

與哺乳母豬有關的大量研究表明，氨基酸不僅是蛋白質的構建底物，而且是代謝途徑的關鍵調控信號，對乳的生成至關重要[4]。已有研究證明，亮氨酸可以通過刺激與蛋白質合成相關的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路，促進骨骼肌的合成[9]。而且亮氨酸可以促進乳腺組織中蛋白質的合成[10]。在奶牛的研究中發(fā)現(xiàn)，牛乳腺上皮細胞用亮氨酸處理后，可以顯著促進細胞乳蛋白的合成[11]。而用氨基酸缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞，再加入亮氨酸后可以顯著促進κ-酪蛋白的合成速率[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，用亮氨酸處理乳腺上皮細胞后，αs2-酪蛋白(CSN1S2)和κ-酪蛋白(CSN3)基因表達量顯著提升，并且可以促進脂滴的形成[13]。用0.75 mmol/L的亮氨酸處理牛乳腺上皮細胞，可以顯著地促進乳脂和乳蛋白的合成，并促進了mTOR信號通路磷酸化[14]。還有研究報道，亮氨酸可以通過mTOR信號通路，促進乳腺上皮細胞的生長增殖和乳蛋白的合成，還可以促進乳腺上皮細胞中氨基酸轉運載體和脂肪酸運載體的表達[15]。

因此，本研究旨在利用細胞模型進一步探究亮對豬乳腺上皮細胞增殖、氨基酸轉運載體、葡萄糖轉運載體、脂肪酸轉運載體以及mTOR信號通路的影響，以期對妊娠母豬飼糧中亮氨酸的使用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用細胞來自本實驗室前期分離培養(yǎng)的母豬乳腺上皮細胞系；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗購自美國Gibco公司；牛血清白蛋白(BSA)、氫化可的松、ITS、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、表皮生長因子(EGF)、噻唑藍(MTT)、油紅O干粉、焦磷酸二乙酯(DEPC)購自美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國MP Biomedicals公司；RNA反轉錄試劑盒、DNase Ⅰ(RNase Free，1 000 Units)、DNA Marker(DL 2000)和SYBR Green RT-PCR Master Mix購自日本TaKaKa公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司；瓊脂糖購自Agarose I-H公司；Western Blot相關試驗材料購自上海碧云天公司；一抗mTOR、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)及其磷酸化蛋白、內參基因β-肌動蛋白(β-actin)購自美國CST公司；二抗購自Zenbio公司。

1.2 引物的設計與合成

根據(jù)NCBI中GenBank公布的基因序列檢索出相關基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設計目的基因乳蛋白合成基因[αs1-酪蛋白(CSN1S1)、CSN1S2、CSN3]、氨基酸轉運載體[溶質載體家族1成員1(SLC1A1)、溶質載體家族1成員4(SLC1A4)、溶質載體家族1成員5(SLC1A5)、溶質載體家族7成員5(LAT1)、溶質載體家族7成員1(SLC7A1)、溶質載體家族7成員2(SLC7A2)、溶質載體家族7成員6(SLC7A6)、溶質載體家族7成員7(SLC7A7)、溶質載體家族7成員8(SLC7A8)、溶質載體家族7成員11(SLC7A11)、溶質載體家族38成員1(SNAT1)、溶質載體家族38成員2(SNAT2)、溶質載體家族38成員4(SNAT4)、溶質載體家族3成員2(4F2hc)、溶質載體家族3成員1(rBAT)]、葡萄糖轉運載體[葡萄糖轉運體1(GLUT1)、葡萄糖轉運體8(GLUT8)]及脂肪酸轉運載體[脂肪酸移位酶(CD36)、脂肪酸轉運蛋白(FATP)1、FATP2、FATP3、FATP4、脂肪酸結合蛋白(FABP)3、FABP4、FABP5、FABP6、FABP7、?；o酶A結合蛋白(ACBP)]的上、下游引物，再使用BLAST分析引物特異性，找出最佳引物序列，由上海生工生物技術有限公司進行合成，引物序列見表1。

