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    鴨干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白抑制基因3型鴨甲型肝炎病毒的增殖

    2022-03-30 02:29:30王一丹陳弟詩張煥容任玉鵬
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒測序分子

    王一丹,陳弟詩,向 華,張煥容,任玉鵬*

    (1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,成都 610041)

    鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)是小RNA病毒科家族成員,以引起鴨肝腫大、彌漫性出血和壞死為主要特征,對3周齡內(nèi)雛鴨易感性和致死率最高,也是目前OIE規(guī)定需要法定報(bào)告的疾病之一[1]。根據(jù)DHAV的基因序列特征和遺傳進(jìn)化分析,可將DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三個(gè)亞型,其中DHAV-3型首次發(fā)現(xiàn)于韓國[2]。據(jù)調(diào)查,在2010-2015年,我國遼寧、山東、浙江、江蘇、福建、廣西、湖北和四川等多省來源樣本中,DHAV-1和DHAV-3總陽性率高達(dá)91.4%(320/350);而2013年后的流行毒株以DHAV-3為主(占比達(dá)57.1%)[3]。當(dāng)前對DHAV的防控主要依賴于對母鴨開產(chǎn)前的免疫接種和出殼雛鴨卵黃抗體注射,但現(xiàn)有商品化的疫苗或抗體僅針對DHAV-1,對DHAV-3感染的保護(hù)效果不佳[4],這使得養(yǎng)殖場鴨群一旦暴發(fā)病毒性肝炎將遭受經(jīng)濟(jì)損失。因此,對DHAV-3新型有效防治方法的研究具有必要性。

    干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon-induced transmembrane proteins, IFITMs)是近年來發(fā)現(xiàn)的位于多種組織細(xì)胞膜中,由膜蛋白受體CD225基因家族編碼的具有免疫調(diào)節(jié)和廣譜抗病毒效應(yīng)的蛋白家族[5]。IFITMs主要由機(jī)體免疫系統(tǒng)在病原模式分子刺激下產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素通過JASK-STAT信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。已有研究表明,IFITMs可抑制正黏病毒、副黏病毒(如禽流感病毒)的復(fù)制[7],阻止絲狀病毒和冠狀病毒(如COVID-19)的吸附入侵,抑制黃病毒的膜融合和內(nèi)吞作用[8]。此外,IFITMs對口蹄疫病毒和柯薩奇病毒等[9]小RNA病毒的復(fù)制也具有類似的抑制作用。因此,IFITMs有望成為一類新型、高效的抗病毒藥物。但目前國內(nèi)外關(guān)于duIFITMs 是否對DHAV也具有抑制作用尚不清楚,因而深入探討duIFITMs對DHAV-3感染的抑制作用和揭示其分子機(jī)制可以為duIFITMs成為一種新型有效的抗病毒分子奠定理論基礎(chǔ)。

    本研究以DHAV-3毒株對 3日齡 SPF雛鴨攻毒,通過對雛鴨肝組織中mRNA進(jìn)行高通量測序分析,并結(jié)合Real-time PCR檢測duIFITMs的表達(dá)水平變化,篩選出可能具有抗病毒作用的duIFITM家族成員,進(jìn)一步在DELC中驗(yàn)證其對DHAV-3的抑制作用,為DHAV新型防治藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物和毒株

    用于攻毒的3日齡雛鴨由SPF櫻桃谷鴨胚孵化,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,并在西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)至適齡。DHAV-3 SWUNC4 株(TCID50: 10-5.34·0.2 mL-1)由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存[10]。

    1.2 主要試劑材料

    PrimescriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SacⅡ和pEGFP-N1購自寶生物工程(大連)有限公司;Gel Extraction Kit和Endo-Free Plasmid Mini Kit I購自美國Omega Bio-Tek 公司;Applied BiosystemsTMPowerTMSYBRTMGreen預(yù)混液和PageRulerTMPrestained Protein Ladder 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;FuGENE? HD Transfection Reagent 購自美國 Roche Applied Science 公司;Anti-GAPDH Monoclonal Antibody 購自艾美捷科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 購自安諾倫(北京)生物科技有限公司;鼠抗 duIFITM1 由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

