紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊生長性能、瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

吳 璞 曹旭亮 王虎成* 馮 強 沈禹穎

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州730000；2.定西市安定區(qū)畜牧獸醫(yī)局，定西743000)

隨著畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級核心向“提質(zhì)、增效、綠色”方向的轉(zhuǎn)變，以及消費者對綠色安全畜產(chǎn)品消費偏好的增強，使得牧草需求量持續(xù)增加，帶動了草食畜牧業(yè)的快速發(fā)展[1]。但在草食畜牧養(yǎng)殖過程中，忽略對家畜的科學(xué)管理及草地的高效利用，會使生態(tài)系統(tǒng)中植物生產(chǎn)層與動物生產(chǎn)層無法系統(tǒng)耦合，從而增加養(yǎng)殖成本。因此，制定合理的飼養(yǎng)管理模式，對推動我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。紅豆草(OnobrychisviciifoliaScop.)具有適應(yīng)性強、營養(yǎng)價值豐富、產(chǎn)草量高、適口性好等特性[2]，能夠大幅提高草地的生產(chǎn)力，已在我國隴中地區(qū)得到了廣泛的推廣種植[3]。湖羊和小尾寒羊均是我國著名的地方綿羊品種，由于其具有早熟、生長發(fā)育快、繁殖性能高、適應(yīng)性強等特性而深受養(yǎng)殖戶喜愛[4]。而隨著草食畜牧業(yè)的快速發(fā)展，如何將優(yōu)勢牧草種植產(chǎn)業(yè)與家畜養(yǎng)殖科學(xué)結(jié)合，目前還缺乏系統(tǒng)的研究。因此，研究隴中地區(qū)不同品種綿羊?qū)t豆草草地的響應(yīng)機制顯得尤為重要。對于繁殖母羊而言，其在空懷期的體質(zhì)健康程度對提高自身繁殖效率和養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要意義。有研究表明，通過放牧調(diào)控可以在一定程度上提高家畜機體的健康水平[5]。而反芻動物的瘤胃內(nèi)聚集著大量的微生物群體，對維持動物的營養(yǎng)需要、生理健康和免疫防御等功能起著重要作用，是宿主適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵[6-7]。影響反芻動物瘤胃微生物區(qū)系的因素很多，其中品種對其多樣性及功能的影響已被廣泛報道[8-9]。因此，本試驗以空懷期湖羊和小尾寒羊為研究對象，在紅豆草茬地進(jìn)行劃區(qū)輪牧，測定其生長性能、瘤胃發(fā)酵模式及微生物區(qū)系的變化，旨在揭示空懷期放牧湖羊和小尾寒羊?qū)t豆草茬地的響應(yīng)機制，為人們通過選擇合適的養(yǎng)殖品種以適應(yīng)飼養(yǎng)管理模式的變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019年8—10月在甘肅省定西市鴻壯農(nóng)牧有限公司紅豆草放牧樣地(北緯35°35′、東經(jīng)103°52′，海拔2 390 m)進(jìn)行。該地區(qū)位于黃土高原丘陵溝壑區(qū)，年均降雨量350～600 mm，主要集中在7、8、9月份。年平均氣溫7.2 ℃，最熱的7月份平均氣溫為19.3 ℃，最冷的1月份平均氣溫為-6.9 ℃。

紅豆草草地建植于2016年，采用條播方式，行距30 cm，播種深度3～4 cm，其中紅豆草占比84%，無芒雀麥(BromusinermisLeyss.)、苜蓿(MedicagosativaL.)、黑麥草(LoliumperenneL.)、針茅(StipacapillataL.)、白蒿(Herbaartimisiaesieversianae)、青蒿(ArtemisiacarvifoliaBuch.)、苦苣菜(SonchusoleraceusL.)及植物枯落物等占比16%。草地總面積0.87 hm2，根據(jù)牧草生產(chǎn)力和再生能力將其劃分為4個小區(qū)，每個小區(qū)面積分別為0.27、0.09、0.26和0.25 hm2。一茬草于7月刈割用于調(diào)制干草，再生草高約20 cm，地上生物量達(dá)到420.58 g/m2時開始放牧。