表1 相關目的基因及內參基因β-肌動蛋白的引物參數(shù)

續(xù)表1基因名稱Gene namesGenBank登錄號GenBank accession number引物序列 Primer sequence (5'—3')產物大小Product size/bp脂肪酸轉運蛋白1FATP1NM_001083931.1F:GGCAACAGACGTGATCTATGACR:AGCGGCTGGCTGAAAACT125脂肪酸轉運蛋白2FATP2JX092264.1F:TCTAACACGGATGGGGTCGR:AGGGCAGGAGTGGAAAAGT107脂肪酸轉運蛋白3FATP3XM_001929591.2F:AGGTCTCAGCCGAAGTGGATR:TGGGAGGGCGAGGTAGAT206脂肪酸轉運蛋白4FATP4XM_003353676.1F:AGCCGCATCCTGTCCTTTR:GACATCCTTGGCGATCTTTT213脂肪酸結合蛋白3FABP3AY569332.1F:CTGGGAGTGGAGTTTGATGAGACR:CCATGGGTGAGTGTCAGGAT164脂肪酸結合蛋白4FABP4NM_001002817.1F:TGAAAGGTGTCACGGCTACR:TCGGGACAATACATCCAACAGAG102脂肪酸結合蛋白5FABP5AY841270.1F:CTGGGACAGAAGTTTGAAGAGACR:GACCCGAGTGCAGGTGACATT186脂肪酸結合蛋白6FABP6NM_214215.2F:GGAGGTCTCCACTGTCGGR:CTGTTACACCAGGTTTATTTG115脂肪酸結合蛋白7FABP7NM_001025229.1F:GACTCAAAGCACATTCAAGAACR:GCAACCACATCACCAAAAGTAA216?；o酶A結合蛋白ACBPNM_214119.1F:CCACTACAAACAAGCGACCGTR:TACGCTTTCATGGCATCTTCC132αs1-酪蛋白CSN1S1NM_001004029F:ACAAATGAGGACAAGCATACCCR:GAGGGATGTTGGTGAATAATGG175αs2-酪蛋白CSN1S2NM_001004030F:GAAGTGGGATATGCCAGCAGR:CCTGGAGATATTGGGGGAAC148κ-酪蛋白CSN3NM_001004026F:GCCTATCCTGGCATTAACACTGR:TGGGTAGACATTTGGCTGGTC286

1.3 豬乳腺上皮細胞的培養(yǎng)

從液氮中取出本實驗室前期分離培養(yǎng)的母豬乳腺上皮細胞系，復蘇后使用細胞完全培養(yǎng)基DMEM/F12(含10% FBS和1%雙抗，使用正常亮氨酸濃度的完全培養(yǎng)基，而非亮氨酸缺乏培養(yǎng)基L-亮氨酸濃度為59.05 mg/L)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳至3～4代后用于后續(xù)試驗。

1.4 細胞活力檢測

采用MTT法檢測不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞活力的影響。將豬乳腺上皮細胞接種到96孔板，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別更換含不同濃度亮氨酸[0(作為對照組)、1、5、10 mmol/L]的培養(yǎng)基(含5 g/L BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基)，每組設10個重復(此處增設1組不含細胞只含培養(yǎng)基的空白組)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各培養(yǎng)孔中加入事先準備好的5 mg/mL MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，用全自動酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度(A)。細胞活力計算公式如下：

細胞活力=(A試驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)。

1.5 脂滴含量測定

采用油紅O染色法檢測不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞脂滴合成的影響。將豬乳腺上皮細胞接種到24孔板并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別更換含不同濃度亮氨酸[0(作為對照組)、1、5、10 mmol/L]的培養(yǎng)基，每組設5個重復，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去孔內培養(yǎng)液，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗2～3次，加入250 μL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min；吸出固定液，用PBS清洗2～3次，加入油紅O染液500 μL，靜置2 h后吸出染液，PBS清洗3～5次，加適量水或甘油進行封孔，最后于倒置顯微鏡(400×)下拍照。

