鉛黃腸球菌CMCC(B) 32220的鑒定和全基因組分析*

石繼春，陳馳，梁麗，杜宗利，龍新星，鄭銳，孫文媛，徐穎華，葉強(qiáng)，(.中國食品藥品檢定研究院 國家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京069；．中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，北京069)

鉛黃腸球菌最早由Mundt和Graham于1968年分離獲得，并依據(jù)其形態(tài)和生長特性命名為屎鏈球菌鉛黃亞種[1]，后經(jīng)DNA分子雜交證實(shí)不同于屎鏈球菌，建議新分類為鉛黃腸球菌[2]。可能由于以前命名不規(guī)范和鑒定手段限制等原因，在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心早期根據(jù)生長形態(tài)和生化反應(yīng)等傳統(tǒng)方法鑒定而收錄的幾株屎腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中，發(fā)現(xiàn)1株菌株CMCC(B) 32220的16SrRNA分析比對(duì)結(jié)果不符合屎腸球菌。為了更加全面鑒定該菌株，本研究應(yīng)用全自動(dòng)生化微生物鑒定、16SrRNA基因序列分析、質(zhì)譜分析以及全基因組測序方法對(duì)CMCC(B) 32220進(jìn)行分析和鑒定，并探討分析其基因組基本特征，預(yù)測基因功能、耐藥性及致病性。

1 材料和方法

1.1菌株來源 待鑒定菌株CMCC(B) 32220和對(duì)照菌株鉛黃腸球菌CMCC(B) 32240(ATCC編號(hào)為700327)來源于中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.2主要儀器和試劑 細(xì)菌培養(yǎng)箱(北京中儀國科科技有限公司)，Vitek全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)，Bruker MALDI Biotyper系統(tǒng)(德國Bruker Daltonics公司)。2%含糖牛肉及其瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥公司)，DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3形態(tài)學(xué)與生化鑒定 將待鑒定菌株CMCC(B) 32220和陽性對(duì)照菌株CMCC(B) 32240接種于2%含糖牛肉培養(yǎng)基復(fù)蘇后[3]，再轉(zhuǎn)至瓊脂平板傳代培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)，取新鮮培養(yǎng)物染色鏡檢并應(yīng)用Vitek全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行分析。

1.4基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析 參考文獻(xiàn)[3]，選取待鑒定菌株CMCC(B) 32220和陽性對(duì)照菌株CMCC(B) 32240新鮮培養(yǎng)的菌落，直接涂抹于MALDI靶板上，晾干后滴加1 μL 70%甲酸，待晾干后滴加1 μL基質(zhì)液，然后待靶板晾干后上機(jī)檢測，最終用儀器自帶Biotyper軟件對(duì)結(jié)果譜圖分析。

1.516SrRNA基因序列分析 按照試劑盒說明書將CMCC(B) 32220菌株新鮮過夜培養(yǎng)物進(jìn)行全基因組DNA提取，并使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增和測序(由北京中美泰和公司完成)，應(yīng)用DNAstar軟件將菌株16SrRNA基因序列拼接結(jié)果與美國NCBI數(shù)據(jù)庫保存腸球菌屬不同種的菌株序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析和聚類分析。

1.6細(xì)菌全基因組序列測定與生物信息學(xué)分析 參考文獻(xiàn)[3]，使用Illumina公司Hiseq 2500測序儀進(jìn)行全基因組測序，對(duì)獲得下機(jī)數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件velvet V1.2.03進(jìn)行拼裝，并結(jié)合軟件glimmer 3.02進(jìn)行基因預(yù)測、KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路以及SEED蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋與直系同源簇(COG)分類。同時(shí)CMCC(B) 32220拼接全基因組序列與已發(fā)表的鉛黃腸球菌EC20(NCBI登錄號(hào)：NC_020995.1)、屎腸球菌ATCC 8459(NCBI登錄號(hào)：ASM33640v1)、雞腸球菌(NCBI登錄號(hào)：ASM1764196v1)和糞腸球菌(NCBI登錄號(hào)：ASM331981v1)代表性菌株基因組進(jìn)行配對(duì)基因組的平均核苷酸一致性(ANI)和同源蛋白匹配比對(duì)分析。參考文獻(xiàn)[4-5]，應(yīng)用CARD耐藥抗性數(shù)據(jù)庫在線工具(https://card.mcmaster.ca/)和 PathogenFinder軟件對(duì)CMCC(B) 32220基因組進(jìn)行細(xì)菌耐藥性和致病性預(yù)測分析。

