聚乙烯塑料的微生物降解

劉 強 ，盧亞紅，吳 慧，馬瑜浩 ，張宇鵬，孫文瀟，張 宏*

（1.西北民族大學化工學院，蘭州 730030；2.環(huán)境友好復合材料國家民委重點實驗室，蘭州 730030）

0 前言

PE塑料發(fā)展至今因其具有生產(chǎn)成本低、防水和堅固耐用等特點，已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)（如塑料地膜、澆灌水帶）、生活用品（如塑料吸管、包裝袋）、建筑領域（如管材）的生產(chǎn)制造中，成為我們?nèi)粘Ｉ钪袩o法代替的材料［1］。據(jù)統(tǒng)計每年全球塑料的生產(chǎn)量都在不斷增長，截止2018年總產(chǎn)量達到7.8×109t，中國塑料的生產(chǎn)量在全球塑料產(chǎn)量中占比最大，年產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的25%［2］，但是據(jù)生態(tài)環(huán)境部統(tǒng)計，2019年我國廢棄塑料的回收率不到10%。這些被人們隨意丟棄在自然環(huán)境中的塑料因其高疏水性和化學惰性很難在環(huán)境中自然降解，所以導致產(chǎn)生世界性的“白色污染”問題，對生態(tài)環(huán)境造成了巨大的影響。目前全球?qū)τ谶@些極難被自然降解的PE塑料主要采用比較原始的處理方式，如填埋、焚燒［3］、堆肥等。但這些方式會造成生態(tài)環(huán)境的二次污染，填埋的塑料隨著時間的推移會使其變成危害性更大的微塑料［4］，可能會通過食物被人體吸收，其對于人體的具體危害情況還未見報道。目前的研究認為，生物降解可將廢舊PE同化最后產(chǎn)物只有CO2和H2O，所以生物降解作為環(huán)境友好的處理方法可很好地解決廢舊PE的污染治理難題。

目前，廣泛應用于人們?nèi)粘Ｉ钪械乃芰掀贩N主要包括聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、PE、聚氯乙烯（PVC）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）和聚氨酯（PU）等。近年來對這些塑料的微生物降解研究已經(jīng)初見成果，其中PET、PS和PU的微生物代謝途徑已經(jīng)被研究者發(fā)現(xiàn)［5-6］。PVC和PP由于官能團和雙鍵的存在增加了降解酶的作用位點，所以與PE相比有利于微生物的降解；PE由于具有高疏水性、高分子量和結(jié)晶度導致在微生物降解中難于其他各種塑料，所以PE的微生物降解成為本文的關注點。

自20世紀70年代以來，大量報道證實，在自然環(huán)境中存在以PE為唯一碳源生長的菌株，這為PE廢物處理提供了新的思路［7］?，F(xiàn)在全球的生物學家意在尋找一種高效的PE降解菌。在報道中，大多數(shù)研究人員采用比較傳統(tǒng)的微生物學方法對PE降解菌進行分離，最后通過對降解前后聚合物物理化學性質(zhì)的變化來評價各降解菌的降解效率，這些物理化學性質(zhì)的變化包括7個方面：表面官能團、親水性/疏水性、結(jié)晶度、分子量、表面形貌、力學性能和質(zhì)量損失［8］。各研究人員雖然在研究流程上大體相同，但是在降解能力測試中由于所用PE類型的不同和表征方法的誤用等因素，造成無法對各類型降解菌的降解效率進行對比，讓PE降解研究中的工作者不能很好地理解“高效”這一概念；甚至會導致篩選出假陽性降解表型的菌株，阻礙了PE生物降解研究的發(fā)展。所以Montazer等［9］在2019年提出了一種“生物降解實驗的建議流程”，以闡明實現(xiàn)PE生物降解所需的參數(shù)并簡化PE微生物降解實驗結(jié)果的比較。本文將從參與降解的微生物和表征方法對近期的研究進展進行總結(jié)，對上述的“生物降解實驗的建議流程”進行改進和補充，為進一步研究PE的微生物降解特別是降解菌的高效性定義上提供理論參考。