    1.3 動(dòng)物分組及攻毒

    將3日齡雛鴨按每組9羽隨機(jī)分成攻毒組和對照組。將經(jīng)過0.22 μm濾器處理后的 DHAV-3 SWUNC4 株病毒尿囊液稀釋至100 TCID50,按每羽 200 μL劑量由胸部多點(diǎn)肌肉注射方式攻毒。分別于感染后12、24和36 h剖殺攻毒組和對照組雛鴨各3只,無菌采集肝組織塊,并立即浸泡在液氮中迅速冷凍,再轉(zhuǎn)入DEPC處理且滅菌EP管,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱備后續(xù)研究使用。

    1.4 基于RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序分析

    以Trizol regeant法提取肝組織樣本中的總RNA。用核酸蛋白儀 Nanodrop 2000 測定并計(jì)算提取的核酸的OD260 nm/OD280 nm比值,驗(yàn)證RNA樣品純度和完整性。分別將感染DHAV-3 12、24 h雛鴨肝的RNA樣本送深圳華大基因科技有限公司,用Illumina MiseqTM2000技術(shù)平臺(tái)對樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

    用Albacore軟件將通過RNA-seq技術(shù)得到的測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和處理;用Soapnuke軟件以默認(rèn)參數(shù)對獲取片段堿基組成和質(zhì)量分析以確定原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量,濾除reads中的測序接頭和低質(zhì)量堿基,獲得clean reads用于信息分析。與參考基因組進(jìn)行比對和分析。用NOISeq統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因。并設(shè)置閾值log2fold change≥-1或>1,probability>0.8 得到樣本之間的表達(dá)差異基因。GO富集分析和差異基因的KEGG pathway分析采用超幾何檢驗(yàn)和FDR矯正,F(xiàn)DR<0.05被認(rèn)為屬于顯著富集,使用Omicshare在線分析繪圖。根據(jù)pathway分析結(jié)果,重點(diǎn)篩選出免疫與炎癥相關(guān)通路上的基因。用Cytoscap軟件對所有的候選基因進(jìn)行pathway富集和圖形化分析。

    1.5 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證

    根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選與雛鴨抗病毒免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)分子(IFN-α、IFN-β、RIG-I、MDA5、IFITM1、IFITM5、IRF1、IRF3、IL-8和IL-10等)。用 Real-time PCR法分別對攻毒后12、24和36 h肝組織樣本中相關(guān)分子的mRNA含量進(jìn)行驗(yàn)證。所用引物都參考GenBank上登錄的綠頭鴨相關(guān)基因序列,利用 oligo 7軟件設(shè)計(jì)篩選,并以GAPDH基因作內(nèi)參,詳細(xì)信息見表1。

    表1 熒光定量PCR驗(yàn)證所用引物信息

    Real-time PCR反應(yīng)體系:2×SYBR Green I PCR Mix 8 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 5 μL;反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。并根據(jù)GAPDH基因擴(kuò)增結(jié)果的Ct值計(jì)算2-△△Ct值,分析基因表達(dá)的倍數(shù)差異,同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序比較分析。

    1.6 pEGFP-duIFITM1在DELC 中的過表達(dá)

    根據(jù)NCBI上綠頭鴨 IFITM1(AnasplatyrhynchosIFIM1, duIFITM1)cDNA序列作為參考(Accession number: NM_001310823.1),在基因兩端引入HindⅢ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和 Kozak 序列(GCCACC),由武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行基因合成,片段大小為 450 bp,預(yù)測其表達(dá)蛋白大小約 15.8 ku。合成的基因連入 pMD19-T,并測序驗(yàn)證其正確性。分別對 pMD19-T-duIFITM1 和 pEGFP-N1 載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,反應(yīng)體系均為質(zhì)粒 8 μL,HindⅢ 1.5 μL,SacⅡ 1 μL,1.5×T+BSA Buffer 33 μL,ddH2O 6.5 μL,總體積 50 μL。將目的基因亞克隆至pEGFP-N1載體,構(gòu)建pEGFP-duIFITM1重組質(zhì)粒,并測序驗(yàn)證其正確性。