1.6 目的基因mRNA表達情況測定

將豬乳腺上皮細胞接種到6孔板并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別更換含不同濃度亮氨酸[0(作為對照組)、1、5、10 mmol/L]的培養(yǎng)基，每組設6個重復，培養(yǎng)24 h后，使用Trizol法提取總RNA，RNA反轉錄根據(jù)RNA反轉錄試劑盒說明書進行，然后依據(jù)SYBR Green RT-PCR Master Mix說明進行實時熒光定量PCR，對乳蛋白合成基因、氨基酸轉運載體、葡萄糖轉運載體、脂肪酸轉運載體的mRNA表達情況進行檢測，使用2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.7 目的蛋白磷酸化水平測定

采用Western Blot法檢測mTOR、S6K1、β-actin的表達及磷酸化情況，并使用Image J軟件分析。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和Duncan氏法多重比較，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞活力的影響

如圖1所示，不同濃度亮氨酸處理24 h后，1 mmol/L組和5 mmol/L組的細胞活力與對照組相比顯著降低(P<0.05)；不同濃度亮氨酸處理48 h后，各濃度亮氨酸組細胞活力均較對照組顯著提高(P<0.05)，且以亮氨酸濃度為1 mmol/L時細胞活力最高。

數(shù)據(jù)柱標注相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中乳蛋白合成基因mRNA相對表達量的影響

如圖2所示，與對照組相比，1 mmol/L組的CSN1S2和CSN3 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，5 mmol/L組的CSN1S2 mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)。

圖2 不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中

2.3 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中脂滴合成的影響

圖3展示的是用不同濃度亮氨酸處理48 h的豬乳腺上皮細胞內用油紅O染色的脂滴形成情況，從圖中可以看出，隨著亮氨酸濃度的增加，脂滴含量逐漸增多，脂滴大小逐漸增大，且在亮氨酸濃度為5 mmol/L時脂滴的合成達到峰值。

2.4 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中氨基酸轉運載體mRNA相對表達量的影響

圖4、圖5、圖6為不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中氨基酸轉運載體mRNA相對表達量的影響。與對照組相比，1 mmol/L組的SLC1A4、SLC1A5、SNAT1、SLC7A11、LAT1、SLC7A2、SLC7A7 mRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)；5 mmol/L組的SLC1A4、SNAT1、SLC7A11、LAT1、SLC7A2、SLC7A7、4F2hc、rBATmRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)，但SLC1A1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)；10 mmol/L組的SLC1A4、SLC1A5、SLC7A11、LAT1、SLC7A7、4F2hc和rBATmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，但SLC1A1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)?？偟膩砜矗涟彼峥梢燥@著增加豬乳腺上皮細胞中性氨基酸轉運載體和堿性氨基酸轉運載體mRNA的表達。

SLC1A4：溶質載體家族1成員4 solute carrier family 1 member 4；SLC1A5：溶質載體家族1成員5 solute carrier family 1 member 5；SLC7A8：溶質載體家族7成員8 solute carrier family 7 member 8；SNAT1:溶質載體家族38成員1 solute carrier family 38 member 1；SNAT2:溶質載體家族38成員2 solute carrier family 38 member 2;SNAT4:溶質載體家族38成員4 solute carrier family 38 member 4。

SLC1A1:溶質載體家族1成員1 solute carrier family 1 member 1；SLC7A11:溶質載體家族7成員11 solute carrier family 7 member 11；LAT1:溶質載體家族7成員5 solute carrier family 7 member 5。

SLC7A1:溶質載體家族7成員1 solute carrier family 7 member 1；SLC7A2:溶質載體家族7成員2 solute carrier family 7 member 2；SLC7A6:溶質載體家族7成員6 solute carrier family 7 member 6；SLC7A7:溶質載體家族7成員7 solute carrier family 7 member 7；4F2hc：溶質載體家族3成員2 solute carrier family 3 member 2；rBAT： 溶質載體家族3成員1 solute carrier family 3 member 1。

2.5 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中葡萄糖轉運載體mRNA相對表達量的影響

圖7為不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中葡萄糖轉運載體mRNA相對表達量的影響。與對照組相比，5和10 mmol/L亮氨酸處理顯著降低了GLUT8 mRNA相對表達量(P<0.05)，但各濃度亮氨酸處理對GLUT1 mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)。