1 參與PE降解的微生物

大量文獻已經(jīng)證實許多研究者從自然環(huán)境（土壤、海洋、垃圾處理站等）和特定培養(yǎng)基中篩選出了能夠降解PE的微生物，還有一些菌株在印度粉蛾和蠟蟲的腸道中被發(fā)現(xiàn)［7］。研究者們利用不同的技術手段對降解前后的聚合物進行表征，證實了自己實驗中篩選的菌株對聚合物進行了不同程度的降解。據(jù)統(tǒng)計目前篩選出的微生物中細菌種類最多；放線菌最少。眾所周知，土壤中的菌落組成中放線菌的數(shù)量僅次于細菌，但是報道中少見放線菌菌株從土壤中被篩選出來，這與統(tǒng)計結(jié)果產(chǎn)生了矛盾，作者認為造成這種矛盾的原因是由于實驗條件和培養(yǎng)基選擇上的限制，所以放線菌的篩選應該引起研究者的注意。相信在以后的研究中，隨著篩選方案的優(yōu)化和新技術的應用，越來越多且降解能力極強的菌株會被報道出來。

1.1 參與PE塑料微生物降解的細菌菌株

超過20個細菌屬已被證明能降解不同類型的PE。這些菌包括各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬等，以及紅球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌等［10-13］。這些細菌菌株中的大多數(shù)都具有破壞PE表面和（或）在PE上形成生物膜的能力。表1總結(jié)了近年來被發(fā)現(xiàn)的與PE生物降解相關的細菌菌株。報道中，大多數(shù)研究者使用低密度聚乙烯（PE-LD）和高密度聚乙烯（PE-HD）作為降解菌的唯一碳源。2016年，Kowalczyk等［14］從土壤中分離到一株新的木糖氧化芽孢桿菌PE-1，用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和掃描電子顯微鏡（SEM）對降解前后的樣品進行了分析，結(jié)果表明PE-HD的化學結(jié)構發(fā)生了變化。由于木糖氧化桿菌PE-1對PE-HD薄膜的降解作用，最后還檢測到約9%的質(zhì)量損失。2018年，Ndahebwa Muhonja等［15］從丹多拉垃圾場篩選出一些PE降解細菌，對細菌的16S rDNA和18S rDNA序列分析表明，屬于真假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、纖維素微生物屬、賴氨酸桿菌屬，在以PE-LD為唯一碳源生長16周后通過FTIR分析顯示，由于碳氫化合物降解，出現(xiàn)了新的官能團。還通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度以尋找降解實驗的最佳條件。2020年，Maroof等［16］從巴基斯坦的一處垃圾處理廠篩選出6株具有潛在生物降解活性的菌株，用無添加劑PE-LD薄膜作為唯一碳源培養(yǎng)90 d后，利用SEM觀察到PE-LD薄膜有輕微的表面破裂，傅里葉變換紅外光譜顯示形成典型的羰基峰，通過羰基指數(shù)測定，孵育后羰基峰明顯減少。X射線衍射分析顯示結(jié)晶度百分比增加，還在細菌分離物中鑒定出不同的負責降解PE-LD的基因。

表1 參與PE塑料生物降解的細菌菌株Tab.1 Bacterial strains involved in biodegradation of polyethylene plastics