    按照OMEGA公司的Endo-Free質(zhì)粒提取試劑盒相關(guān)指南提取重組質(zhì)粒。用 FuGENE? HD Transfection Reagent 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將pEGFP和pEGFP-duIFITM1分別轉(zhuǎn)入生長良好,密度約80%的DELC單層細(xì)胞,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)三個(gè)重復(fù),同時(shí)將脂質(zhì)體直接加入細(xì)胞孔作對照。轉(zhuǎn)染前測定質(zhì)粒濃度,將2 μg(200~400 ng·μL-1)質(zhì)粒樣本同 100 μL DMEM 混勻;用無菌Hank’s 液漂洗細(xì)胞數(shù)次,按2∶5比例,把脂質(zhì)體與質(zhì)?;靹蚋凶?0 min,按100 μL·孔-1緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)板;培養(yǎng) 5~6 h后將培養(yǎng)基更換為含10%小牛血清的無抗生素DMEM;轉(zhuǎn)染 24~48 h 后通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞孔中的熒光。用MTT法檢測過表達(dá)duIFITM1對DELC細(xì)胞活力的影響。

    1.7 siRNA干擾 DELC中 duIFITM1的表達(dá)

    用生長至80%的DELC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按照FuGENE? HD Transfection Reagent說明書進(jìn)行操作,將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA按照 3∶2比例混合,以O(shè)pti-MEM 培養(yǎng)基補(bǔ)足至體積55 μL,同時(shí)設(shè)置空白對照組。以上溶液輕輕混勻,室溫放置15 min,將脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合體加入各細(xì)胞孔內(nèi),放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,利用 Real-time PCR檢測duIFITM1蛋白的mRNA表達(dá)水平,篩選有效的siRNA干擾片段。duIFITM1-siRNA序列由InvitrogenTM公司合成,序列見表2。通過MTT法測定siRNA 干擾對DELC細(xì)胞活力的影響。

    表2 duIFITM1基因的siRNA序列

    1.8 熒光定量PCR驗(yàn)證DELC中duIFITM1轉(zhuǎn)錄情況

    用 Real-time PCR 分別對轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA 48 h的DELC 中,duIFITM1 mRNA 進(jìn)行檢測,驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄情況,所用引物和反應(yīng)條件同“1.5”。

    1.9 Western blot驗(yàn)證DELC中duIFITM1表達(dá)情況

    將轉(zhuǎn)染48 h的DELC用無菌PBS漂洗3次,加入RIPA裂解液作用5 min;用橡膠刮刀把瓶壁細(xì)胞刮落;將細(xì)胞懸液冰浴30 min;離心收集上清液,用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定濃度和確定上樣量為 50 μg·孔-1。將待測樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜上,用5%的脫脂奶封閉3 h;用TBST 洗滌3次;分別用鼠抗 duIFITM1(1∶400)和鼠抗 GADPH(1∶2 000)作為一抗,4 ℃孵育過夜;再次TBST漂洗后,加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗鼠 IgG(1∶2 000),室溫孵育30 min,用 TBST清洗4次,用 ECL試劑顯色成像。

    1.10 duIFITM1過表達(dá)和敲減對DELC中DHAV-3增殖的影響

    按前述試驗(yàn)方法和條件將pEGFP-duIFITM1和duIFITM-siRNA分別轉(zhuǎn)染 DELC 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h棄去DMEM,用Hanks 液清洗2次,按100 TCID50接種DHAV-3 SWUNC4 株感作1 h后棄去病毒液,并用 Hanks 液清洗3次,加入維持液放入CO2培養(yǎng)箱連續(xù)觀察。分別收集接毒后24、36、48和60 h的DELC樣本并抽提 RNA。參考文獻(xiàn)中的Taqman熒光定量方法[11]檢測各時(shí)間點(diǎn)樣本中病毒拷貝數(shù)。同時(shí),分別測定 48和60 h的duIFITM1過表達(dá)和敲減組樣本中 DHAV-3 的 TCID50以確定病毒滴度。將DELC細(xì)胞按104每孔鋪于96孔板中,培養(yǎng)24 h。將DHAV-3用DMEM按10倍倍比稀釋法稀釋(10-2~10-9),各稀釋度按 0.2 mL·孔-1接入微孔板中,以Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

