電針結(jié)合鱉甲煎丸對H22肝癌小鼠腫瘤抑制作用及機制研究

黃爭春 常欣峰

摘 要：目的：觀察電針足三里、三陰交結(jié)合鱉甲煎丸對H22肝癌小鼠腫瘤抑制作用并探討其作用機制。方法：建立H22肝癌小鼠模型，將100只小鼠隨機分為正常組、模型組、環(huán)磷酰胺組、電針組、鱉甲煎丸組、針藥聯(lián)合組，給予相應刺激14 d后，取腫瘤組織稱重，計算抑瘤率;采用Western blot方法檢測腫瘤組織VEGF、Delta-4、NICD蛋白表達情況。結(jié)果：針藥聯(lián)合能夠抑制H22小鼠腫瘤生長;Western blot結(jié)果顯示針藥聯(lián)合能明顯降低VEGF、Delta-4和NICD蛋白表達。結(jié)論：針藥聯(lián)合可通過阻斷VEGF/Dll4-Notch信號通路，抑制腫瘤血管生成，從而發(fā)揮抑瘤作用。

關鍵詞：針藥聯(lián)合;H22肝癌小鼠;VEGF/Dll4-Notch信號通路

原發(fā)性肝癌在我國發(fā)病率高、存活率低，目前缺少切實有效的治療方法，是一種嚴重危害人類健康的惡性腫瘤。中醫(yī)藥以其整體調(diào)整的優(yōu)勢對該病的治療具有不可忽視的重要意義。課題組前期研究證實鱉甲煎丸具有活血、補益、散結(jié)之功，可以較好的抑制肝癌生長，防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。而足三里穴為足陽明胃經(jīng)合穴，針刺足三里穴能糾正神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)失調(diào)，對預防運動性疲勞和提高機體免疫力有非常顯著的療效[1，2]。三陰交穴始載于《內(nèi)經(jīng)》，為三焦之氣所生處，是補益元氣、調(diào)和氣血，補虛強壯之要穴，現(xiàn)代醫(yī)學證明，電針刺激三陰交可提高細胞免疫和體液免疫功能[3，4]。基于對原發(fā)性肝癌病因病機的認識，我們將電針足三里、三陰交與口服鱉甲煎丸結(jié)合起來，對H22肝癌小鼠進行干預治療，觀察療效并探討其作用機制。

一、材料

1.動物及細胞株

清潔級雄性昆明小鼠100只，6～8周齡，質(zhì)量18～22g，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（贛）2018-0004。H22細胞株，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥研究所購進，液氮中保存。

2.藥品和試劑

環(huán)磷酰胺，白色粉狀針劑，0.2g/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn);VEGF抗體（Santa Cruz，sc-152）、Delta-4抗體（Santa Cruz，sc-18640）;NICD抗體（Cell Signaling，#4147）;BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司（貨號：A：Lot#J9122;B：Lot#J8830）。

3.儀器

ME104型電子天平（進口），多功能酶標儀（美國Thermo公司），垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），AI600UV型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

二、方法

1.鱉甲煎丸加減方制備

本方由鱉甲、大黃、黃芩、丹參、柴胡等藥物組成。以常規(guī)方法煎煮、過濾、沉淀后，參照《藥理實驗方法學》（徐叔云主編），按照小鼠日攝取量為同重量人體用藥量8倍計算，濃縮制成含生藥1.24g/mL的溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.H22肝癌小鼠模型的建立

無菌條件下抽取接種H22瘤株 7天的小鼠腹水，生理鹽水稀釋、離心、重懸，腫瘤活細胞比率>95%，調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL。75%酒精消毒小鼠右側(cè)腋窩，0.2 mL/只接種于小鼠右腋部皮下。

3.分組及治療

接種后次日，將100只小鼠隨機分為5組，即模型組、陽性藥組（環(huán)磷酰胺）、電針組、中藥組、針藥聯(lián)合組，每組20只。陽性藥物組于小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺;電針組給予2/100Hz交替頻率刺激雙側(cè)三陰交、足三里穴，每次30分鐘（小鼠穴位定位參照李忠仁《實驗針灸學》）;中藥組給予鱉甲煎丸水煎劑灌胃，0.2mL/10g;針藥聯(lián)合組給予電針和鱉甲煎丸共同治療;模型組以等體積生理鹽水灌胃。以上處理自造模第二日起，每日1次，連續(xù)治療14日，于第15日，稱重后，處死小鼠，取材檢測。

4.瘤重及抑瘤率測定

治療期間觀察小鼠一般狀態(tài)，并比較各組小鼠腫塊大小。于末次給藥24 h后，稱體重，取瘤塊稱重，計算抑瘤率;