1.2 參與PE塑料微生物降解的真菌菌株

除了細菌，一些真菌屬，包括曲霉屬、枝孢霉屬、鐮孢屬、青霉屬、黃孢原毛平革菌屬也被報道可降解PE［24-25］。一般來說，真菌被認為比細菌更能有效地降解PE，因為真菌在生物原位修復過程中會產(chǎn)生疏水蛋白，其雙層結(jié)構能在疏水/親水界面形成兩親性膜（Amphipathicfilm），作為生物表面活性劑提高了底物的接觸面積，從而大大提高降解效率［26］。表2總結(jié)了近年來能夠降解PE的真菌菌株。2014年，Merina等［27］從城市垃圾處理廠的土壤中以PE-LD粉末為唯一碳源篩選出5種真菌，其中4種被鑒定為曲霉菌屬，剩下的為鐮孢菌屬；在33.3℃下培養(yǎng)60 d后進行測試樣品的失重情況，其中FSM-10和FSM-3表現(xiàn)出最大的降解效率，分別為9%和8%；FSM-6和FSM-8次之為7%；FSM-5的最小為5%。2016年，Gajendiran等［28］從填埋場的土壤中篩選出一株具有降解PE潛力的真菌，基于18S rRNA分析分離的菌株被鑒定為棒狀曲霉并命名為Aspergillus clavatus JASK1。在培養(yǎng)90 d后觀察到PE-LD膜的失重率為35%。2018年，Ndahebwa等［15］從丹多拉垃圾場篩選出一些PE降解真菌，在以PE-LD為唯一碳源生長16周后通過FTIR分析顯示，由于碳氫化合物降解，出現(xiàn)了新的官能團?？傮w分析證實，真菌比細菌能更好地降解PE，真菌使PE-LD平均質(zhì)量損失了（36.4±5.53）%。實驗還通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度以尋找降解實驗的最佳條件。2020年，Zhang等［29］從蠟螟Galleria mellonella的腸道中分離到一株具有降解PE潛力的真菌，經(jīng)基因鑒定為黃曲霉并命名為黃曲霉PEDX3。在以PE-HD為唯一碳源培養(yǎng)28 d后的結(jié)果表明，PE-HD的分子量降低；FTIR分析證實了羰基和醚基的出現(xiàn)；最后通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）對潛在降解酶進行研究發(fā)現(xiàn)：2個漆酶樣多銅氧化酶（LMCOs）基因AFLA-006190和AFLA-053930在降解過程中表達上調(diào)，推測其可能作為關鍵酶參與到PE的降解過程中。

表2 參與PE塑料生物降解的真菌菌株Tab.2 Fungal strains involved in the biodegradation of polyethylene plastics

1.3 參與PE塑料微生物降解的放線菌菌株

據(jù)報道，現(xiàn)在篩選出的能夠降解PE的放線菌包括鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬和紅球菌屬3個菌屬［33-34］。Esperanza等［34］從蚯蚓腸道中分離出能夠降解PE的放線菌，實驗結(jié)果顯示，從蚯蚓腸道分離的放線菌群能夠在4周內(nèi)顯著減小低密度聚乙烯微塑料（PE-LD-MP）的大小，而且在放線菌以PE-LD-MP為唯一碳源的土壤中檢測出一些長鏈烷烴聚合物，其中包括十八烷、二十烷等，因為它們在含有PE-LD-MP的無菌土壤中未被檢測到，所以烷烴的形成可視為PE-LD-MP長碳鏈斷裂的產(chǎn)物。土壤中的放線菌資源豐富且放線菌與人類的關系極其密切，絕大數(shù)屬有益菌，其次級代謝產(chǎn)物作為藥物來源對人類的健康做出巨大貢獻。然而目前關于放線菌降解PE的文獻報道較少，筆者認為放線菌的篩選應該引起研究人員的關注，特別是關于放線菌降解PE過程中次級代謝產(chǎn)物的研究，推動廢舊PE資源化利用的發(fā)展。

綜上所述，目前的生物降解研究中大部分以純菌種為研究對象，但是微生物作為一個完整的生態(tài)系統(tǒng)是不會單獨作用于PE材料的。微生物之間是存在著各種關系的，包括互生、共生、寄生等，在土壤微生物中，互生關系就十分普遍［35］。雖然在Han等［36］的研究中發(fā)現(xiàn)，與單一菌種相比使用Arthrobacter sp.和Streptomyces sp.的混合菌群共同形成了更厚更復雜的生物膜，這也促進了更高的PE礦化率，但是對混合菌群提高降解率的協(xié)同機制沒有進行深入研究。筆者認為多菌種聯(lián)合降解中協(xié)同機制的研究有助于人們了解自然環(huán)境下各個菌種在PE生物降解過程中扮演的角色，以此建立“人工生態(tài)系統(tǒng)”對廢舊PE進行高效降解，為以后廢舊塑料生物降解的工廠化提供理論依據(jù)。而且在以后的研究中進行多菌種聯(lián)合降解及其協(xié)同機制的探究可以作為提高PE生物降解率的突破口之一。

