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    諾如病毒RNA檢測(cè)的性能驗(yàn)證與臨床應(yīng)用*

    2022-03-30 10:40:24汪自然陳雨伊潔吳潔中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100730
    臨床檢驗(yàn)雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:符合率核酸陽(yáng)性率

    汪自然,陳雨,伊潔,吳潔(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100730)

    諾如病毒(norovirus),又叫諾瓦克病毒,是一種無(wú)包膜、單鏈正向的RNA病毒[1]。人類諾如病毒是世界范圍內(nèi)急性腸胃炎的主要病原體,每年約6.99億人感染,約占全球所有腸胃炎病例的1/5[2]。諾如病毒可以引起腹瀉、嘔吐、惡心、低燒和腹部絞痛等癥狀,在新生兒、老年人和免疫功能低下的人群中感染率較高。人與人之間的病毒傳播主要通過(guò)污染的水和食物,人群對(duì)諾如病毒普遍易感,感染后不能獲得長(zhǎng)久的免疫力。目前諾如病毒的主要檢測(cè)方法包括電鏡檢測(cè)法、免疫檢測(cè)法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等[3]。其中,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因其較高的靈敏度和特異性,是當(dāng)下臨床診斷諾如病毒感染的可靠方法。本研究對(duì)諾如病毒RNA檢測(cè)試劑盒的各項(xiàng)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)并評(píng)估諾如病毒的臨床感染現(xiàn)況。

    1 材料與方法

    1.1儀器與試劑 ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),核酸提取儀、磁珠法核酸提取純化試劑(上海伯杰公司),諾如病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ崩实鹿?;逆轉(zhuǎn)錄酶(江蘇康為世紀(jì)公司),2×Taq預(yù)混PCR反應(yīng)液(北京康潤(rùn)公司)。

    1.2方法

    1.2.1核酸提取 按照提取試劑說(shuō)明書(shū)操作,主要提取步驟包括:裂解、吸磁珠、漂洗、洗脫、棄磁珠。

    1.2.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序 提取得到的RNA首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板,分別使用GⅠ或者GⅡ引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下:GⅠ-F:5′-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3′,GⅠ-R:5′-CCAACCCARCCATTRTACA-3′; GⅡ-F:5′-CARG

    ARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3′,GⅡ-R:5′-CCR

    CCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′,由北京睿博興科公司合成。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃ 2 min;變性94 ℃ 30 s,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共32個(gè)循環(huán);終延伸72 ℃ 7 min后轉(zhuǎn)入4 ℃保存。PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)條帶的初步判定為陽(yáng)性。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京睿博興科公司測(cè)序,儀器為ABI 3730XL測(cè)序儀,測(cè)序引物使用默認(rèn)參數(shù),測(cè)序試劑為BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(美國(guó)Thermo Fisher公司)。將測(cè)序后雙向拼接得到的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì),與數(shù)據(jù)庫(kù)中諾如病毒的基因序列比對(duì)一致的認(rèn)為該樣本諾如病毒RNA檢測(cè)陽(yáng)性。對(duì)于無(wú)擴(kuò)增條帶的認(rèn)為該樣本諾如病毒RNA檢測(cè)陰性。

    1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按諾如病毒RNA檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?說(shuō)明書(shū)操作,反應(yīng)條件為:42 ℃ 30 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min(采集熒光信號(hào)),共40個(gè)循環(huán)。選擇FAM檢測(cè)通道檢測(cè)諾如病毒RNA;選擇VIC通道檢測(cè)內(nèi)標(biāo)。在質(zhì)控品及內(nèi)標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有效的前提下,如果FAM通道擴(kuò)增曲線呈S型且循環(huán)閾值(Ct)≤36.00,則結(jié)果判定為陽(yáng)性。

    1.3性能驗(yàn)證方案及指標(biāo) 性能驗(yàn)證主要按照中 國(guó) 合 格 評(píng) 定 國(guó) 家 認(rèn) 可 委 員 會(huì) (China National Accreditation Service, CNAS)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》(CNAS-CL02-A009)[4]文件執(zhí)行。

    1.3.1重復(fù)性 選取含1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品各1例,每一種標(biāo)本重復(fù)測(cè)定5次,測(cè)定4 d,每份樣本共測(cè)定20次,計(jì)算每種標(biāo)本的符合率及Ct值的批內(nèi)和批間精密度。性能驗(yàn)證通過(guò)標(biāo)準(zhǔn):陰性、陽(yáng)性符合率均應(yīng)≥95%,批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(CV)應(yīng)符合說(shuō)明書(shū)的聲明范圍(≤5%)。選取含1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品各1例,由不同的操作人員使用同一批號(hào)試劑在同一臺(tái)儀器上完成檢測(cè),操作人員檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果陰性、陽(yáng)性結(jié)果符合率均應(yīng)為100%。