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

選擇年齡一致、體況良好的空懷期湖羊[平均體重(31.95±1.60) kg]和小尾寒羊[平均體重(27.38±2.84) kg]各24只，進(jìn)行混群放牧。依據(jù)當(dāng)?shù)啬撩穹拍亮?xí)慣進(jìn)行放牧，夜間歸牧，試驗羊可在圈舍內(nèi)自由飲水及舔舐營養(yǎng)舔磚。根據(jù)綿羊?qū)嶋H采食情況及牧草再生能力在每個小區(qū)放牧一定天數(shù)后轉(zhuǎn)移羊群至下一個小區(qū)開始放牧，遇高溫及降雨天氣則在圈舍食槽內(nèi)進(jìn)行一茬紅豆草干草補飼。

在試驗開始第1天和第45天出牧前進(jìn)行稱重，記錄其體重并計算平均日增重(ADG)和體重增長率。此外，于第45天稱重后，每組各挑選4只體重相近的試驗羊立即采集瘤胃液。瘤胃液采集使用口腔胃管式負(fù)壓采集器(A1164K，科立博牧業(yè)科技有限公司)，每只羊約采集100 mL左右瘤胃內(nèi)容物，立即測定pH后用4層紗布過濾，然后將收集的濾液一份立即放入-20 ℃冰箱中保存，用于氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的測定；另一份立即放入-80 ℃冰箱，用于瘤胃微生物DNA的提取。

1.3 瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)測定

瘤胃液pH采用筆式SX620型pH計測定，氨態(tài)氮含量采用Rhine等[10]的方法測定。VFA含量采用安捷倫氣相色譜儀Agilent 6890A GC System(Hewlett Packard公司，美國)進(jìn)行檢測，配置氫氣火焰離子化檢測器(FID)，色譜柱為30 mm×0.32 mm×0.33 μm(DB-FFAP，Agilent Technologies公司，美國)，汽化室溫度為200 ℃，檢測器溫度為250 ℃，載氣為高純氮氣(20 mL/min)，分流比為50∶1，進(jìn)樣器為1.0 μL。

1.4 DNA提取及高通量測序

取250 mg瘤胃液樣品，使用DNeasy PowerSoil Kit提取樣品的總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。提取樣品總DNA后，根據(jù)16S全長引物27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：5 μL KOD FX Neo Buffer，2 μL dNTP(2 mmol/L)，0.3 μL引物(10 μmol/L)，50 ng的模板DNA和0.2 μL的KOD聚合酶。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)25次，最后72 ℃延伸7 min，通過0.8X Magnetic DNA Beads對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的DNA片段用1.8%的瓊脂糖凝膠切膠回收，通過IIIumina HiSeq 2500測序平臺(北京百邁客生物科技有限公司)對DNA片段進(jìn)行高通量測序，獲得原始數(shù)據(jù)后再進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.5 微生物多樣性生物信息學(xué)分析

測序結(jié)束后，經(jīng)過Flash 1.2.11和Trimmomatic 0.33軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過濾，通過UCHIME 8.1去除嵌合體，得到高質(zhì)量序列，使用USEARCH 10.0將在相似性為97%水平上序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，然后挑選出相對豐度最高的序列作為每個OTU的代表性序列。利用RDP Classifier 2.2構(gòu)建OTU分類信息表。計算每個試驗樣本的α多樣性和β多樣性。α多樣性由反映群落豐富度的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)及反映群落多樣性的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)進(jìn)行評估。β多樣性選擇利用加權(quán)Unifrac距離計算。利用線性判別分析效應(yīng)量(LDA effect size，LEfSe)差異分析來計算不同組間的物種差異。使用PICRUSt軟件通過比對16S RNA測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，預(yù)測其功能基因組成，從而分析不同分組之間的功能差異。通過R語言vegan程序包中的CCA模型分析試驗樣本與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

生長性能、瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)和組間各微生物相對豐度差異均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，試驗數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊生長性能的影響