圖7 不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中葡萄糖

2.6 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體mRNA相對表達量的影響

圖8、圖9為不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體mRNA相對表達量的影響。與對照組相比，1 mmol/L亮氨酸處理顯著增加了FATP1、FATP2、FABP3、FABP5、FABP7和ACBPmRNA相對表達量(P<0.05)，但顯著降低了FABP6 mRNA相對表達量(P<0.05)；5 mmol/L亮氨酸處理顯著增加了CD36、FATP1、FATP2和FABP7 mRNA相對表達量(P<0.05)，但顯著降低了FABP3、FABP5、FABP6和ACBPmRNA相對表達量(P<0.05)；10 mmol/L亮氨酸處理顯著增加了CD36和FATP1 mRNA相對表達量(P<0.05)，但顯著降低了FABP3、FABP4、FABP5、FABP6和ACBPmRNA相對表達量(P<0.05)。綜上可知，一定濃度的亮氨酸可以促進豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體mRNA的表達，但是高濃度的亮氨酸則會抑制其表達。

CD36:脂肪酸移位酶 fatty acid translocase;FATP1:脂肪酸轉運蛋白1 fatty acid transport protein 1;FATP2:脂肪酸轉運蛋白2 fatty acid transport protein 2;FATP3:脂肪酸轉運蛋白3 fatty acid transport protein 3;FATP4:脂肪酸轉運蛋白4 fatty acid transport protein 4。

FABP3:脂肪酸結合蛋白 3 fatty acid binding protein 3；FABP4:脂肪酸結合蛋白 4 fatty acid binding protein 4；FABP5:脂肪酸結合蛋白5 fatty acid binding protein 5；FABP6:脂肪酸結合蛋白 6 fatty acid binding protein 6；FABP7:脂肪酸結合蛋白 7 fatty acid binding protein 7；ACBP:?；o酶A結合蛋白acyl-CoA-binding protein。

2.7 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中mTOR信號通路關鍵蛋白表達的影響

圖10為不同濃度亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中mTOR信號通路關鍵蛋白表達的影響。與對照組相比，1 mmol/L亮氨酸處理顯著增加了mTOR信號通路中S6K1的磷酸化水平(P<0.05)，其他濃度亮氨酸處理對S6K1的磷酸化水平無顯著影響(P>0.05)；不同濃度亮氨酸處理對mTOR信號通路中mTOR的磷酸化水平均無顯著影響(P>0.05)。

mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin ；P-mTOR：磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白phosphorylated mammalian target of rapamycin ；S6K1：核糖體蛋白S6激酶1 ribosomal protein S6 kinase 1；P-S6K1：磷酸化核糖體蛋白S6激酶1 phosphorylated ribosomal protein S6 kinase 1；β-actin:β-肌動蛋白。

3 討 論

3.1 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞增殖的影響

在乳腺中，乳蛋白的合成效率與乳腺上皮細胞的數(shù)量關系密切[16]，而亮氨酸對乳腺細胞的生長發(fā)育有十分重要的作用。有關亮氨酸對泌乳性能影響的研究主要集中在奶牛上，對豬泌乳性能的相關報道較少，大量的研究指出，培養(yǎng)基中加入亮氨酸可以顯著促進牛乳腺上皮細胞的增殖[12,17-18]。而在本試驗中，用不同濃度的亮氨酸處理豬乳腺上皮細胞48 h后，各濃度亮氨酸組細胞活力均顯著提高，亮氨酸濃度為1 mmol/L時細胞活力最高，這與前人的研究相符。有報道指出，牛乳腺上皮細胞的增殖可以由mTOR信號通路調控，因此推測亮氨酸可能通過mTOR信號通路促進豬乳腺上皮細胞增殖。