    2 結(jié) 果

    2.1 測序結(jié)果與參考基因組的比對

    對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)過濾處理后,總共得到300 M reads。通過將clean reads定位到北京鴨基因組之后,發(fā)現(xiàn)基因組的比對率為68.22%~78.24%;其中,unique 比對率為53.90%~61.25%(表3)。此外根據(jù)統(tǒng)計(jì),所有reads的基因比對率為42.64%~49.38%。根據(jù)基因區(qū)的比對結(jié)果,作者通過RESM軟件進(jìn)行了基因的定量處理,標(biāo)準(zhǔn)化方法采用FPKM,總共檢測出14 175個(gè)編碼基因具有表達(dá),其中,13 279~13 597個(gè)基因在單樣本中都有表達(dá)。

    表3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和參考基因的比對

    2.2 差異表達(dá)基因的pathway分析

    對各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平有顯著差異的基因進(jìn)一步作 KEGG pathway 富集分析(圖1)。其中,感染 DHAV-3 后12 和24 h 雛鴨肝中的差異表達(dá)基因相關(guān)通路數(shù)量分別為250和195條,兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本中顯著富集的通路分別為54和20條(FDR<0.05)。此外12 h富集的通路主要集中在TNF 信號通路、NF-κB 信號通路、細(xì)胞因子互作、A型流感相關(guān)通路和TLRs相關(guān)通路等。感染24 h樣本中差異表達(dá)基因則主要富集在A型流感相關(guān)通路、氧化磷酸化過程、趨化因子相關(guān)信號通路、NF-κB 信號通路、RLRs相關(guān)通路、JAK-STAT 信號通路和TLRs相關(guān)通路等。根據(jù)KEGG pathway富集分析結(jié)果進(jìn)一步分析抗病毒免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)分子,從感染12和24 h表達(dá)差異基因中分別篩選出147個(gè)和64個(gè)關(guān)鍵基因。其中,duIFIITM1 和duIFITM5在12 h的log2FC值分別為5.452 669 1(P<0.05)和 3.921 245 889(P<0.05), 在24 h的log2FC值分別為10.464 801(P<0.05)和 1.793 824,這提示duIFIITM 可能在雛鴨早期感染DHAV-3過程中發(fā)揮重要作用。

    2.3 抗DHAV-3感染免疫相關(guān)分子的Real-time PCR驗(yàn)證

    通過對duIFITM1和duIFITM5兩個(gè)家族成員的real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),duIFITM1在DHAV-3感染后的24和36 h分別達(dá)到對照組的4.42倍和7.14倍(P<0.01),但 duIFITM5 的水平變化并不明顯。另外,對其他感染與免疫相關(guān)細(xì)胞因子的 Real-time PCR 法檢測結(jié)果與RNA-seq技術(shù)檢測分析結(jié)果基本相符(圖2)。對上述關(guān)鍵分子的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在 DHAV-3 感染后的 12~24 h 與小RNA病毒識(shí)別相關(guān)的部分 PPRs 表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化,如:RIG-I 和MDA5在 DHAV-3感染后的12和24 h樣本中始終保持在較低水平的表達(dá),且與對照組無顯著差異,但在36 h后mRNA水平迅速上調(diào)到 4.23 倍(P<0.01)和3.61 倍(P<0.05);對兩種Ⅰ型干擾素的檢測也發(fā)現(xiàn),IFN-α 和 IFN-β 在12和24 h的表達(dá)量與對照組相比無顯著差異,直至 36 h 才分別達(dá)到對照組的 5.37 倍(P<0.01)和 2.45倍(P<0.05)。

    C.對照組; V.攻毒組。*.P<0.05; **.P<0.01; ****.P<0.000 1

    此外,IRF1和IRF3在介導(dǎo)TLRs和RLRs識(shí)別病原相關(guān)分子產(chǎn)生干擾素過程和抗病毒免疫相關(guān)的信號通路交互作用中發(fā)揮著重要作用[12]。本次熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,在DHAV-3感染12 h后,IRF1和IRF3的表達(dá)水平都顯著持續(xù)上升,表明二者在病毒感染和免疫相關(guān)的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