由表1可知，湖羊組始重和末重顯著高于小尾寒羊組(P<0.05)，但體重增長率和平均日增重顯著低于小尾寒羊組(P<0.05)。

表1 湖羊和小尾寒羊生長性能

2.2 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)的影響

由表2可知，湖羊組和小尾寒羊組之間瘤胃pH和氨態(tài)氮、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸含量以及乙酸/丙酸均無顯著差異(P>0.05)。小尾寒羊組瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量顯著高于湖羊組(P<0.05)。

表2 湖羊和小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)

2.3 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物多樣性的影響

2.3.1 α多樣性分析

為了研究在紅豆草茬地放牧條件下湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落的豐富度和多樣性，對二者試驗樣本的α多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。由表2可知，小尾寒羊組瘤胃微生物的Shannon指數(shù)顯著高于湖羊組(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著低于湖羊組(P<0.05)。

表3 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物豐富度和多樣性指數(shù)

2.3.2 β多樣性分析

為了探究紅豆草茬地放牧條件下湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落組成的差異性，基于樣本的OTU信息，計算樣本之間的Weighted Unifrac，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)和相似性分析(Anosim)，結(jié)果如圖1所示。湖羊組和小尾寒羊組分別聚類在不同區(qū)域，說明2個品種之間瘤胃微生物群落組成存在明顯差異。Anosim結(jié)果也表明2個品種之間瘤胃微生物組成存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物主坐標(biāo)分析(A)和相似性分析(B)

2.4 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物組成的影響

2.4.1 LEfSe差異分析

在不同分類水平上對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物進(jìn)行LEfSe差異分析。LEfSe進(jìn)化分枝圖(圖2-A)顯示了瘤胃微生物OTU在系統(tǒng)發(fā)生方面的關(guān)系，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別，且不同顏色表示各組的優(yōu)勢物種。線性判別分析(LDA)值分布柱狀圖(圖2-B)顯示了各物種的LDA值(僅顯示了LDA值大于2的物種)，用來評估組間具有顯著差異的物種的影響力。其中，小尾寒羊組共有24個具有顯著性差異的物種類群，主要為擬桿菌綱(Bacteroidia)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌目(Bacteroidales)、食物谷菌科(Victivallaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌綱(Clostridia)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)等。湖羊組差異顯著的物種類群達(dá)到了5種，主要為變形菌綱(Gammaproteobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和琥珀酸單胞菌屬(Succinimonas)。

Bacteroidia：擬桿菌綱；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門； Bacteroidales：擬桿菌目；Clostridiales：梭菌目；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Clostridia：梭菌綱；Campylobacter：彎曲桿菌科；Brevundimonas：單胞菌；Campylobacteria：彎曲菌綱；Caulobacterales：柄桿菌目； Caulobacteraceae：柄桿菌科； Selenomonas_1：月形單胞菌屬_1；Lentisphaerae：黏膠球形菌門；Victivallales：食物古菌目Victivallaceae：食物谷菌科；Anaerocella：厭氧菌屬；Succinimonas：琥珀酸單胞菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group 毛螺菌科NK4A136群；Proteobacteria：變形菌門；Gammaproteobacteria：變形菌綱。

2.4.2 門水平上的結(jié)構(gòu)差異

在門分類水平上對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落中相對豐度排名前10的物種進(jìn)行統(tǒng)計，由表4可知，湖羊組和小尾寒羊組瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)組成存在明顯差異，其中湖羊組瘤胃中優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，分別占微生物總相對豐度的58.81%、17.21%和16.09%；而小尾寒羊組瘤胃中優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門，分別占微生物總相對豐度的36.00%、36.52%、5.97%和3.38%。其中，小尾寒羊組瘤胃中擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度顯著高于湖羊組(P<0.05)，但變形菌門相對豐度顯著低于湖羊組(P<0.05)。