2 結(jié)果

2.1菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定 CMCC(B) 32220在含糖瓊脂平板上菌落呈現(xiàn)透明、邊緣整齊、中間略隆起。革蘭染色為陽性球菌。Vitek全自動(dòng)生化鑒定儀鑒定待鑒定菌株CMCC(B) 32220和陽性對(duì)照菌株CMCC(B) 32240均為鉛黃腸球菌。

2.2MALDI-TOF MS鑒定 待鑒定菌株CMCC(B) 32220和陽性對(duì)照菌株CMCC(B) 32240經(jīng)MALDI-TOF MS分析呈現(xiàn)相似的質(zhì)譜特征峰，鑒定分析結(jié)果均為鉛黃腸球菌，系統(tǒng)分值分別為1.8和2.0，均大于1.7，表明分析結(jié)果可靠。

2.316SrRNA分析 將CMCC(B) 32220菌株16SrRNA測序結(jié)果進(jìn)行拼接，然后應(yīng)用DNAstar軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的2株代表性鉛黃腸球菌(NCBI登錄號(hào)為LC375241和AJ301832)的16SrRNA序列相似度分別為99.4%和98.9%,而與雞腸球菌(MN055932)的同源性也高達(dá)98.7%，與其他腸球菌菌株之間的16SrRNA序列相似度也超過94%。例如，與屎腸球菌、糞腸球菌和E.columbae的16SrRNA序列相似度分別為96.4%、96.9%和94.8%。將其與NCBI收錄其他16種腸球菌屬菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果顯示CMCC(B) 32220與另1株鉛黃腸球菌以及E.flavescens與雞腸球菌菌株共屬于一個(gè)亞分支。而與屎腸球菌、糞腸球菌的進(jìn)化稍有不同。見圖1。

圖1 鉛黃腸球菌CMCC(B) 32220與NCBI數(shù)據(jù)庫中不同腸球菌屬菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4菌株全基因組的特征 高通量測序分析顯示，CMCC(B) 32220菌株共獲得4 433 333個(gè)讀長片段，覆蓋其基因組大小416倍，拼裝后獲得32個(gè)contig片段，N50大小為254 987 bp。經(jīng)拼接比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)CMCC(B) 32220染色體全基因組序列全長為3 195 952 bp，預(yù)測共有3 054個(gè)基因,平均基因大小為905 bp編碼基因,占整個(gè)基因組序列的86.5%，其平均GC含量為43.8%。而非編碼基因間區(qū)域大小為430 669 bp，平均GC含量為36.8%，同時(shí)鑒定出50個(gè)tRNA與3個(gè)rRNA序列。

2.5基因組功能分析 COG數(shù)據(jù)庫注釋分析結(jié)果證實(shí)，CMCC(B)32220菌株基因組中具有COG功能注釋的蛋白質(zhì)有2 453個(gè)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)細(xì)菌氨基酸與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的蛋白質(zhì)數(shù)量高達(dá)366個(gè)，占14.9%，其次為負(fù)責(zé)細(xì)菌能力產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)為225個(gè)。此外，仍有282個(gè)(占11.5%)未知功能蛋白質(zhì)無法獲得功能注釋。

微生物基因組的KEGG功能分類包括涉及細(xì)胞內(nèi)、環(huán)境信息處理以及遺傳信息處理過程、代謝和有機(jī)系統(tǒng)。KEGG數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路，分析表明CMCC(B) 32220菌株中1 622個(gè)蛋白質(zhì)具有KEGG的ortholog。其中，代謝類基因數(shù)量最多，占KEGG注釋總基因數(shù)的54.8%；其次為環(huán)境信息處理過程基因數(shù)，占18.2%。

2.6比較基因組學(xué)分析 將CMCC(B)32220菌株基因組的預(yù)測蛋白質(zhì)進(jìn)行同源蛋白質(zhì)匹配分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相匹配的同源蛋白質(zhì)來源于95個(gè)不同細(xì)菌菌株，多數(shù)(97.2%)同源蛋白質(zhì)集中在腸球菌，但其中以鉛黃腸球菌特異性同源蛋白質(zhì)最高，為2 772個(gè)(93.7%)，進(jìn)一步分析證實(shí)其與鉛黃腸球菌EC30菌株同源性蛋白質(zhì)比例最高，為37.9%。

基于全基因組序列的ANI分析發(fā)現(xiàn)，CMCC(B)32220菌株與鉛黃腸球菌代表性EC20菌株的基因組的ANI數(shù)值為95.8%，但與屎腸球菌及糞腸球菌基因組的ANI數(shù)值僅分別為72.4%和71.3%，而與雞腸球菌基因組的ANI數(shù)值為75.3%。