    在本次驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn),感染后的24 h雛鴨肝中,與炎癥反應(yīng)和組織損傷程度相關(guān)的IL-8和IL-10的mRNA水平均顯著上調(diào)(分別為對照組的6.47倍和5.69倍),可能提示病毒感染造成的肝損傷程度在24 h即可達(dá)到較高水平,這與朱玉東等[13]對DHAV-3人工感染雛鴨誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞因子檢測結(jié)果相符。

    2.4 duIFITM1對DHAV-3 SWUNC4株在DELC中的抑制作用

    2.4.1 pEGFP-duIFITM1重組真核表達(dá)載體的鑒定 對構(gòu)建好的重組pEGFP-duIFITM1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,經(jīng)電泳觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 700和450 bp處出現(xiàn)了與預(yù)測大小相一致的亮帶(圖3)。對重組質(zhì)粒序列分析并與參考基因序列(NM_001310 823.1)進(jìn)行比對,結(jié)果核苷酸相似性為100%,表明pEGFP-duIFITM1 構(gòu)建成功。

    M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.pEGFP-N1空質(zhì)粒對照; 2.pEGFP-duIFITM1

    2.4.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DELC細(xì)胞 將pEGFP-duIFITM1通過脂質(zhì)體法導(dǎo)入DELC細(xì)胞中,分別在24和48 h于倒置熒光顯微鏡觀察。結(jié)果在pEGFP和pEGFP-duIFITM1轉(zhuǎn)染組均可觀察到清晰的綠色熒光蛋白出現(xiàn),且duIFITM1基因的引入對pEGFP綠色熒光的強(qiáng)度沒有明顯的影響,由此間接證明重組質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入DELC細(xì)胞,同時(shí)載體蛋白在細(xì)胞中獲得良好的表達(dá)(圖4)。

    圖4 pEGFP-IFITM1在DELC中的表達(dá)(bar=100 μm)

    2.4.3 duIFITM1過表達(dá)和siRNA干擾的熒光定量PCR驗(yàn)證 分別收集轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 和 pEGFP-duIFITM1 后 48 h 的 DELC,反復(fù)凍融3次后,Real-time PCR檢測。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的DELC樣本中,duIFITM1蛋白的mRNA水平顯著高于pEGFP-N1空質(zhì)粒組(P<0.01),pEGFP-duIFITM1 被成功轉(zhuǎn)入鴨胚肝原代細(xì)胞且高效表達(dá)(圖5A)。

    以GAPDH為內(nèi)參基因,Real-time PCR檢測結(jié)果表明,與對照組相比duIFITM1-siRNA1、duIFITM1-siRNA2和duIFITM1-siRNA3下調(diào)duIFITM1表達(dá)量分別為 60.6%、55.0%和54.4%,因此,duIFITM1-siRNA1干擾效果更好(P<0.01)(圖5B),后續(xù)研究選用duIFITM1-siRNA1作為干擾片段。

    A.過表達(dá);B.siRNA干擾; **.P<0.01

    2.4.4 duIFITM1過表達(dá)和siRNA干擾的Western blot驗(yàn)證 分別刮取轉(zhuǎn)染空載體和 pEGFP-duIFITM1后48 h的DELC細(xì)胞進(jìn)行 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證,以GADPH 蛋白為內(nèi)參。在 pEGFP-duIFITM1 轉(zhuǎn)染組樣品泳道出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶(15.8 ku),同時(shí)GADPH內(nèi)參蛋白(36 ku)條帶也清晰可見,且表達(dá)量相對穩(wěn)定。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了duIFITM1在DELC中的成功表達(dá)(圖6A、B)。

    用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染duIFITM1-siRNA1對DELC細(xì)胞中duIFITM1蛋白表達(dá)情況的影響。結(jié)果顯示,相比于對照組,siRNA片段可以有效降低duIFITM1蛋白表達(dá)水平。同時(shí)GADPH內(nèi)參蛋白穩(wěn)定表達(dá)(圖6C、D)。

    A、B.過表達(dá);C、D.siRNA干擾;A.pEGFP-IFITM1組出現(xiàn)目的條帶;B.GADPH內(nèi)參蛋白;C.si-IFITM1 干擾組目的蛋白表達(dá)量下降;D.GADPH內(nèi)參蛋白