表4 瘤胃微生物在門水平上的結(jié)構(gòu)差異

2.4.3 屬水平上的結(jié)構(gòu)差異

在屬分類水平上對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落中相對豐度排名前10的物種進(jìn)行統(tǒng)計，由表5可知，湖羊組和小尾寒羊組瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)組成存在明顯差異，其中湖羊組瘤胃相對豐度較高的菌屬為瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、普氏菌屬_1(Prevotella_1)和解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)，分別占微生物總相對豐度15.63%、8.05%和7.35%；小尾寒羊組相對豐度較高的菌為屬普氏菌屬_1、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、奎因氏菌屬(Quinella)和理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)，分別占微生物總相對豐度14.53%、11.40%、10.43%和7.79%。湖羊組和小尾寒羊組之間瘤胃微生物屬水平上的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表5 瘤胃微生物在屬水平上的結(jié)構(gòu)差異

2.4.4 KEGG代謝通路差異分析

利用PICRUSt軟件對已測得的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測，將得到的功能基因信息參考KEGG數(shù)據(jù)庫Level 3層級基因類別進(jìn)行劃分歸類(圖3)。湖羊組和小尾寒羊組瘤胃細(xì)菌在Level 3層級共包含39種差異基因功能家族，其中湖羊組中核黃素代謝、安莎霉素生物合成、同源重組、硫胺素代謝、百日咳、單酰胺菌素生物合成、上皮細(xì)胞細(xì)菌侵入通路和癌癥通路等功能基因相對豐度顯著高于小尾寒羊組(P<0.05)，而小尾寒羊組中氰基氨基酸代謝、細(xì)菌趨化性、丙氨酸代謝、雙組分系統(tǒng)、聚酮化合物糖單元生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路和蛋白質(zhì)消化吸收等功能基因相對豐度顯著高于湖羊組(P<0.05)。

GABAergic synapse：GABA能突觸；DNA replication：DNA復(fù)制；Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis：倍半萜和三萜生物合成；N-glycan biosynthesis：N-聚糖生物合成；Riboflavin metabolism：核黃素代謝；Sulfur relay system：硫中繼系統(tǒng)；Synthesis and degradation of ketone bodies：酮體的合成與降解；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；Biosynthesis of ansamycins：安莎霉素的生物合成；Bacterial invasion of epithelial cells：上皮細(xì)胞細(xì)菌侵入通路；Homologous recombination：同源重組；Bacterial chemotaxis：細(xì)菌趨化性；Two-component system：雙組分系統(tǒng)；Toluene degradation：甲苯降解；Fluorobenzoate degradation：氟苯甲酸鹽降解；Thiamine metabolism：硫胺素代謝；Pertussis：百日咳；Monobactam biosynthesis：單酰胺菌素生物合成；Protein processing in endoplasmic reticulum：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工；Pentose phosphate pathway：磷酸戊糖途徑；Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis：托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成；Protein export：蛋白質(zhì)輸出；Polyketide sugar unit biosynthesis：聚酮化合物糖單元生物合成；Pathways in cancer：癌癥通路；Acarbose and validamycin biosynthesis：阿卡波糖和纈氨霉素的生物合成；Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis：泛醌和其他萜類醌的生物合成；Mismatch repair：錯配修復(fù)；Phosphatidylinositol signaling system：磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)；Histidine metabolism：組氨酸代謝；Prolactin signaling pathway：催乳素信號通路。

2.5 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物與瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)相關(guān)性分析

在屬水平對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落與其瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析(圖4)。湖羊組瘤胃桿菌屬相對豐度與pH和丙酸、戊酸、異戊酸和異丁酸含量呈正相關(guān)，瘤胃球菌科_UCG-014、普氏菌屬_1和解琥珀酸菌屬相對豐度與pH和氨態(tài)氮、異丁酸、戊酸和TVFA含量呈正相關(guān)，奎因氏菌屬、新月形單胞菌屬和毛螺菌科AC2044群相對豐度與氨態(tài)氮、VFA、乙酸和丁酸含量呈正相關(guān)。而小尾寒羊組普氏菌屬_1、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬_2、奎因氏菌屬和毛螺菌科AC2044群相對豐度與pH呈正相關(guān)，瘤胃球菌屬_2、奎因氏菌屬、毛螺菌科AC2044群、理研菌科RC9腸道群、新月形單胞菌屬和厭氧原體屬相對豐度與乙酸和TVFA含量呈正相關(guān)，理研菌科RC9腸道群、新月形單胞菌屬、厭氧原體屬相對豐度與戊酸、異丁酸、異戊酸和氨態(tài)氮含量呈正相關(guān)，普氏菌屬_1和新月形單胞菌屬_1相對豐度與丙酸和丁酸含量呈正相關(guān)，解琥珀酸菌屬相對豐度與丙酸含量呈正相關(guān)。