    1.3.2符合率 20例疑似諾如病毒感染的患者糞便樣本隨機(jī)排列,以PCR擴(kuò)增及測(cè)序法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),使用諾如病毒RNA檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行平行檢測(cè),計(jì)算符合率。性能驗(yàn)證通過(guò)標(biāo)準(zhǔn):陰性、陽(yáng)性檢出率均應(yīng)≥95%。

    1.3.3檢測(cè)下限 選取諾如病毒核酸1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL質(zhì)控品,每一種質(zhì)控品重復(fù)檢測(cè)20次,計(jì)算符合率。性能驗(yàn)證通過(guò)標(biāo)準(zhǔn):1×105copies/mL和1×104copies/mL濃度的RNA檢出率均應(yīng)≥90%。

    1.3.4抗干擾能力 在經(jīng)PCR及測(cè)序比對(duì)鑒定為諾如病毒RNA陽(yáng)性的糞便樣本中分別加入以下物質(zhì):含血紅蛋白(100 g/L)的血液、 阿莫西林(5 μg/mL)、對(duì)乙酰氨基酚(0.15 μg/mL)、布地奈德混懸液(0.5 mg/mL),將加入干擾物質(zhì)的標(biāo)本全部提取核酸,檢測(cè)加入干擾物質(zhì)和未加入干擾物質(zhì)的標(biāo)本,統(tǒng)計(jì)其Ct值。性能驗(yàn)證通過(guò)標(biāo)準(zhǔn):未加入干擾物質(zhì)樣本的Ct值應(yīng)在加入血或藥物樣本的Ct值的95%置信區(qū)間內(nèi),否則為抗干擾能力差。

    1.3.5交叉反應(yīng) 分別將檢驗(yàn)科保存的大腸埃希菌菌液(1.0×106CFU/mL)、腸炎沙門菌菌液(1.0×106CFU/mL)、宋內(nèi)志賀菌菌液(1.0×106CFU/mL)和艱難梭菌菌液(1.0×106CFU/mL)的標(biāo)本分別加入諾如病毒陰性標(biāo)本中,使用諾如病毒核酸試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。性能驗(yàn)證通過(guò)標(biāo)準(zhǔn):不應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線或Ct值,否則為特異性差。

    1.4臨床樣本檢測(cè) 收集北京協(xié)和醫(yī)院2020年12月至2021年7月各科室疑似諾如病毒感染患者的糞便樣本共4 179例,其中男性1 883例,年齡中位數(shù)為34歲;女性2 296例,年齡中位數(shù)為34歲。使用諾如病毒核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算陽(yáng)性率。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件分析。計(jì)算95%置信區(qū)間及陰性、陽(yáng)性檢出率,各組間陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1性能驗(yàn)證結(jié)果

    2.1.1重復(fù)性驗(yàn)證 1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品使用試劑檢測(cè),符合率為100%,符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。1×104copies/mL陽(yáng)性質(zhì)控品的批內(nèi)CV為0.40%,批間CV為2.77%。1×105copies/mL陽(yáng)性質(zhì)控品的批內(nèi)CV為0.69%,批間CV為2.68%。CV均小于5%,符合說(shuō)明書(shū)要求。不同操作人員檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的符合率均為100%。

    2.1.2符合率驗(yàn)證 20例糞便樣本提取核酸后,以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,分別使用GⅠ和GⅡ的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明20例樣本中3例擴(kuò)增有條帶,且均為GⅡ型(圖1)。對(duì)有擴(kuò)增的條帶進(jìn)行DNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),結(jié)果與諾如病毒序列高度一致,表明相應(yīng)樣本確證為諾如病毒檢測(cè)陽(yáng)性。20例樣本測(cè)序結(jié)果表明,3例為陽(yáng)性,17例為陰性。部分陽(yáng)性樣本測(cè)序峰圖見(jiàn)圖2。對(duì)20例臨床樣本使用試劑盒檢測(cè),3例檢測(cè)為陽(yáng)性,17例檢測(cè)為陰性,與測(cè)序結(jié)果一致,符合率為100%,符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn),見(jiàn)表1。

    注:A,GⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果;B,GⅡ基因擴(kuò)增結(jié)果。M, DL 2 000 DNA marker; 1~20,20例臨床樣本。