    2.4.5 過表達(dá)和干擾duIFITM1對DELC活力的影響 細(xì)胞活力測定結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染 duIFITM1-siRNA、pEGFP-N1和pEGFP-duIFITM1的DELC細(xì)胞在12、24、48、60和72 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均未出現(xiàn)明顯變化,表明上述轉(zhuǎn)染過程不會(huì)抑制DELC細(xì)胞的活力(圖7)。

    圖7 DELC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的活力測定

    2.5 duIFITM1對DHAV-3 SWUNC4株在DELC中的抑制作用

    分別在過表達(dá)和siRNA干擾duIFITM1的DELC中接種DHAV-3 SWUNC4株,對接毒后24、36、48和60 h的細(xì)胞樣本中的病毒核酸含量進(jìn)行檢測,結(jié)果見表4。在接毒后48和60 h,pEGFP-N1組和duIFITM1-siRNA組病毒含量均顯著高于pEGFP-duIFITM1轉(zhuǎn)染組(P<0.01);同樣,對48和60 h樣本中病毒滴度進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,過表達(dá)duIFITM1組病毒lgTCID50·0.2 mL-1值顯著高于pEGFP-N1對照組(圖8A)。上述結(jié)果證明過表達(dá)duIFITM1對DHAV-3在DELC增殖具有明顯的抑制作用。但duIFITM1-siRNA組各時(shí)間點(diǎn)病毒核酸拷貝數(shù)和滴度均與NC組相比沒有顯著差異(圖8B),表明降低duIFITM1表達(dá)量不能直接影響DHAV-3在宿主細(xì)胞中的增殖,這也可能與DELC中duIFITM1本底表達(dá)水平較低有關(guān)。

    A.duIFITM1過表達(dá)細(xì)胞中病毒滴度變化;B.duIFITM1干擾細(xì)胞中病毒滴度變化。**.P<0.01

    表4 duIFITM1過表達(dá)和干擾細(xì)胞中DHAV-3含量的變化

    3 討 論

    根據(jù)IFITMs家族蛋白基因的分子特征及相關(guān)功能目前主要被劃分成了三個(gè)亞家族[14]。第一個(gè)亞家族主要包含在人類發(fā)現(xiàn)的所有與免疫相關(guān)的IFITMs家族蛋白(IFITM1、IFITM2和IFITM3)以及和人IFITMs直系同源的鼠IFITM6和IFITM7[15]。IFITM2和IFITM3基因具有高度的相似性,IFITM1則獨(dú)立形成一個(gè)小分支[16]。IFITM5和IFITM10分別屬于IFITMs的第二個(gè)亞家族和第三個(gè)亞家族,IFITM5在成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞中產(chǎn)生[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)IFITMs多個(gè)家族成員對不同的病原具有抑制作用[18],且對某些病毒的抑制過程十分迅速,但具體分子機(jī)制尚未明確。如:IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6可通過與病毒包膜蛋白或入侵相關(guān)蛋白相互作用有效抑制IAV、MARV、EBOV和SARS病毒的入侵[19-20]。IFITM1可抑制HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[21]。而IFITM1可以在膜融合、內(nèi)吞和核內(nèi)體等多環(huán)節(jié)介導(dǎo)宿主抗CSFV反應(yīng)[22]。部分IFITMs還可能通過與氧固醇結(jié)合蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)膽固醇運(yùn)輸作用,使膽固醇遷入晚期內(nèi)體進(jìn)而阻斷病毒的融合[18]。上述研究表明,IFITMs可能成為新型高效的抗病毒分子。基于這一思路,本研究采用RNA-seq技術(shù)對DHAV-3 SWUNC4株感染雛鴨肝臟中mRNA進(jìn)行高通量測序,并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)軟件對獲得的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)感染早期雛鴨肝中的duIFIITM1 和duIFITM5轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,這提示duIFIITM 可能在雛鴨早期感染DHAV-3過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,duIFITM1在DHAV-3感染后的24和36 h顯著上調(diào),分別為對照組的4.42倍和7.14倍(P<0.01),而duIFITM5在24和36 h表達(dá)量沒有明顯變化,這一趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符,提示duIFITM1是DHAV-3感染早期發(fā)揮抗病毒作用的主要干擾素誘導(dǎo)蛋白家族成員之一。隨后,本研究在DELC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP-duIFITM1和duIFITM1-siRNA,構(gòu)建duIFITM1過表達(dá)和敲減細(xì)胞模型,以驗(yàn)證duIFITM1對DHAV-3可能存在的抑制作用。結(jié)果顯示,經(jīng)Real-time PCR和Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證表明duIFITM1在DELC中獲得穩(wěn)定高效表達(dá);又分別測定過表達(dá)和敲減duIFITM1的DELC中,不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度和核酸含量變化。結(jié)果表明,在接毒后48和60 h,在duIFITM1過表達(dá)細(xì)胞中DHAV-3滴度及核酸量與pEGFP-N1對照組和duIFITM1-siRNA組差異顯著(P<0.01),證明過表達(dá) duIFITM1 對DHAV-3 在DELC 增殖具有明顯的抑制作用。