NH3-N：氨態(tài)氮 ammoniacal nitrogen；Acetic acid：乙酸；Propionic acid：丙酸；Valeric acid：戊酸；Butyric acid：丁酸；Isovaleric acid：異戊酸；Isobutyric acid：異丁酸；TVFA：總揮發(fā)性脂肪酸；Ruminobacter：瘤胃桿菌屬；Prevotella_1：普氏菌屬_1；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Quinella：奎因氏菌屬；Selenomonas：新月形單胞菌屬；Lachnospiraceae_AC2044_group：毛螺菌科AC2044群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Erysipelotrichaceae_UCG_004：韋榮球菌科_UCG_004；Anaeroplasma：厭氧原體屬。

3 討 論

3.1 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊生長性能的影響

家畜的生長性能是評價其對飼糧、飼養(yǎng)管理方式及環(huán)境等因素適應(yīng)情況的重要指標(biāo)[11]。在紅豆草茬地混群放牧的飼養(yǎng)管理模式下，湖羊的始重和末重顯著高于小尾寒羊，但其體重增長率和平均日增重顯著低于小尾寒羊。本試驗2個品種綿羊在體重上的差異與郭定恩等[4]在比較1～6月齡小尾寒羊與湖羊生長性能的研究中結(jié)果一致。這可能是由于綿羊品種不同，使其生長性能產(chǎn)生了差異[12]。

3.2 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)的影響

在反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)中，pH受飼糧組成、VFA的合成與吸收、唾液分泌以及食糜的排空速率等多種因素影響[13]，被認(rèn)為是評價瘤胃內(nèi)部環(huán)境的一項綜合指標(biāo)。瘤胃pH適宜范圍為6.5～6.8[14]。在本試驗中，放牧湖羊和小尾寒羊瘤胃pH分別為7.09和7.21，均高于適宜范圍。這可能是由于本飼養(yǎng)管理模式下動物所采食的牧草纖維含量較高，對瘤胃壁產(chǎn)生較大摩擦促進(jìn)了瘤胃上皮角質(zhì)化層和死亡上皮細(xì)胞的脫落，使瘤胃上皮的吸收面積增加，促進(jìn)了瘤胃VFA的吸收及pH的升高[15]。并且，在放牧過程中牧草中纖維含量較高，可能使動物的反芻行為受到了影響，其咀嚼和反芻的時間延長，唾液分泌量隨之增加，對瘤胃內(nèi)環(huán)境pH起到了緩沖作用[16]。氨態(tài)氮是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要原料，適宜范圍為8.5～30.0 mg/dL，如果氨態(tài)氮含量過低，瘤胃微生物的生產(chǎn)能力將會受到抑制[17]。本試驗中，湖羊組和小尾寒羊組瘤胃中氨態(tài)氮含量分別為14.88和14.24 mg/dL，均在適宜范圍內(nèi)。瘤胃中VFA是反芻動物生長繁殖的主要能源物質(zhì)，約占反芻動物機體碳代謝的2/3。本試驗中，湖羊組和小尾寒羊組瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量較高，占TVFA的95%以上，與李文[15]的研究結(jié)果相同。已有研究表明，當(dāng)飼糧中粗飼料所占比例高時，瘤胃內(nèi)乙酸含量較高；精料所占比例高時，瘤胃內(nèi)丙酸含量較高[18]。本試驗在放牧過程中動物主要采食粗飼料，故2個品種的綿羊瘤胃中乙酸含量都較高。Bensadoun等[19]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中VFA的產(chǎn)生與瘤胃微生物有密切關(guān)系，排除其他干擾，當(dāng)瘤胃微生物由2.2×105CFU/mL增加到3.13×105CFU/mL時，TVFA含量則由117.95 mmol/L增加至136.94 mmol/L。楊亮宇等[20]通過在人工瘤胃中添加不同木霉培養(yǎng)液并監(jiān)測其TVFA產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)不同種類和組合的微生物對其瘤胃TVFA產(chǎn)量和組成有顯著影響。而在本試驗中，小尾寒羊瘤胃TVFA含量顯著高于湖羊，究其原因可能是由于不同品種間瘤胃微生物結(jié)構(gòu)和相對豐度差異所導(dǎo)致。