隨著科學技術的發(fā)展，PE生物降解的研究重心從宏觀上物理化學的變化逐漸偏移到微觀上降解酶和降解機理的研究，尤其是高通量測序和代謝組學分析的利用在生物降解機理的研究中發(fā)揮了重要作用，在這段發(fā)展過程中研究者也發(fā)現(xiàn)PE生物降解的本質(zhì)是酶的降解，所以尋找PE生物降解過程中的關鍵酶及其基因調(diào)控機制的研究在未來的生物降解研究中是極為重要的。

2 PE降解的表征方法

根據(jù)文獻報道，目前研究者們通過對降解前后聚合物物理和化學性質(zhì)的變化來評價各降解菌的降解效率，這些物理和化學性質(zhì)的變化主要體現(xiàn)在7個方面：表面官能團、親水性/疏水性、結(jié)晶度、分子量、表面形貌、力學性能和質(zhì)量損失［8］。以下將對目前使用各種表征儀器所出現(xiàn)的問題進行分析。

2.1 FTIR

FTIR用于研究微生物降解導致的非生物和生物氧化后PE表面各種官能團的形成。PE表面的這些官能團被認為是重要的，因為氧化基團導致親水性增加，進而導致微生物有效附著在PE表面，從而促進生物降解［29］。

2.2 測量表面與水的接觸角

細菌產(chǎn)生的生物表面活性劑是生物降解實驗和PE降解的關鍵因素。生物表面活性劑分子的分泌降低了表面張力，使微生物易于附著在PE表面［9］，這是微生物降解PE的前提條件。PE表面張力的變化通常通過測量表面與水的接觸角來估算，與水的小接觸角表明降解后PE表面的高親水性。

2.3 SEM

SEM可以很直觀地向研究者展示降解菌對PE膜/顆粒表面的侵蝕情或者降解菌是否定殖在PE表面，但是要保證樣品在處理中保持無損狀態(tài)，處理后要保持清潔狀態(tài)，避免外界因素對樣品造成損傷影響實驗的真實性。

2.4 質(zhì)量損失

檢測生物降解能力最簡單的方法就是使用足夠靈敏的天平測量質(zhì)量損失。但是處理樣品的過程中會導致PE材料質(zhì)量的損失，尤其是PE顆粒在回收的過程中極其容易丟失，所以會造成較大的偏差。近年來，大部分研究者還以CO2生成量來計算生物降解所產(chǎn)生的失重，這也可以作為以后PE生物降解中不可或缺的表征手段之一。

還有一些研究者利用同位素示蹤法來跟蹤生物降解從開始到最終產(chǎn)物的生成即：CO2和微生物中的碳，以此更好地研究降解菌的降解機理和計算降解速率。還有通過測定降解過程中降解菌的濃度從而制作降解菌生長曲線，用來表示降解菌以PE材料為唯一碳源的生長情況，也可作為是否降解PE的依據(jù)。利用氣相和液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對PE生物降解后的代謝產(chǎn)物進行分析也可以作為一種表征手段。作者認為上述的表征技術對于PE的生物降解都是相互佐證的，研究中不能單獨以某一技術作為生物降解的證據(jù)，如CO2生成量的測定，在PE的生物降解過程中，首先降解菌分泌胞外酶將長鏈PE切割成各種不同的中間產(chǎn)物，而降解菌只能吸收一些能穿過細胞壁的小分子中間產(chǎn)物，所以單獨測定CO2的生成量是不嚴謹?shù)摹?/p>

3 PE微生物降解實驗流程的改進與補充

對PE微生物降解實驗流程進行如圖1所示改進與補充。

圖1 PE微生物降解實驗流程的改進與補充Fig.1 Improvement and supplement of polyethylene microbial degradation experimental process