3.2 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中乳蛋白合成基因表達的影響

有研究報道，適量的氨基酸處理可以促進牛乳腺上皮細胞中酪蛋白基因的表達[19]；氨基酸處理可以上調牛乳腺上皮細胞中CSN3基因的表達，還可以上調mTOR及下游S6K1、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平[20]。還有報道稱，亮氨酸處理可以顯著升高牛乳腺上皮細胞中CSN1S1和CSN1S2基因的表達[13]。而在本試驗中，1 mmol/L亮氨酸處理可顯著提高豬乳腺上皮細胞中CSN1S2和CSN3基因的表達，5 mmol/L亮氨酸處理可顯著提高CSN1S2基因的表達，說明亮氨酸可以促進豬乳腺上皮細胞中CSN1S2和CSN3基因的表達，與前人在奶牛乳腺上皮細胞中的研究結果相似。

3.3 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中氨基酸轉運載體基因表達的影響

血漿的游離氨基酸庫為乳合成提供了90%的氨基酸，而乳腺上皮細胞吸收這些氨基酸，除了用于自身常規(guī)的氧化分解外，最主要的作用是作為合成乳的原料。氨基酸是重要的母體營養(yǎng)素，是乳蛋白的基石，是新生兒潛在的能量來源[21]。而有些氨基酸，除了作為乳合成的底物，還能促進乳腺上皮細胞氨基酸轉運載體的表達，進一步促進乳的合成。氨基酸作為大分子蛋白質的組成單位，在細胞膜之間不能自由擴散，需要通過細胞膜上氨基酸轉運載體的協(xié)助。氨基酸轉運載體是一種跨膜蛋白，在細胞和全身水平上通過調節(jié)能量代謝、蛋白質合成、基因表達、氧化還原平衡、信號轉導途徑和生長發(fā)揮重要作用[22]。氨基酸轉運載體可以感知表內氨基酸水平的變化，介導氨基酸信號傳導途徑的激活。本研究從氨基酸轉運載體的營養(yǎng)轉運功能討論亮氨酸處理對豬乳腺上皮細胞的營養(yǎng)傳輸?shù)挠绊?。對氨基酸轉運系統(tǒng)分類的方法有許多種，其中按照其底物的化學性質可分為中性氨基酸轉運載體、堿性氨基酸轉運載體和酸性氨基酸轉運載體[22]。本研究選擇了中性氨基酸轉運載體、堿性氨基酸轉運載體和酸性氨基酸轉運載體中幾個主要的基因進行探討。有研究報道，在體外培養(yǎng)的荷斯坦奶牛的乳腺腺泡組織中補充必需氨基酸，可以促進氨基酸轉運載體LAT1和4F2hc基因的表達[23]。而在本試驗中，各濃度亮氨酸處理均顯著增加了LAT1基因的表達，5、10 mmol/L的亮氨酸處理顯著增加了4F2hc基因的表達。還有研究報道稱，用氨基酸處理體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞可以促進其氨基酸轉運載體SLC6A14基因的表達[24]。而體外培養(yǎng)的小鼠乳腺細胞，在添加氨基酸處理后，其SNAT2的表達量顯著提高[25]。從前人的研究可以看出氨基酸對氨基酸轉運載體的表達有一定的促進作用。而在本試驗中，不同濃度的亮氨酸處理豬乳腺上皮細胞均可促進不同氨基酸轉運載體的表達，其中以5 mmol/L的亮氨酸處理效果最佳，但高濃度的亮氨酸處理會抑制SLC1A1的表達，推測高濃度的亮氨酸會導致細胞氨基酸失衡，從而影響細胞正常的蛋白質合成。

3.4 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中葡萄糖轉運載體基因表達的影響

葡萄糖是哺乳動物體內最重要的供能物質，還作為眾多代謝的底物參與其代謝過程。在奶牛泌乳的研究中揭示了乳蛋白的合成可能受蛋白質和能量供應等因素的控制[26]。GLUT1是目前體內分布最廣泛的葡萄糖轉運載體，對葡萄糖分子有很高的親和力，也是乳腺上皮細胞中主要表達的葡萄糖轉運載體，GLUT8在牛的乳腺中也有少量表達[27]。本試驗在豬乳腺上皮細胞中發(fā)現(xiàn)GLUT8也有少量表達。有研究證明了異亮氨酸可以促進腸道和肌肉中葡萄糖轉運載體的表達[28]。還有研究提出亮氨酸可能促進mTOR信號通路中的S6K1磷酸化，進而促進GLUT1的表達[29]。但是本研究結果顯示，用不同濃度亮氨酸處理對豬乳腺上皮細胞中GLUT1的表達無顯著影響，其原因有待進一步研究。