2.7耐藥性和致病性預(yù)測分析 與CARD耐藥抗性數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)比較分析顯示，CMCC(B) 32220基因組僅含有vanRC和vanXYC2個(gè)耐藥基因，預(yù)測分析顯示與糖肽類耐藥抗性相關(guān)。

細(xì)菌的致病性預(yù)測分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMCC(B) 32220基因組含有5種對(duì)人致病性相關(guān)蛋白質(zhì)，并獲得匹配蛋白質(zhì)詳細(xì)的種屬來源以及相似度，見表1。

表1 鉛黃腸球菌CMCC(B) 32220菌株致病性預(yù)測分析

3 討論

微生物菌種保藏管理中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種，是保證微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用多種不同原理的微生物鑒定方法，證實(shí)CMCC(B) 32220為鉛黃腸球菌。傳統(tǒng)的生化反應(yīng)不容易將鉛黃腸球菌和屎腸球菌區(qū)分，而隨著技術(shù)的發(fā)展，Vitek 2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng)可通過高達(dá)30項(xiàng)生化反應(yīng)分析，自動(dòng)給出最終鑒定報(bào)告。但該分析系統(tǒng)要求細(xì)菌為新鮮培養(yǎng)物，耗時(shí)較長，約5 h[6]。盡管本研究應(yīng)用該系統(tǒng)將鉛黃腸球菌成功鑒定，但研究報(bào)道Vitek 2系統(tǒng)通常對(duì)部分細(xì)菌，例如沙門菌、部分腸球菌等，僅能鑒定到屬水平[6]。而MALDI-TOF MS是基于細(xì)菌菌體內(nèi)蛋白質(zhì)特征性的模式峰進(jìn)行菌株的鑒定。從準(zhǔn)備菌株到鑒定結(jié)束, 不到5 min即可獲得結(jié)果，鑒定時(shí)效最強(qiáng)[5]。近期研究人員應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)直接從300份清潔尿沉渣樣本中，成功鑒定出包括2株糞腸球菌、15株大腸埃希菌和1株產(chǎn)氣腸桿菌等25種細(xì)菌，與細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果100%符合[7]。

由于16SrRNA基因序列在細(xì)菌基因組中的保守性、存在的普遍性與穩(wěn)定性，被廣泛用于細(xì)菌微生物分類鑒定和檢測[6,8]。在腸球菌屬中，部分群組內(nèi)的菌種16SrRNA基因序列的同源性非常高，本研究發(fā)現(xiàn)CMCC(B) 32220與其他腸球菌的16SrRNA序列可高達(dá)98.7%，建議腸球菌屬16SrRNA基因序列分析僅能達(dá)到屬的水平，用于種的鑒定時(shí)需要結(jié)合其他分析結(jié)果。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近10年測序成本顯著降低，應(yīng)用全基因組序列進(jìn)行微生物鑒定與分類比單個(gè)特征基因序列分析具有更高準(zhǔn)確性。大量研究證實(shí)當(dāng)2株細(xì)菌之間的ANI值≥95%，通常認(rèn)為這2株為同種細(xì)菌[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CMCC(B)32220與NCBI收錄鉛黃腸球菌代表性EC20菌株基因組的ANI值為95.8%，而與其他腸球菌基因組ANI值均低于80%，這些結(jié)果也進(jìn)一步支持基于全基因序列的ANI分析能將細(xì)菌鑒定到種的水平[9]。同時(shí)，同源蛋白質(zhì)比對(duì)分析結(jié)果顯示，基因組中約93.7%的同源蛋白質(zhì)均集中在鉛黃腸球菌，這些結(jié)果也為全基因序列的ANI分析結(jié)果提供了蛋白質(zhì)水平的數(shù)據(jù)支持。

此外，本研究通過分析鉛黃腸球菌的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)其基因組中存在5種潛在致病相關(guān)蛋白，但這些預(yù)測蛋白是否能表達(dá)，表達(dá)后是否會(huì)對(duì)人產(chǎn)生致病性等均有待研究。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)鉛黃腸球菌基因組不同于屎腸球菌或糞腸球菌[10]，僅含有2個(gè)耐藥基因，這也部分解釋了在臨床分離的鉛黃腸球菌耐藥菌株遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于屎腸球菌和糞腸球菌等腸球菌的原因。

綜上，本研究應(yīng)用多種不同原理方法對(duì)CMCC(B)32220系統(tǒng)鑒定和分析，并以此了解其全基因組的基本特征、基因功能、耐藥性及致病性，不僅為細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株提供了更多背景數(shù)據(jù)，提高了其質(zhì)量控制手段，同時(shí)為后續(xù)相關(guān)分析提供范例。

致謝:感謝上海人類基因組研究中心鄭華軍和朱永強(qiáng)給予的幫助。