    圖2 諾如病毒核酸陽(yáng)性樣本測(cè)序部分結(jié)果

    表1 20例臨床樣本PCR-熒光探針?lè)ㄅc測(cè)序法比對(duì)結(jié)果

    2.1.3檢測(cè)下限驗(yàn)證 1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL諾如病毒質(zhì)控品使用試劑盒重復(fù)檢測(cè)20次,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,檢測(cè)下限可以達(dá)到1×103copies/mL,而試劑標(biāo)明的檢測(cè)下限為1×104copies/mL,檢測(cè)下限符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

    2.1.4抗干擾能力驗(yàn)證 在確證為諾如病毒RNA陽(yáng)性的樣本加入各干擾物質(zhì)后提取核酸,使用試劑檢測(cè),所得Ct值的95%置信區(qū)間為18.08~19.76,而未加干擾物質(zhì)的對(duì)照樣本Ct值為19.19,在95%置信區(qū)間內(nèi),抗干擾能力符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表2。

    2.1.5交叉反應(yīng)驗(yàn)證 在確證為諾如病毒RNA陰性的樣本中分別加入大腸埃希菌、腸炎沙門菌、宋內(nèi)志賀菌或艱難梭菌菌液后提取核酸,使用試劑檢測(cè),均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線或Ct值,交叉反應(yīng)符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表2。

    表2 諾如病毒核酸檢測(cè)試劑抗干擾能力和交叉反應(yīng)驗(yàn)證

    2.2臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 4 179份臨床樣本中陽(yáng)性樣本517例,總陽(yáng)性率為12.37%。其中,男性患者(13.91%,262/1 883)陽(yáng)性率高于女性患者(11.11%,255/2 296),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.523,P=0.006)。不同月份陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=140.6,P<0.001),2021年3~4月陽(yáng)性率處于較高水平,2021年6~7月陽(yáng)性率較低,見(jiàn)圖3A。從年齡分布來(lái)看,21~40歲的患者的陽(yáng)性率高于其他年齡組(χ2=68.83,P<0.001),見(jiàn)圖3B。從科室分布分析,門急診及病房均有陽(yáng)性樣本檢出,發(fā)熱門診陽(yáng)性樣本檢出量最高,急診兒科陽(yáng)性率較高,見(jiàn)圖3C。

    注:A,不同月份諾如病毒陽(yáng)性率分布;B,不同年齡組諾如病毒陽(yáng)性率分布;C,不同臨床科室陽(yáng)性率分布。

    3 討論

    近年來(lái),由諾如病毒引起的暴發(fā)感染得到了越來(lái)越多的關(guān)注。諾如病毒具有高度傳染性,即使是少量的病毒也能致病,被感染的人會(huì)釋放大量的病毒顆粒污染周圍環(huán)境[5-6]。對(duì)于兒童、老人和免疫功能缺陷的人群,一旦感染諾如病毒,可能導(dǎo)致脫水、休克甚至死亡[7]。因此,早期識(shí)別諾如病毒的感染者、及時(shí)隔離感染者和消毒周圍環(huán)境是控制諾如病毒感染暴發(fā)的重要環(huán)節(jié)。目前針對(duì)諾如病毒有多種檢測(cè)方法,而熒光定量PCR方法準(zhǔn)確高效且檢測(cè)通量較大,可以滿足臨床的檢驗(yàn)需求。