（1）PE膜處理：現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)的PE塑料大部分有各種添加劑以便于達到各種用途，包括抗菌劑、抗氧化劑、增塑劑等［37］。這些添加劑都會干擾研究者對降解菌降解效果的判斷，這就是造成降解效率無法進行比較的首要問題。為避免這些問題出現(xiàn)，實驗中使用的PE膜應購買純PE膜或利用濕膜涂布器在實驗室制得的純PE膜。

（2）測定PE膜平均分子量、分子量分布和質(zhì)量：利用凝膠滲透色譜測定PE膜在被微生物降解前后的分子量分布和平均分子量的變化，可以判斷PE被微生物降解后，是否發(fā)生了長鏈的解聚［7］。這應該作為不可或缺的佐證來證明PE塑料降解之后的質(zhì)量損失或者產(chǎn)生的CO2是否是來自PE塑料高分子長鏈的解聚和降解［38］。這些工作必須在降解前后立即進行。

（3）培養(yǎng)基選擇：作為降解測試的培養(yǎng)基應提供菌種所需除碳源外的所有營養(yǎng)物質(zhì)，以確保PE膜提供唯一碳源，所以選擇無機鹽培養(yǎng)基便于以后的表征測試。

（4）降解后的表征測定：這些測定可以參照第二章內(nèi)容進行；此外還應采用X射線光電子能譜（XPS）檢測降解前后是否被引入了氧元素，氧元素的進入是降解開始的重要標志；由于在無機鹽培養(yǎng)基中測試菌種都是附著于PE膜片上的，所以采用紫外分光光度計測定菌種濃度以繪制降解菌的生長曲線是不準確的，可以在試驗一段時間后采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察沒經(jīng)過清洗的PE膜表面菌種定殖和生長情況。

4 結(jié)語

從微生物角度出發(fā)，目前研究者已經(jīng)從各種生態(tài)環(huán)境中篩選出大量的降解菌，但是大多數(shù)研究中菌株被單獨作用于PE材料，研究者們忽略了整個生態(tài)系統(tǒng)中的每個個體是相互關聯(lián)的，微生物間的生態(tài)相互作用在PE降解過程中也是非常重要的。在自然環(huán)境中，對于PE的生物降解菌群之間必然存在協(xié)同過程，未來研究中應該多留意降解菌之間的互生和共生關系，采用多菌種聯(lián)合降解的方式，以提高目前整體的降解水平。

從降解實驗過程出發(fā)，大量的降解菌被發(fā)現(xiàn)，但是由于研究者們對影響降解菌生物降解因素的忽略，如，在文獻報道中各種用于測試降解菌生物降解能力的PE材料被研究者使用，有時會導致篩選出只是利用PE材料中添加劑的假陽性降解表型的菌株。所以建議在做降解菌能力測試的時候采用一種簡單可靠的實驗流程，以便于各研究者對篩選出的降解菌在降解能力上進行比較。未來的研究中也可以真正了解到目前發(fā)現(xiàn)或者改性的降解菌整體的降解水平，為降解菌的高效性定義上提供了數(shù)據(jù)支持，對進一步推動降解能力水平的提高來說意義重大。

還有一點容易忽視的是，PE降解菌在降解之后的代謝產(chǎn)物是否對環(huán)境具有危害性，研究者從毒理學的角度分析生物降解后的代謝產(chǎn)物是極其重要的，目前的研究中這一問題還未得到研究者的重視，在以后的研究中還應將篩選出來的PE降解菌返還到土壤、水池等自然環(huán)境中，測試各種指標以檢測其對農(nóng)作物、魚類等有無危害。

在未來的研究中，還可以通過對已知降解菌的改性或者對實驗條件的優(yōu)化兩個方面來提高降解水平。一是改性，可以從分子水平研究降解機理，確定關鍵功能基因或者蛋白質(zhì)，再利用基因工程的相關技術構建高效的降解微生物；二是通過將實驗條件（pH、溫度、培養(yǎng)時間、多菌種聯(lián)合等）作為變量做正交實驗，探究微生物生物降解的最佳條件，以達到提高生物降解水平的目的。