3.3 紅豆草茬地放牧對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃作為一個微生態(tài)系統(tǒng)，其中的微生物能夠通過組成結(jié)構(gòu)的動態(tài)演替來響應(yīng)外界條件的變化，使耐受性更高的微生物種類得以保留[21]。而影響瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的因素有很多種，例如生理階段、營養(yǎng)水平、動物品種、季節(jié)和飼喂方式等[22]。劉開朗等[23]對不同品種牛瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛與魯西牛瘤胃細(xì)菌16S rDNA文庫存在明顯差異，表明牛的品種是影響瘤胃微生物的重要因素，且大于飼糧或其他因素。而本試驗中，LEfSe差異分析表明在不同分類水平上湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物區(qū)系之間也存在明顯差異。α多樣性主要用于評估單個樣品中微生物豐度和多樣性，具體衡量指標(biāo)有Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。其中Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品微生物多樣性越高[24]。本試驗中，小尾寒羊組Shannon指數(shù)顯著高于湖羊組，而Simpson指數(shù)顯著低于湖羊組，說明小尾寒羊瘤胃微生物多樣性較高。Flint等[25]研究表明，宿主胃腸道微生物多樣性越高，則其對宿主健康貢獻(xiàn)越大。當(dāng)瘤胃微生物多樣性降低時，致病菌易侵入會對瘤胃常駐菌形造成營養(yǎng)競爭性抑制，從而增加動物患胃腸道疾病的風(fēng)險[26]。而本試驗條件下，小尾寒羊瘤胃微生物多樣性高于湖羊，說明在紅豆草二茬草地放牧飼養(yǎng)管理方式下，小尾寒羊的患病風(fēng)險低于湖羊。Liu等[27]和Xue等[28]研究均表明，反芻動物瘤胃微生物在門水平上相對豐度較高的優(yōu)勢菌門依次為擬桿菌門和厚壁菌門，這與本研究中小尾寒羊組試驗結(jié)果相同，其瘤胃中擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度分別達(dá)到36.00%和36.52%。但湖羊組瘤胃中相對豐度最高的為變形菌門(58.81%)，其次為擬桿菌門(17.21%)。已有研究表明，反芻動物瘤胃中擬桿菌門可以分解飼料中碳水化合物和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，還可協(xié)助宿主分解多糖，厚壁菌門中包含許多纖維降解菌可促進(jìn)反芻動物對纖維物質(zhì)的消化吸收，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[29]。而變形菌門主要為革蘭氏陰性菌，此菌門包含多種病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等，其含量高于19%一般被認(rèn)為是微生物群落不穩(wěn)定的主要標(biāo)志[30-31]。在本研究中，小尾寒羊組瘤胃中擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度均顯著高于湖羊組，但變形菌門相對豐度顯著低于湖羊。這說明小尾寒羊?qū)δ敛莸南漳芰σ獌?yōu)于湖羊，而湖羊組瘤胃中變形菌門相對豐度較高，說明其瘤胃菌群結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。并且，通過對湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物進(jìn)行KEGG代謝通路差異分析發(fā)現(xiàn)，湖羊組百日咳、上皮細(xì)胞細(xì)菌侵入通路和癌癥通路等功能基因的相對豐度顯著高于小尾寒羊組，這可能與該品種對于飼養(yǎng)管理方式的適應(yīng)性有關(guān)。湖羊組安莎霉素生物合成和單酰胺菌素生物合成的功能基因相對豐度顯著高于小尾寒羊組。安莎霉素和單酰胺菌素是2種結(jié)構(gòu)獨特的抗生素，具有很強的抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌和抗病毒活性作用[32-33]。湖羊組與抗生素合成相關(guān)的功能基因相對豐度較高，這可能是由于其對于紅豆草茬地放牧的飼養(yǎng)管理模式適應(yīng)性較差，從而導(dǎo)致其瘤胃菌群失調(diào)，機體需要通過調(diào)節(jié)抗生素合成通路來抵抗致病菌的侵入，使動物適應(yīng)環(huán)境帶來的壓力。而小尾寒羊組與氨基酸代謝相關(guān)的通路如氰基氨基酸代謝、丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝以及蛋白質(zhì)消化吸收等功能基因相對豐度顯著高于湖羊組。