    此外,本研究通過高通量測序分析共獲得多個(gè)與抗DHAV-3免疫反應(yīng)相關(guān)分子和信號通路;其中TLRs分子表達(dá)上調(diào)和相關(guān)通路的富集出現(xiàn)在感染后12 h,RLRs信號通路相關(guān)分子的富集出現(xiàn)在24 h。目前,TLRs、RLRs和NLRs三類家族蛋白已被證實(shí)為小RNA病毒分子識(shí)別的主要PPRs[23];據(jù)此推測在感染早期 DHAV-3可能存在某種分子逃避機(jī)制使病毒相關(guān)PAMPs在感染初期不能大量激活RLRs,從而為病毒在宿主機(jī)體的潛伏和增殖創(chuàng)造條件;另一種可能是,病毒采取了某種干擾策略抑制了除 TLRs 外的其他兩種 PRRs 的識(shí)別或相關(guān)通路的激活,從而增強(qiáng)病毒對宿主的侵襲力。類似的抑制作用在 DHAV-1 的感染分子機(jī)制研究中已被證實(shí),如:DHAV-1 感染 24 h后 RIG-I 和 MDA5 的表達(dá)水平均顯著下調(diào),提示病毒對 RLRs 具有抑制作用[24]。本研究進(jìn)一步對表達(dá)差異顯著的12個(gè)免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子進(jìn)行了Real-time PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在 DHAV-3 感染12~24 h 樣本中RIG-I 和 MDA5 的mRNA維持在較低水平,但36 h的表達(dá)量顯著上升,這間接印證了關(guān)于病毒早期感染過程中存在逃避RLRs識(shí)別機(jī)制的假設(shè),也表明DHAV-3對宿主的感染過程更傾向于選擇免疫逃避策略而非類似 DHAV-1的免疫抑制。通過Real-time PCR檢測還發(fā)現(xiàn)感染早期 RIG-I 和 MDA5 的表達(dá)水平較低與 IFN-α/IFN-β 早期表達(dá)滯后的變化趨勢一致。目前研究已表明,RLRs 對 PAMP的識(shí)別后激活 IRF3 和 NF-κB 的磷酸化過程是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的重要分子機(jī)制之一,結(jié)合本研究結(jié)果,作者認(rèn)為 DHAV-3感染早期IFN-α 和 IFN-β 的產(chǎn)生相對滯后與 RIG-I 和 MDA5 分子保持較低的表達(dá)水平有關(guān)。另一方面,兩種干擾素表達(dá)水平變化與duIFITM1顯著上升的趨勢并不一致,這提示DHAV-3感染早期duIFITM1可能還受到其他細(xì)胞因子或蛋白的調(diào)節(jié)。當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn),除干擾素外,IL-6和抑癌蛋白M也可誘導(dǎo)部分IFITMs的表達(dá)上調(diào)[25]。進(jìn)一步深入探索duIFITM1誘導(dǎo)因子類型及其水平變化可能為以其作為新型抗病毒分子提供幫助。

    4 結(jié) 論

    首次證實(shí)duIFITM1抑制DHAV-3在DELC增殖,豐富了IFITMs抗病毒研究的相關(guān)資料,為以此開發(fā)新型抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),對雛鴨機(jī)體早期抗病毒免疫的多個(gè)關(guān)鍵分子的表達(dá)水平變化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究和分析,為DHAV-3感染與免疫的分子機(jī)制深入探索提供重要參考。

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