5.Western blot方法檢測

腫瘤組織中VEGF/Dll4-Notch信號通路相應蛋白表達取腫瘤組織25mg，剪碎于1.5 mL EP管中，加入蛋白裂解液研磨，離心5 min，抽取上清液，即為組織總蛋白，用BCA蛋白檢測法進行蛋白定量。取50 μg蛋白，調(diào)整體積為24 μl，電泳轉(zhuǎn)膜后，脫脂牛奶封閉，一抗4℃孵育過夜;二抗室溫孵育l h，化學發(fā)光成像系統(tǒng)照相，體積法測定各條帶的光密度值。同樣方法測定內(nèi)參的光密度值。各組取4只小鼠的樣本，重復試驗3次，每次以模型組條帶相對光密度值為1進行數(shù)據(jù)標準化，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

6.統(tǒng)計學處理

采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間測定指標比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

1.針藥聯(lián)合對H22肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用

治療期間各組小鼠一般狀況良好，無腹瀉、活動遲緩等不良反應。針藥組與模型組比較，小鼠瘤重明顯降低（P<0.01）;與陽性藥物組比較，小鼠瘤重無明顯差異（P>0.05）。電針組、中藥組及針藥聯(lián)合組抑瘤率分別為：28.6%、30.3%、42.5%，提示電針和鱉甲煎丸均可抑制腫瘤生長，針藥聯(lián)合效果更好（見表1）。

針藥聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中VEGF、Delta-4和NICD蛋白表達與模型組比較均顯著降低，有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。提示針藥聯(lián)合可通過降低VEGF、Delta-4和NICD蛋白表達，阻斷VEGF/Dll4-Notch信號通路，抑制腫瘤新生血管的形成，進而抑制腫瘤生長。（見表2）

四、討論

腫瘤血管在生長過程中受到體內(nèi)多種因子的調(diào)控，其中VEGF是目前所知作用最強的促血管生長因子，對血管生成起到重要的調(diào)節(jié)作用，在幾乎所有的實體瘤中，都伴有VEGF的上調(diào)。Dll4是惟一特異存在于內(nèi)皮細胞的Notch配體，Dll4-Notch信號通路具有調(diào)控腫瘤血管發(fā)生的功能。Hainaud等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Notch4/Dll4在肝癌的肝竇內(nèi)皮細胞中高表達，并發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Ephrin B2水平隨腫瘤發(fā)展而上升，表明Dll4-Notch信號通路能促使腫瘤中血管靜脈向動脈分化。Jakobsson等[6]在發(fā)育的血管和尖端細胞中，都發(fā)現(xiàn)有Dll4的高表達。VEGF與Dll4-Notch信號通路成正反饋關系，即在腫瘤血管的生成發(fā)育上，VEGF可以激活Dll4-Notch信號通路[7]。阻斷荷瘤小鼠模型中VEGF，會促使Dll4表達下降，而使用VEGF刺激血管內(nèi)皮細胞，則可使Dll4表達上調(diào)。

鱉甲煎丸來源于《金匱要略》，目前該方被廣泛應用于臨床，在治療肝炎、肝硬化、腫瘤等疾病，均取得了良好的療效。電針我們選取的是足三里、三陰交二穴。前期研究工作表明，電針刺激足三里、三陰交可以增強機體免疫力而抑制腫瘤生長。鱉甲煎丸亦具有寒熱并用、攻補兼施、行氣化瘀、軟堅散結(jié)之功效，因此我們設想將針藥聯(lián)合起來治療肝癌，觀察療效并探討其作用機制。結(jié)果表明：針藥聯(lián)合可通過阻斷VEGF/Dll4-Notch信號通路從而抑制H22肝癌小鼠腫瘤生長。

綜上所述，針藥聯(lián)合可抑制H22肝癌小鼠腫瘤生長并誘導腫瘤細胞凋亡。其作用機制可能與阻斷VEGF/Dll4-Notch信號通路，抑制腫瘤血管生成有關。本研究結(jié)果為臨床進一步發(fā)揮中醫(yī)整體特色治療肝癌提供了實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1] 不同深度針刺足三里穴對健康大鼠外周血細胞形態(tài)數(shù)量及淋巴細胞增殖能力和胸腺指數(shù)的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（29）：5687-5690.

[2] 針刺“足三里”穴對脾虛證模型大鼠腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細胞亞群的影響[J].中國組織工程研究， 2018，22（4）576-581.

[3] 溫針灸對胃癌手術后化療患者NK細胞數(shù)量及其生物學活性的影響[J].國際免疫學雜志， 2021，44（1）： 1-6.

[4] 不同穴組電針預處理減輕肝臟缺血再灌注損傷的效應研究[J].湖南師范大學學報（醫(yī)學版），2020，17（6）：7-10.

[5] Hainaud P， Contreres JO， Villemain A， et al. The role of the vascular endothelial growth factor Delta-like 4 ligand/Notch4-Ephrin B2 cascade in tumor vessel remodeling and endothelial cell functions[J]. Cancer Res， 2006， 66（17）： 8501-8510.

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