在紅豆草茬地放牧條件下，湖羊和小尾寒羊瘤胃中優(yōu)勢菌屬與其瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)之間的相關(guān)性存在差異。在屬分類水平上湖羊瘤胃中相對豐度最高的微生物為瘤胃桿菌屬，但在小尾寒羊瘤胃中相對豐度較低。瘤胃桿菌屬是一類嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，具有很強的淀粉酶活性[34]。因此，在本試驗中瘤胃桿菌屬相對豐度與pH和丙酸、戊酸、異戊酸、異丁酸含量均呈正相關(guān)，而小尾寒羊組瘤胃球菌屬相對豐度較低，且與瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)相關(guān)性較弱。普氏菌屬_1是小尾寒羊和湖羊瘤胃中相對豐度均較高的微生物，可能由于其既擁有高活性的半纖維素分解菌，又對植物非纖維多糖和蛋白質(zhì)的降解發(fā)揮重要作用，能夠在動物瘤胃中占據(jù)不同的生態(tài)位所導(dǎo)致[35]。但在湖羊組瘤胃中普氏菌屬_1相對豐度分別與pH和氨態(tài)氮、異丁酸、戊酸和TVFA含量呈正相關(guān)，而在小尾寒羊組中只與丙酸和丁酸含量呈正相關(guān)。解琥珀酸菌屬是典型的纖維降解菌，能發(fā)酵降解纖維素或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[36]。琥珀酸可再次被降解為丙酸，并且解琥珀酸菌屬還參與蛋白質(zhì)降解過程，同時產(chǎn)生氨態(tài)氮等物質(zhì)[37]。因此，在本試驗中，湖羊組和小尾寒羊組瘤胃中解琥珀酸菌屬相對豐度分別與pH、丙酸含量呈正相關(guān)，但其與氨態(tài)氮含量的相關(guān)性在2組中存在差異。新月形單胞菌很多能發(fā)酵淀粉，所有菌株都能產(chǎn)生乙酸和丙酸，但丁酸、琥珀酸、乳酸和甲酸的產(chǎn)生因菌株而異[38]。在本試驗中，湖羊組新月形單胞菌屬相對豐度與乙酸含量呈正相關(guān)，而小尾寒羊組新月形單胞菌屬相對豐度與丙酸含量呈正相關(guān)。造成不同品種放牧綿羊瘤胃中優(yōu)勢菌屬與其瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)之間的相關(guān)性差異的原因，可能是由于湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)不同，使同一種微生物在不同的環(huán)境中功能發(fā)生了改變。

4 結(jié) 論

① 在紅豆草茬地放牧條件下，小尾寒羊生長性能優(yōu)于湖羊，其瘤胃內(nèi)TVFA含量及瘤胃內(nèi)微生物多樣性均高于湖羊。

② 在紅豆草茬地放牧條件下，小尾寒羊和湖羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)及相對豐度存在差異，其中小尾寒羊瘤胃中優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，而湖羊瘤胃中優(yōu)勢菌門為變形菌門；功能預(yù)測分析結(jié)果顯示，湖羊在疾病及抗生素合成通路的功能基因相對豐度顯著高于小尾寒羊。

③ 小尾寒羊和湖羊瘤胃中優(yōu)勢菌屬與瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)之間的相關(guān)性存在差異。

綜上所述，湖羊和小尾寒羊?qū)υ诩t豆草茬地放牧飼養(yǎng)管理方式的響應(yīng)情況不同，且小尾寒羊的飼養(yǎng)效果優(yōu)于湖羊。