3.5 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體基因表達的影響

乳腺中乳脂的合成包括血液循環(huán)吸收、活化、細胞內轉運以及乳腺上皮細胞內從頭合成[30]。長鏈脂肪酸是乳腺上皮細胞主要的能量來源之一[31]。長鏈脂肪酸由CD36轉移傳遞給脂肪酸轉運蛋白(FATP)[32]，F(xiàn)ATP將長鏈脂肪酸進行跨膜轉運后，由ACBP將之帶到細胞內的代謝場所[33]。有報道稱乳脂合成似乎受到SREBP1、PPAR和LXR相互作用網(wǎng)絡的調控[34]。還有研究報道稱，必需氨基酸可以通過mTOR-SREBP1通路調控脂肪酸和甘油三酯的合成[35]。而本試驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度亮氨酸處理促進了豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體基因的表達，由此推測，亮氨酸可能通過mTOR-SREBP1通路調控脂肪酸轉運載體基因的表達，進而調控脂肪酸和甘油三酯的合成。本試驗結果顯示一定濃度(5 mmol/L)的亮氨酸可以促進豬乳腺上皮細胞中脂肪酸轉運載體的表達，但亮氨酸濃度過高則會抑制其表達，可以用來解釋前人的研究結果。

3.6 亮氨酸對豬乳腺上皮細胞中mTOR信號通路關鍵蛋白表達的影響

氨基酸不僅作為蛋白質合成的底物，還作為某些特殊的信號分子激活細胞內的信號通路，調控蛋白質的合成[36]。亮氨酸通過Sestrin2激活哺乳動物骨骼肌、脂肪組織和胎盤細胞中mTOR的靶蛋白來增加蛋白質的合成[37]。而在哺乳動物的乳腺研究中，有報道稱，用不含亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)其mTOR信號通路及其中下游蛋白S6K1和4E-BP1的磷酸化受到影響，從而影響乳蛋白的合成速率[15]。在對乳腺組織切片的研究中發(fā)現(xiàn)，加入亮氨酸可以促使mTOR磷酸化，從而促進乳蛋白的合成[10]。還有研究報道稱，氨基酸對mTOR信號通路正向或負向的信號傳導與胰島素調節(jié)相結合，這種作用方式調控了乳腺上皮細胞中蛋白質的合成速率[13]。還有研究報道稱，在母豬妊娠晚期補充纈氨酸可以顯著提高豬乳腺上皮細胞中蛋白質的合成和細胞的增殖，原因可能是纈氨酸促進了mTOR磷酸化及其中下游的關鍵蛋白S6K1和4E-BP1磷酸化導致的[38]。有研究顯示，亮氨酸處理牛乳腺上皮細胞后mTOR、S6K1、4E-BP1的mRNA相對表達量均有升高趨勢，但是沒有達到顯著水平[12]。而在本試驗中，1 mmol/L亮氨酸處理顯著提高了豬乳腺上皮細胞中S6K1的磷酸化水平，但不同濃度亮氨酸處理對mTOR的磷酸化水平無顯著影響，因此本試驗得出亮氨酸對mTOR信號通路下游關鍵蛋白的磷酸化有促進作用。

4 結 論

① 在培養(yǎng)基中添加一定濃度的亮氨酸可以顯著提高豬乳腺上皮細胞的活力，以1 mmol/L亮氨酸的效果最佳。

② 在培養(yǎng)基中添加一定濃度的亮氨酸可以提高豬乳腺上皮細胞中乳蛋白合成以及氨基酸轉運載體和脂肪酸轉運載體基因的表達，以5 mmol/L亮氨酸的效果最佳。