    依據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)IS015189《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力專用要求》、美國(guó)病理家學(xué)會(huì)(College of American Pathologists,CAP)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等相關(guān)文件要求,特定的試劑或者檢測(cè)系統(tǒng)在應(yīng)用于臨床檢測(cè)之前,需要對(duì)其進(jìn)行性能驗(yàn)證以確保其能符合臨床需求[8-10]。本研究從重復(fù)性、符合率、檢測(cè)下限、抗干擾能力和交叉反應(yīng)5個(gè)方面對(duì)諾如病毒核酸檢測(cè)試劑進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。在重復(fù)性研究中,選取2個(gè)濃度的諾如病毒核酸質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品,每種樣本每天檢測(cè)5次,檢測(cè)4 d,共20次檢測(cè),符合率為100%,批內(nèi)和批間CV均<5%,說(shuō)明試劑較為穩(wěn)定,重復(fù)性好。不同操作人員檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果均一致,說(shuō)明人員之間重復(fù)性較好。在準(zhǔn)確性研究中,收集發(fā)熱門診20例疑似諾如病毒感染的患者糞便樣本,使用核酸提取儀提取核酸后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。諾如病毒GⅠ和GⅡ是引起人類胃腸炎的2個(gè)主要基因型[11],本研究以cDNA為模板,分別使用相應(yīng)的引物擴(kuò)增后對(duì)陽(yáng)性條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì),結(jié)果表明20例臨床樣本中3例為諾如病毒核酸陽(yáng)性,且基因型均為GⅡ。這與國(guó)內(nèi)報(bào)道GⅡ型為主要流行型的其他研究[11-12]相一致,后期可以收集更多的樣本進(jìn)行基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析,以監(jiān)測(cè)諾如病毒在本地區(qū)的流行型別及傳播規(guī)律。以測(cè)序比對(duì)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),使用諾如病毒檢測(cè)試劑盒對(duì)20例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),符合率為100%,表明試劑盒檢測(cè)較為可靠,準(zhǔn)確性高。試劑盒標(biāo)明的檢測(cè)下限為1×104copies/mL,選擇高于、等于和低于該下限的3個(gè)濃度的質(zhì)控品進(jìn)行驗(yàn)證,每種樣本重復(fù)20次,檢出率均為100%,說(shuō)明檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的敏感性,檢測(cè)下限符合性能驗(yàn)證要求。在抗干擾能力檢測(cè)中,在諾如病毒確證陽(yáng)性的糞便樣本中混入血液和常見(jiàn)的抗病毒藥物作為干擾物質(zhì),分別提取核酸后使用試劑盒檢測(cè),結(jié)果顯示未加入干擾物質(zhì)的Ct值在加入血或藥物的Ct值的95%置信區(qū)間內(nèi),表明該試劑盒抗干擾能力較好,血液和常見(jiàn)的藥物對(duì)其檢測(cè)結(jié)果影響較小。目前有較多的病原體均可以引起發(fā)熱、腹瀉等癥狀,為了避免其他病原體造成的假陽(yáng)性結(jié)果,在諾如病毒陰性的樣本中加入常見(jiàn)腹瀉相關(guān)的細(xì)菌菌液后提取核酸檢測(cè),結(jié)果均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線或者Ct值,說(shuō)明特異性較高。

    近年來(lái),在北京市各區(qū)均存在諾如病毒引起的散發(fā)或暴發(fā)疫情。本研究中,諾如病毒的總陽(yáng)性率為12.37%,與既往北京市哨點(diǎn)醫(yī)院監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[13]相類似。本研究結(jié)果提示在3~4月陽(yáng)性率處于較高水平,這可能與季節(jié)更替導(dǎo)致人群免疫力下降有關(guān)。同時(shí),干冷的天氣環(huán)境也有利于諾如病毒的生長(zhǎng)繁殖和傳播[14]。既往研究大多關(guān)注嬰幼兒人群中諾如病毒的感染情況[15],但本研究中21~40歲年齡組相較于兒童患者具有較高的感染率,這可能與我院為綜合醫(yī)院,收治兒童患者較少有關(guān)。因此,在后續(xù)的監(jiān)測(cè)中,青壯年群體的諾如病毒的感染情況也需要關(guān)注。發(fā)熱門診的陽(yáng)性病例數(shù)較多,一方面說(shuō)明諾如病毒感染的患者往往有發(fā)熱等癥狀,同時(shí)也提示在發(fā)熱門診需要做好環(huán)境的消毒工作,以免疫情的進(jìn)一步擴(kuò)散。急診兒科陽(yáng)性率較高,表明兒童群體免疫力相對(duì)弱,對(duì)諾如病毒易感性強(qiáng),需要密切監(jiān)測(cè)以防止群體疫情的暴發(fā)。

    本研究也存在一定的局限性:在交叉反應(yīng)驗(yàn)證中,宜選擇與檢測(cè)對(duì)象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸進(jìn)行驗(yàn)證,而在本研究的交叉反應(yīng)驗(yàn)證中限于實(shí)驗(yàn)條件,僅選擇了腹瀉相關(guān)的常見(jiàn)細(xì)菌,并未驗(yàn)證輪狀病毒、腺病毒、札如病毒、星狀病毒等胃腸道相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性。

    綜上,該檢測(cè)試劑穩(wěn)定、重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠、敏感性高,抗干擾能力和特異性較高,符合性能驗(yàn)證的要求,可為臨床諾如病毒感染診斷提供可靠的病原學(xué)依據(jù)。該檢測(cè)系統(tǒng)連續(xù)8個(gè)月的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,諾如病毒在人群中具有較高的感染率,尤其是在季節(jié)交替時(shí)和21~40歲群體中,需要持續(xù)的關(guān)注和監(jiān)測(cè)。

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